全 文 ：南京农业大学学报 2012，35(3) :52－56
Journal of Nanjing Agricultural University http:/ /nauxb． njau． edu． cn
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收稿日期:2011－06－16
基金项目:国家自然科学基金项目(30670008，30800156，30970081)
作者简介:王永，硕士研究生。* 通讯作者:王志伟，教授，从事植物微生物学研究，E-mail:zwwang@ njau． edu． cn。
王永，纪燕玲，王晗，等．禾本科植物内生真菌研究 13:禾本科植物内生真菌的分离鉴定及基因组 DNA的快速提取［J］．南京农业大学学报，
2012，35(3) :52－56
禾本科植物内生真菌研究 13:禾本科植物内生真菌的
分离鉴定及基因组 DNA的快速提取
王永，纪燕玲，王晗，陈永敢，王志伟*
(南京农业大学生命科学学院，江苏 南京 210095)
摘要:调查我国 7 省 12 个不同地区的禾本科植物内生真菌，经分离、培养后鉴定得到 2 种 Epichlo属和 4 种 Neotyphodium属
内生真菌。采用改良的 QS(improved quick and safe，IQS)法进行禾本科植物内生真菌基因组 DNA的提取，并通过 PCR进行
验证。以生长在平板上的菌丝为起始材料，仪器要求简单、操作简便，快速安全、省时省力，整个提取过程大约 40 min。该
方法和常规 SDS法相比，时间缩短到 2 周，为原来的 1 /4。以 IQS 法提取的 DNA 为模板，检测禾本科植物内生真菌中的
NRPS基因，并在 NCBI上进行比对分析，发现与已有的 NRPS 基因高度相似。这种快速提取法所获得的基因组 DNA 质量
高，可用于后续 PCR、基因克隆及其他高通量测试，特别适合获取大量真菌菌株基因组 DNA时使用。
关键词:禾本科植物内生真菌;基因组 DNA的提取;NRPS基因;PCR扩增;序列比对
中图分类号:Q933 文献标志码:A 文章编号:1000－2030(2012)03－0052－05
Grass endophytic fungi researches 13:Endophytic fungi identification
and rapid extraction of genomic DNA
WANG Yong，JI Yan-ling，WANG Han，CHEN Yong-gan，WANG Zhi-wei*
(College of Life Sciences，Nanjing Agricultural University，Nanjing 210095，China)
Abstract:Endophytic fungi were surveyed in 12 different regions of 7 provinces in China，and 2 Epichlo species and 4 Neotyphodium
species were identified． In this study，we used improved method for genomic DNA extraction from slow-growing fungal endophytes and
validated it by PCR． The IQS(improved quick and safe)method was achieved by using plate-grown mycelia as the starting material．
This new method was in virtue of simple equipment，easy operation，rapid and safe extraction，and low cost． The whole extraction
process could be accomplished in 40 minutes． It took 2 weeks which was 1 /4 of SDS procedures． Then DNA was used as template to
