全 文 ：·研究报告·
生物技术通报
B IO TECHNOLOGY　BULL ETIN 2009年第 7期
高盐沉淀 CTAB法提取温室菊花基因组 DNA
马月萍 1 　戴思兰 2
(1 东北大学理学院生物技术研究所 ,沈阳 110004; 2 北京林业大学园林学院 ,北京 100083)
　　摘 　要 : 　根据温室菊花植物组织富含多酚、多糖的具体特性 , 对 CTAB法加以改进 :在待沉淀液中加入 1 /2体积 5 mol
·L - 1 NaCl。改进后的方法获得的 DNA质量良好 ,电泳条带清晰 ,提取过程无明显的 DNA 降解 ,基本上排除了多酚物质的
干扰。以提取的 DNA为模板 ,用一对引物扩增菊花中 18S基因 ,得到条带单一 ,大小与已知一致 ,说明获得的 DNA可以进
行 PCR扩增 , EcoR I酶切基因组 DNA图谱表明 ,提取的 DNA能被限制性内切酶完全酶切 ,可以满足相关的分子生物学
研究。
关键词 : 　菊花 　基因组 DNA的提取 　高盐沉淀 CTAB法
Genom ic DNA Extraction from Chrysan them um
Using High Salt CTAB M ethod
Ma Yuep ing1 　Dai Silan2
(1 College of Sciences, N ortheastern University, Shenyang 110004;
2 College of Landscape A rchitecture, B eijing Forestry University, B eijing 100083)
　　Abs trac t: 　Based on CTAB method, some p rotocal was modified according to the physiological characteristics of high containing
contents of polyphenolics and polysaccharides in Chrysanthem um 1Adding 50% volume of 5 mol·L - 1 NaCl into the solution which p re2
cip itating1 H igh quality genom ic DNA can be extracted from Chrysan them um using the imp roved method1The DNA was p referable e2
nough to be used as PCR temp late and digested by restriction enzyme comp letely and other studies of molecular biology1
Key wo rds: 　Chrysanthem um 　Genom ic DNA extraction　H igh salt CTAB DNA method
收稿日期 : 2009203219
基金项目 :国家自然科学基金项目 (30800885, 30871726)
作者简介 :马月萍 (19732) ,女 ,博士 ,从事菊花分子生物学研究 ; E2mail: myp luna@ sina1com
通讯作者 :戴思兰 , 教授 ,博士生导师 ; E2mail: silandai@gmail. com　　菊花 (D endran them a m orifolium )是我国传统名花和世界四大切花之一 ,具有观赏、食用以及药用等多种经济价值。随着现代生物技术在观赏植物中的应用 , 对菊花的研究已经进入了分子生物学层面 [ 1～5 ]。菊花是高度杂合的异源多倍体 ,遗传背景复杂 ,加强基础性研究工作 ,拓展生物学研究深度与广度 ,如构建遗传图谱、基因文库、重要性状相关基因定位和分子克隆等 ,将对栽培菊花品种改良及优良新品种选育具有实际意义 [ 6 ]。这些研究都是以获得高质量的 DNA为前提的 ,良好的提取方法应该是操作简单快捷、成本低廉 ,获得的 DNA长度完整、数量充足、纯度高。近年来 ,随着分子生物学技术的不断发展 , DNA 提取方法不断完善 ,对菊花 DNA提取的方法 ,国内外研究也进行了富有成效的探索性工作。但温室里生长的菊花通常都含有较高的多糖、多酚及其他次生代谢物 ,基因组也较大 ,加大了 DNA提取的难度。常规提取方法很难得到符合分子生物学研究的菊花基因组 DNA。戴思兰等 [ 7 ]、蒋细旺等 [ 8 ]通过对 SDS法加以改进 ,获得了符合试验要求的 DNA。但是SDS法对于含糖类丰富的植物来说 ,提取的 DNA常常难以达到实验的要求。CTAB法是目前应用最广泛发展较成熟的方法 ,最大优点就是除去多糖。以3个菊花品种和 1个菊花近缘野生种为材料 ,针对其具体特点 ,在 CTAB法的基础上进行适当的改良 ,获得了高质量的 DNA分子。
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2009年第 7期 马月萍等 :高盐沉淀 CTAB法提取温室菊花基因组 DNA
1　材料和方法
111　植物材料
菊花品种 ( Ch rysan them um ×m orifolium R a2