detect the NRPS genes of the endophytes． The resulted sequences had a high sequence similarity with the NRPS gene． The quality of
DNA samples from this method could be used for subsequent PCR，cloning，and other high-throughput testing requirements，particu-
larly suitable for a large number of fungal strains．
Key words:grass endophytes;extraction of genomic DNA;NRPS gene;PCR amplification;alignment
禾本科植物内生真菌是生活于宿主植物体内的特异性真菌，一般在植物体内完成其生活史的部分或
全部，但不引起任何病症［1－2］。目前 Epichlo 属内生真菌有 12 个种，Neotyphodium 属内生真菌有 23 个
种［3－5］。我国地域广阔，禾本科植物资源丰富，从 2004 年至今，相继有多个新种被报道［3］。Epichlo 属和
Neotyphodium属的各个种与各自的宿主植物之间具有比较严格的宿主特异性［6］。由于内生真菌对宿主植
物具有强烈的生存依赖性，在离体培养条件下菌株的生长非常缓慢，这极大地限制了对其生物学特性的研
究。近年来，随着分子生物学技术的发展，内生真菌的研究进入了基因水平阶段。因此，如何能高效地获
得内生真菌的基因组 DNA成为当今的研究热点之一。
真菌 DNA的提取方法有很多，传统的真菌 DNA 提取方法来源于植物基因组 DNA 的提取［7］，包括以
新鲜的菌丝作为起始材料、机械破壁以及反复提纯等方法。但缺点在于准备新鲜的菌丝体量多，培养时间
长，占培养空间多，菌丝需冷冻处理以及不适合处理大量样品等。此外，蛋白酶 K、苯酚－氯仿等处理要求
样品多次转换，DNA溶液中残余的蛋白、溶剂等常常影响后续酶学反应［7］。目前关于植物内生真菌 DNA
第 3 期 王永，等:禾本科植物内生真菌研究 13:禾本科植物内生真菌的分离鉴定及基因组 DNA的快速提取
的提取方法主要是 SDS法［3］，其提取的 DNA质量能够满足一般分子生物学的需要。然而，菌丝体的大量
需求和较长提取时间，不利于菌株的快速研究。2009 年 Chi 等［8］报道了一种提取真菌 DNA 的快速安全
法(quick and safe method，QS) ，相对于以往真菌 DNA 的简便提取方法(例如，仅适用于进行 PCR 检测的
提取方法［9］、苯酚－氯仿抽提法［10］、利用昂贵的仪器和试剂提取法［11］等) ，该方法使得真菌 DNA的提取变
得快捷和高效。
本研究将 QS法［8］进行改良，成功地从 5 个属的禾本科植物内生真菌菌株中提取 DNA。通过 PCR的
方法进行非核糖体多肽合成酶(non-ribosomal peptide synthetase，NRPS)基因的扩增。最后，通过对 PCR产
物的测序和序列比对分析，确认 PCR产物的准确性，进而验证该提取方法的可行性。
1 材料与方法
1． 1 材料
供试的 20 株内生真菌菌株分别来自浙江、江苏、安徽、青海、湖南、河北、山东 7 省 12 个不同的地区。
宿主植物为鹅观草(Roegneria spp．)、拂子茅(Calamagrostis sp．)、雀麦(Bromus japonicus)、披碱草(Elymus
sp．)和短柄草(Brachypodium sylvaticum)等(表 1)。
表 1 本研究中所用的禾本科植物内生真菌菌株
Table 1 Strains of fungal endophytes used in this study
内生真菌
Endophyte
菌株
Strains
宿主植物
Host
采集地
Collection site
内生真菌
Endophyte
菌株
Strains
宿主植物
Host
采集地
Collection site
Neotyphodium sinicum Rwh0101a Roegneria sp． 安徽芜湖 Wuhu，Anhui E． yangzii Rnj5706b Roegneria sp． 江苏南京 Nanjing，Jiangsu
N． sinicum Rwh0102a Roegneria sp． 安徽芜湖 Wuhu，Anhui N． sinicum Rdy4302b Roegneria sp． 山东东营 Dongying，Shandong
Epichlo yangzii Rla0305a Roegneria sp． 安徽六安 Lu＇an，Anhui N． sinicum Rdy5503b Roegneria sp． 山东东营 Dongying，Shandong
E． yangzii Rhz0306a Roegneria sp． 浙江杭州 Hangzhou，Zhejiang N． sinicum Ryz5201b Roegneria sp． 江苏扬州 Yangzhou，Jiangsu
E． yangzii Rhf0301a Roegneria sp． 安徽合肥 Hefei，Anhui N． sinicum Rts2101b Roegneria sp． 河北唐山 Tangshan，Hebei
E． yangzii Rhf0302a Roegneria sp． 安徽合肥 Hefei，Anhui N． sinicum Rhs6855b Roegneria sp． 安徽黄山 Huangshan，Anhui
E． yangzii Rsz0303a Roegneria sp． 江苏苏州 Suzhou，Jiangsu N． sinicum Rjl7101b Roegneria sp． 东北吉林 Dongbei，Jilin
E． yangzii Rsz0304a Roegneria sp． 江苏苏州 Suzhou，Jiangsu Neotyphodium sp． Bhs6855b Bromus japonicus 安徽黄山 Huangshan，Anhui
E． yangzii Rnj0104a Roegneria sp． 江苏南京 Nanjing，Jiangsu Neotyphodium sp． Bhs6811b Bromus japonicus 安徽黄山 Huangshan，Anhui
E． sylvatica Brhs0301a Brachypodium sylvaticum 安徽黄山 Huangshan，Anhui Neotyphodium sp． Chs7804b Calamagrostis sp． 安徽黄山 Huangshan，Anhui
E． yangzii Rnj6102b Roegneria sp． 江苏南京 Nanjing，Jiangsu Neotyphodium sp． Chs8101b Calamagrostis sp． 安徽黄山 Huangshan，Anhui
E． yangzii Rcs4102b Roegneria sp． 湖南长沙 Changsha，Hunan Neotyphodium sp． Exn8104b Elymus sp． 青海西宁 Xining，Qinghai
注:a:2010 年本研究分离菌株;b:实验室保藏菌株。
Note:a:The study isolates in 2010;b:The laboratory preserved strains．
1． 2 禾本科植物内生真菌样品的采集、检测、分离、培养和保藏
采集不同地区的植物样品，将选定的植物整株采集，或从茎基部剪断，取其地上部分。植物地上部分
保存于 4 ℃冰箱中，整株样品移栽至盆钵活体保存。参照纪燕玲等［12］的方法从植物样品的茎秆或叶鞘进
行内生真菌的检测、分离、培养，并进行菌株的保藏［13］。在培养用于 DNA 提取的菌丝体时，需在 PDA 平
板培养基上平铺直径 25 mm、孔径 0． 22 μm的微孔滤膜，将微量的菌丝体接种到微孔滤膜进行培养。
1． 3 分离菌株的鉴定
根据宿主及形态学特征，对分离菌株进行鉴定［14］。将纯化的菌株在 PDA 培养基上 25 ℃培养 2 周
后，挑取菌落边缘菌丝，制作水浸片在光学显微镜下观察记录分生孢子及分生孢子梗的形态及大小，每株
菌测 20 个数据，取平均值。将纯化的菌株在 PDA培养基上 25 ℃培养 3 周后观察菌落形状、正反面的颜
色、质地、中央是否隆起等特征，并测量其菌落直径，记录生长速度，每株菌 5 个重复［13－14］。
1． 4 禾本科植物内生真菌基因组 DNA的提取