m at. ) :‘金龙爪 ’、‘Doing Time’、‘Vulcan Time’,菊
花脑 ( Ch rysan them um nank ingense Hand. m azz. ) ,引
自北京林业大学菊花育种课题组 ,种植于东北大学
花苑。
112　试验方法
11211　基因组 DNA的提取 　参照 Doyle[ 9 ]基因组
DNA提取方法并加以改良。取 016 g菊花幼叶 (或
老叶 ) ,加入 20% PVP,于液氮中研磨后 ,转入经
65℃预热的 700 μl 2 ×CTAB 提取缓冲液 ( 2%
CTAB, 100 mol·L - 1 Tris2HCl pH810, 20 mol·L - 1
EDTA, 114 mol·L - 1 NaCl)中 ,加 2% (幼叶 )或 5%
(老叶 )β2巯基乙醇 ,在 65℃水浴中充分混匀后 ,室
温放置 10 m in;加 700μl氯仿 :异戊醇 (24∶1) ,充分
混匀 ; 10 000 r/m in离心 10 m in;将上清液转到一支
新离心管中 ,加入 1 /2体积的 5 mol·L - 1 NaCl,混
匀 ;再加 2 /3体积的异丙醇 ,混匀 , - 20℃静置 10
m in; 10 000 r/m in离心 10 m in。DNA沉淀经 500 m l
70%乙醇清洗两次 , 37℃干燥 30 m in;加适量 TE缓
冲液溶解沉淀 ,再加入 016μl 10 mg/m l RNA 酶 ,
37℃保温 30 m in。等体积氯仿 /异戊醇 ( 24∶1)抽提
一次 , 10 000 r/m in室温离心 5 m in,上清中加入 1 /
10体积的 3 mol·L - 1 NaAc (终浓度 011 mol·L - 1 )
和两倍体积的无水乙醇 ,混匀 , - 20℃放置 15 m in
后 , 10 000 r/m in离心 5 m in,收集沉淀 DNA。70%
乙醇 ( - 20℃)洗涤 2次 (10 000 r/m in, 5 m in) , 37℃
保温箱中干燥后 ,溶于 20μl TE buffer中。 - 20℃
保存备用。
11212　DNA质量的检测 　将 DNA用 TE稀释一定
倍数后用紫外分光光度计测定 OD260和 OD280值 ,检
测所提 DNA的纯度和浓度。同时用 018%的琼脂
糖凝胶电泳 ,置于紫外分光光度仪 ( up land, USA )拍
照。检测提取 DNA的完整性。
11213　PCR扩增检测 　以所提的 DNA为模板 ,根
据菊花 18S组成型表达基因设计一对引物。上游序
列 : 5′2TCGAACCCTGCAAAGCAG23′; 下游序列 : 5′2
GTCGAAGCGTCAAGAG23′,在 TC2512型 PCR 扩增
仪中进行扩增反应。20μl反应体系 : 2μl 10 ×PCR
buffer、015μl dNTP、015μl引物 (上游 )、015μl引
物 (下游 )、2μl DNA模版、015μl Taq DNA聚合酶。
反应程序 : 95℃预变性 5 m in后 ,按 94℃ 30 s、
55℃ 45 s、72℃ 50 s,程序循环 30次 ,最后 72℃延伸
7 m in, 4℃保存。扩增产物用 018 %的琼脂糖凝胶
电泳 ,检测模板的扩增效果。
11214　酶切检测 　取约 1μg DNA进行限制性内
切酶酶切 ,酶切体系 20μl: 2μl 10 ×EcoR I buffer、1
μl EcoR I, 37℃恒温静置 2 h后 ,用 018 %的琼脂糖
凝胶电泳检测。
2　结果与分析
211　提取的 DNA纯度和完整性分析
DNA 在紫外区有强吸收 ,最大吸收波长为 260
nm,而蛋白质在 280 nm 处有强吸收。若 DNA中含
有蛋白质 ,则 A260 /A280小于 116;若含有 RNA,则
A260 /A280大于 210。纯的 DNA 溶液 A260 /A280为 118
左右。利用高盐沉淀 CTAB法提取的几种菊花基因
组 DNA的 A260 /A280较为理想 (表 1 ) :幼嫩小叶在
1177～1185之间 ,上端大叶的纯度在 1174～1180
之间。说明所提的 DNA纯度较高 ,蛋白质、酚类及
多糖类杂质去除较完全。
表 1　4种菊花基因组 D NA的质量与产量
试验方法 取材部位 试验材料 品种 A260 A280 A260 /A280 DNA产量 (μg1g - 1 )
高盐沉淀法
金龙爪 大菊 01247 01138 11790 3711
幼嫩小叶 Vu 小菊 01238 01132 11803 3517
Do 小菊 01250 01141 11773 3715
菊花脑 野生 01244 01133 11835 4119
上端大叶 金龙爪 大菊 01168 01096 11750 2512
Vu 小菊 01143 01082 11743 2115
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生物技术通报 B iotechnology　B u lle tin 2009年第 7期
　　018%的琼脂糖凝胶电泳表明 (图 1) ,所提取的
植物基因组 DNA均在 21 kb以上 ,呈较整齐的一条