Chi等［8］的 QS法:收集10 ～20 mg的菌丝体于装有500 μL DNA提取液［15］(1 mol·L－1 KCl、100 mmol·L－1
Tris-HCl、10 mmol·L－1 EDTA，pH 8． 0)的 1． 5 mL的 EP 管中，利用电动研杵研磨 1 ～ 2 s，5 000 r·min－1离心
10 min;取上清液 400 μL，加 300 μL异丙醇混匀，12 000 r·min－1离心 10 min，弃上清液;70%乙醇 800 μL
漂洗后，37 ℃干燥 15 min，溶解于 50 μL ddH2O中。
本研究进行如下改良:刮取在平板上培养 2 周左右的新鲜菌丝体 20 ～ 30 mg，放入 2 mL的 EP 管(内
径 12 mm)中，加入 500 μL的 DNA提取液［15］，加 300 μm 的玻璃微珠(江油市明瑞反光材料科技有限公
司) ，用直径 8 mm 的玻璃棒以 50 ～ 60 r·min－1的速度手动搅拌和研磨菌丝体 3 ～ 5 min;65 ℃温育 5
min;7 000 r·min－1离心 10 min;取上清液 400 μL，加 300 μL异丙醇混匀，12 000 r·min－1离心 10 min，弃上
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南 京 农 业 大 学 学 报 第 35 卷
清液;70%乙醇 800 μL漂洗 2 次后，37 ℃干燥 15 min，溶解于 45 μL TE，用 1%琼脂糖凝胶电泳检测。
SDS法参照文献［3］，挑取平板上培养 2 周左右的菌丝体接种到 GY液体培养基中，摇床培养 30 d 后
进行基因组 DNA的提取。
1． 5 NRPS基因片段的扩增、检测和测序
在我国禾本科植物内生真菌中共发现了 14 种 NRPS 基因，本研究利用引物 NRPS2－R /NRPS2－F、
NRPS5－R /NRPS5－F和 NRPS8－R /NRPS8－F［16］对不同地区的 20 个内生真菌基因组 DNA进行 NRPS基因
扩增。PCR扩增反应体系为(25 μL) :10×反应缓冲液 2． 5 μL，2． 5 mmol·L－1 dNTP 4 μL，上下游引物(2
μmol·L－1)各 2 μL，模板(0． 1 ～ 1 μg)1 μL，Taq酶 0． 3 μL，最后用双蒸水定容到 25 μL。反应条件:94 ℃ 3
min;94 ℃ 45 s，56 ℃ 45 s，72 ℃ 75 s，共 35 个循环;72 ℃ 10 min。菌株 Rdy5503、Rhs6855、Rsz0304 的反
应产物直接委托上海英骏生物技术有限公司进行测序。
1． 6 NRPS基因的序列分析
将测序得到的 2 株 N． sinicum菌株 Rdy5503 和 Rhs6855 以及 1 株 E． yangzii菌株 Rsz0304 的 NRPS5 基
因序列，与本实验室利用 SDS法提取的 DNA为模板扩增的序列进行比对分析，并利用软件 DNAMAN分析
序列之间的差异性。再将所得序列在 NCBI 数据库进行 BLAST 比对，通过随机匹配的可能性的 E 值
(E value)大小及匹配一致性(Max ident)分析序列相似度。
2 结果与分析
2． 1 禾本科植物内生真菌的分离和鉴定
对经过检测含有内生真菌的禾本科植物进行分离，均得到细小的白色菌落。菌落正面白色，棉质，质
地紧密或疏松，边缘平整，中央隆起或平坦(图 1－A) ，背面棕色至褐色，从中央到周围颜色逐渐变浅(图 1－
B)。生长到后期菌落边缘逐渐变黄，菌落中央出现黄色的液滴。通过观察记录可以发现这些内生真菌的
体外培养生长速度非常缓慢，一般在最适温度下培养 3 周才能形成直径 10 ～ 20 mm的菌落。通过观察发
现，菌株菌落的形态和菌落的生长速度与宿主植物的种属或者宿主植物的地理位置没有明显的关系。
挑取培养 3 周的菌落边缘菌丝进行镜检，显微镜下可观察到大量的成熟的分生孢子(图 1－C，D)。分
生孢子椭圆形或肾形，单个顶生，分生孢子及孢子梗无色透明，孢子梗顶端变尖，基部无隔膜(图 1－E)。
通过分生孢子和分生孢子梗大小的比较，以及宿主植物上有无子座的形成，将分离的 10 株内生真菌菌株
分别鉴定为 Epichlo yangzii、E． sylvatica和 Neotyphodium sinicum(表 1)。