线 ,没有降解和弥散现象 ,符合分子生物学实验的
要求。
11‘金龙爪’; 21‘Vu’; 31‘Do’; 41菊花脑 ;
51λ/H ind III + EcoR I双切 Marker
图 1　4种菊花基因组 D NA电泳图
212　PCR扩增检测结果
以所提的基因组 DNA为模板 , PCR扩增菊花中
18S基因 (图 2) ,条带单一 ,大小与已知基因的长度
一致 ,说明提取的 DNA 可以成功用于 PCR 扩增
分析。
11DL2000; 21‘金龙爪’; 31‘Vu’; 41‘Do’; 51菊花脑
图 2　4种菊花 D NA PCR扩增 18S rD NA电泳图
213　酶切检测结果
图 3表明 ,用高盐 CTAB法提取的菊花幼叶都
能完全被 EcoR I酶切 ,说明高盐沉淀 CTAB法提取
的 DNA纯度高 ,适合于分子生物学的下游操作。
11双切 Marker; 21‘金龙爪’; 31‘Vu’; 41‘Do’; 51菊花脑
图 3　EcoR I酶切 4种菊花基因组 D NA电泳图
3　讨论
高质量的 DNA是进行分子生物学操作的前提。
本研究在常规 CTAB方法的基础上 ,根据温室菊花
植物组织富含多酚、单宁、多糖等的具体特性 ,对现
有的 DNA 提取方法进行了改进 :通过补加水溶性
PVP,提高提取液中β2巯基乙醇等方法有效去除酚
类物质 ,与戴思兰 [ 7 ]和蒋细旺等 [ 8 ]结论一致。他们
均用高浓度的 KAc去除多糖类物质。本研究在沉
淀液中加入高浓度的 NaCl,多糖去处效果良好 ,并
且不经后续纯化步骤的 DNA也能进行相关的分子
生物学研究 , 说明高盐沉淀 CTAB法对于提取含有
大量次生代谢产物的物种的 DNA来说 ,是个较为理
想的方法。
不同的物种、同一物种的不同部位 ,由于化学组
分不同 ,即使使用相同方法 ,也常常得到不同的结
果 [ 10, 11 ]。本研究中 ,野生型的菊花脑的产率、纯度
较栽培菊花高 ,可能是由于野生型的菊花脑在野外
生长 ,长期进化的过程中仍然保持原遗传基因 ,突变
较少 ,而人工驯化的菊花所生长环境的营养成分丰
富 ,在遗传上进化较多 ,积累的次生代谢产物也多。
对于多糖、多酚、单宁、脂质等次生代谢产物含
量较高的植物 ,提取基因组 DNA时通常适当添加一
些抗氧化剂保护 DNA 免受醌类物质、二硫化物、多
酚氧化酶等物质的损害。本研究发现 Vc争夺氧的
能力远强于β2Me,但在 65℃水浴时抗氧化的耐力
却不如β2Me。针对菊花酚类化合物含量较高 ,研磨
过程中添加适量 PVP和β2巯基乙醇得到的 DNA溶
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2009年第 7期 马月萍等 :高盐沉淀 CTAB法提取温室菊花基因组 DNA
液均无色或略带黄色。而对于多酚含量不高的植
物 ,可用维生素 C替代β2Me。
参 考 文 献
1　 Ma YP, Fang XH, Chen F, et al1 Plant Cell Rep, 2008, 27 ( 4) :
647～6541
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3　 W ang W K, Dai SL, L i MX1 Cellular & Molecular B iology Letters,
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(上接第 85页 )
致谢 :本研究部分工作在贵州大学贵州省农业生物工程
重点实验室完成 ,在此表示感谢。
参 考 文 献
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2　王志德 ,牟建民 ,等 1中国烟草学报 , 2003, (4) : 20～251
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4　郭生云 ,何川生 ,等 1海南师范学院学报 , 2001, (2) : 10～131
5　何川生 ,何兴金 ,等 1植物学报 , 2001, 6: 610～6141
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中国典型半荒漠与荒漠区啮齿动物研究
武晓东 　付和平 　杨泽龙 　著
97827203202328029　　  88. 00　　　　　2009年 6月出版
本书对我国典型半荒漠与荒漠生态系统中啮齿动物分类、啮齿动物地理分布、啮齿动物种群、群落及其在不同干扰和尺
度下的生态学、啮齿动物的危害与防治理论进行了系统的研究。研究方法方面 ,在传统的动物分类学、动物地理学和动物种
群和群落生态学的基础上 ,融合了景观生态学、恢复生态学、干扰生态学、保护生物学、遥感和地理信息系统等多个新兴学科
门类的基本原理和方法 ,着重强调在大尺度下对生态科学问题的综合思考。分析方法方面 ,既有传统线性方法 ,也应用了分
形分析、小波分析等非线性方法。
本书可供从事草业科学、动物生态学、野生动物管理学、保护生物学、植物保护学等专业领域的研究、教学、生产部门的科
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