图 1 E． yangzii菌株 Rhf0302 的菌落和无性结构
Fig． 1 Colony and asexual structures of E． yangzii Rhf0302
A，B．菌落的正面和背面;C，D．分生孢子;E．分生孢子梗
A，B． Obverse and reverse of colony;C，D． Conidia;E． Phialide
2． 2 禾本科植物内生真菌基因组 DNA的提取和检测
分别利用 IQS 法和 SDS 法提取内生真菌的基因组 DNA。利用 IQS 法进行基因组 DNA 的提取时，整
个提取过程不到 40 min，1 个样品所用菌丝体 10 ～ 30 mg，获得约 45 μL高质量 DNA样品，可用于约 30 次
PCR反应。利用 SDS法也获得了高质量 DNA，但整个提取过程耗时 200 ～ 240 min。
对用 IQS法所得基因组 DNA进行电泳检测，均获得清晰明亮的条带。通过分子质量标记的比较，推
测所获得的 DNA片段的平均大小为 9 ～ 23 kb(图 2)。从条带的明亮程度可以看出，利用 IQS法提取的各
菌株 DNA之间在浓度上有所差异，各条带明亮程度不同，但杂质很少，能满足 PCR扩增所用。
选取 3 个菌株(Rnj6102、Rnj0104、Rcs4102)分别用 SDS 法和 IQS 法提取基因组 DNA，并以此为模板
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第 3 期 王永，等:禾本科植物内生真菌研究 13:禾本科植物内生真菌的分离鉴定及基因组 DNA的快速提取
进行 NRPS5 基因的 PCR扩增。发现所有 DNA模板均能扩增出明亮的目的条带(图 3) ，且条带 4 ～ 6(IQS
法)相对于条带 1 ～ 3(SDS法)更加明亮，说明用 IQS法提取的 DNA更适用于 PCR的扩增。
图 2 IQS法提取的各菌株的基因组 DNA
Fig． 2 Genomic DNA of fungal isolates extracted by
the IQS(improved quick and safe)method
M． Marker;1． Rcs4102;2． Rnj0104;3． Rnj6102;4． Rwh0102;
5． Rdy5503;6． Rhs6855;7． Rsz0304;8． Rhf0302;9． Rsz0303
图 3 2 种不同 DNA模板扩增到的 NRPS5 基因
Fig． 3 Amplified NRPS5 sequence modified from
two different DNA templates
1 ～ 3． SDS法提取 DNA的扩增 Amplification of DNA extracted
by SDS method;4 ～ 6． IQS 法提取 DNA 的扩增 Amplification of
DNA extracted by IQS method
M． Marker;1，4． Rnj6102;2，5． Rnj0104;3，6． Rcs4102
2． 3 禾本科植物内生真菌 NRPS基因序列比对分析
对 20 株不同内生真菌菌株进行 PCR扩增，发现用扩增 NRPS2、NRPS5 和 NRPS8 基因的引物时，分别
获得 145、200 和 250 bp的条带。经测序和序列分析，这些条带都被证明是相应的 NRPS 基因。将测得的
3 个菌株 Rdy5503、Rhs6855、Rsz0304 的 NRPS5 序列与实验室保存的菌株 Rdy4302、Rjl7101、Rnj5706 和
Rnj6102 的基因序列进行比对分析。其中来自黄山的菌株 Rhs6855 和南京的菌株 Rnj6102 仅在第 149 碱
基处有碱基差别;来自于东营的菌株 Rdy5503 和 Rdy4302 在第 25 和 147 碱基处有 2 个碱基差别;来自于
南京的菌株 Rnj6102 和 Rnj5706 则有 7 个碱基的差别。综上所述，现有测序菌株中 NRPS5 基因仅有 9 个
碱基数的差异，约占序列总长度的 4． 6%(图 4)。这些表明 NRPS基因与菌株的地域分布没有特别明显的
相关性。
图 4 不同地域鹅观草中内生真菌间的 NRPS5 序列比对
Fig． 4 Alignment of NRPS5 sequence of endophytes isolated from Roegneria in different regions
将 Rdy5503、Rhs6855、Rsz0304 菌株的序列在 NCBI 数据库进行 BLAST 比对，发现菌株 Rdy5503 的
NRPS5 基因序列(JF807059)与国外菌株 N． lolii 和 Neotyphodium sp．的 NRPS 基因匹配，E 值分别为 1E－76
和 4E－66，接近零，匹配率很高。再比较匹配一致性(Max ident) ，匹配上的碱基数分别占总序列长的 93%
和 90%。因此，可以判断所获得的基因序列确实为 NRPS基因。
3 讨论
在我国 7 省 12 个不同地区采集了 5 个属的禾本科植物，几乎在每个地区植株样品中都能分离到部分
内生真菌，说明内生真菌的分布范围非常广泛，没有明显的地域限制，这可能和内生真菌与宿主之间形成
的共生体有关。但由于内生真菌生长非常缓慢［10］，这极大地限制了对其生物学特性的研究。
从真菌组织中提取基因组 DNA的方法有很多，主要包括 CTAB法［17］、SDS法［3］和酶解法［18］等。其区
别主要在于不同的破壁方法以及破壁后分离核酸、蛋白质的方法，但均包括真菌细胞壁的裂解、真菌细胞
膜的破坏、DNA的释放以及纯化等步骤。这些传统的破壁方法包括机械破壁、超声波破壁、玻璃珠破壁。
核酸分离方法包括酚、氯仿抽提，纯化柱或滤膜分离。蛋白质的去除则多数通过氯仿 /异戊醇、蛋白酶和利
用盐析法进行。本研究利用 IQS法提取禾本科植物内生真菌基因组 DNA，以此 DNA 为模板，利用特异性
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南 京 农 业 大 学 学 报 第 35 卷
引物(NRPS5－R /NRPS5－F)对我国不同地区的鹅观草中 NRPS 基因进行 PCR 扩增，再利用 DNAMAN 软
件对测序结果和实验室已有的序列进行比对分析，发现 7 个菌株序列之间相似度很高，仅仅只有 9 个碱基
的差别。因此，通过以上分子试验及软件分析结果表明，利用 IQS法提取的 DNA是完全适用于后续 PCR、
分子克隆等试验的。
传统意义上的 DNA提取由许多步骤组成，包括准备材料、获得细胞裂解物、去除杂质和收集 DNA。
这些方法都是起源于植株组织 DNA 的提取。要求新鲜的菌丝体粉末为起始材料;蛋白酶 K 和去污剂降
解细胞裂解物;利用苯酚、氯仿和乙醇去除蛋白质等剩余物。但其缺点是培养菌体时间长、提取过程繁琐
等［19］。QS法是一种快速、安全和廉价的真菌 DNA提取方法。本研究改良了 QS法的部分操作，利用比较
大的玻璃棒，加细微的玻璃珠进行搅拌，提高菌丝体破碎的效率，达到改善提取效果的目的。不加玻璃珠
时，将搅拌时间加长也可取得类似的效果。本研究在菌丝体破碎后增加了 65 ℃温育 5 min 的步骤，这项
操作有效地增加了 DNA的最终收获量，对提取成功有着明显的促进作用。本研究以生长在平板上的新鲜
菌丝为试验材料，提取过程仅需要约 40 min，不仅使禾本科植物内生真菌基因组 DNA 的提取更加省时省
力，简单的真菌破壁工具和高效的 DNA提取过程也使试验成本明显降低。
该提取方法有以下几个优点:1)IQS法以生长在平板上的菌丝为试验材料，提高了时间和空间的利用
效率;2)在固体培养基上菌丝体可在 4 ℃下保存 2 个月而不被降解，且仅需要一点菌丝块即可，所以培养
起来非常方便;3)DNA提取缓冲液包括 1 mol·L－1 KCl，主要对细胞裂解液中的污染物进行盐析，这些细胞
裂解液可直接用于 PCR反应，且 DNA在 1 mol·L－1 KCl 中溶解度增加，而蛋白质的溶解度则降低从而沉
淀，这种方法降低了添加有害物的潜在风险和额外花费，为 DNA的提取提供了更好的空间利用率和便捷
性。但是，IQS法对于其他真菌类群的 DNA提取是否有效，还需要进一步试验。
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责任编辑:沈 波 刘怡辰
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