全 文 ：第 ３９卷　 第 １期
２０１５年 １月
南京林业大学学报 （自然科学版 ）
Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｎａｎｊｉｎｇ Ｆｏｒｅｓｔｒｙ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ （Ｎａｔｕｒａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｅｄｉｔｉｏｎ）
Ｖｏｌ．３９， Ｎｏ．１
Ｊａｎ．， ２０１５
ｄｏｉ：１０．３９６９ ／ ｊ．ｉｓｓｎ．１０００－２００６．２０１５．０１．０２６
　 收稿日期：２０１４－０１－１３　 　 　 　 修回日期：２０１４－０７－０５
　 基金项目：“十二五”国家科技支撑计划（２０１２ＢＡＤ０１Ｂ０２０２）；国家林业公益性行业科研专项项目（２０１１０４０１０）；江苏高校优势学科建
设工程资助项目（ＰＡＰＤ）；南方现代林业协同创新中心科研项目
　 第一作者：季孔庶，教授。 Ｅ⁃ｍａｉｌ： ｋｓｊｉ＠ ｎｊｆｕ．ｅｄｕ．ｃｎ。
　 引文格式：季孔庶，王潘潘，王金铃，等． 松科树种的离体培养研究进展［Ｊ］ ． 南京林业大学学报：自然科学版，２０１５，３９（１）：１４２－１４８．
松科树种的离体培养研究进展
季孔庶，王潘潘，王金铃，阮倩倩，潘　 婷，朱沛煌，郭天玮，刘　 靖
（南京林业大学，林木遗传与生物技术省部共建教育部重点实验室，江苏　 南京　 ２１００３７）
摘要：松科树种的离体培养技术相关研究从 ２０世纪 ７０ 年代开始至今一直备受关注，并取得了不断的突破。 笔
者综述了松科树种离体培养的研究进展，对松科树种在直接器官发生、间接器官发生、体细胞胚胎发生、原生质
体培养等不同离体培养方式所取得的研究结果进行了总结，并介绍了外植体、培养基、激素等影响离体培养的因
素和条件，对松科树种离体培养中有待进一步开展的机理性研究、成年母树营养器官离体培养技术、褐化问题、
诱导生根和再生植株移栽技术、商业化生产应用、离体材料的超低温保存研究等方面进行了展望。
关键词：松科树种；离体培养；器官发生；体胚发生；原生质体培养；超低温保存
中图分类号：Ｓ７２２；Ｑ９４８　 　 　 　 　 　 　 文献标志码：Ａ 文章编号：１０００－２００６（２０１５）０１－０１４２－０７
Ｒｅｖｉｅｗ ｏｎ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ ｔｒｅｅ ｓｐｅｃｉｅｓ ｉｎ Ｐｉｎａｃｅａｅ
ＪＩ Ｋｏｎｇｓｈｕ， ＷＡＮＧ Ｐａｎｐａｎ， ＷＡＮＧ Ｊｉｎｌｉｎｇ，ＲＵＡＮ Ｑｉａｎｑｉａｎ， ＰＡＮ Ｔｉｎｇ，
ＺＨＵ Ｐｅｉｈｕａｎｇ， ＧＵＯ Ｔｉａｎｗｅｉ， ＬＩＵ Ｊｉｎｇ
（Ｋｅｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ Ｆｏｒｅｓｔ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｍｉｎｉｓｔｒｙ ｏｆ Ｄｅｕｃａｔｉｏｎ，
Ｎａｎｊｉｎｇ Ｆｏｒｅｓｔｒｙ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， Ｎａｎｊｉｎｇ ２１００３７， Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｃｕｌｔｕｒｅ ｐｌａｙ ａｎ ｉｍｐｏｒｔａｎｔ ｒｏｌｅ ｉｎ ｒａｐｉｄ ｐｒｏｐａｇａｔｉｏｎ ｏｆ ｉｍｐｒｏｖｉｎｇ ｔｒｅｅｓ， ｔｒｅｅ ｇｅｒｍｐｌａｓｍ ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ ｃｏｎ⁃
ｓｅｒｖａｔｉｏｎ， ｆｏｒｅｓｔ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｒｅｅｄｉｎｇ ａｎｄ ｓｏｍｅ ｂａｓｉｃ ｒｅｓｅａｒｃｈｅｓ． Ｍｕｃｈ ａｔｔｅｎｔｉｏｎ ｈａｓ ｂｅｅｎ ｐａｉｄ ｏｎ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ ｔｒｅｅ
ｓｐｅｃｉｅｓ ｉｎ Ｐｉｎａｃｅａｅ ｓｉｎｃｅ １９７０ｓ． Ｉｎ ｔｈｉｓ ｐａｐｅｒ， ｐｒｏｇｒｅｓｓ ｏｎ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ ｔｒｅｅ ｓｐｅｃｉｅｓ ｉｎ Ｐｉｎａｃｅａｅ ｗｅｒｅ ｒｅｖｉｅｗｅｄ，
ｒｅｓｕｌｔｓ ａｃｈｉｅｖｅｄ ｉｎ ｆｏｕｒ ｗａｙｓ ｆｏｒ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ ｔｒｅｅ ｓｐｅｃｉｅｓ ｉｎ Ｐｉｎａｃｅａｅ， ｓｕｃｈ ａｓ ｄｉｒｅｃｔ ｏｒｇａｎｏｇｅｎｅｓｉｓ， ｉｎｄｉｒｅｃｔ ｏｒｇａ⁃
ｎｏｇｅｎｅｓｉｓ， ｓｏｍａｔｉｃ ｅｍｂｒｙｏｇｅｎｅｓｉｓ ａｎｄ ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔ ｃｕｌｔｕｒｅ， ｗｅｒｅ ｍａｉｎｌｙ ｓｕｍｍａｒｉｚｅｄ． Ｆａｃｔｏｒｓ ｉｎｆｌｕｅｎｃｅｄ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｃｕｌｔｕｒｅ
ｓｕｃｈ ａｓ ｅｘｐｌａｎｔ， ｍｅｄｉｕｍ ｔｙｐｅ， ｈｏｒｍｏｎｅ， ｅｔｃ． ｗｅｒｅ ｄｉｓｃｕｓｓｅｄ． Ｐｒｏｂｌｅｍｓ ｔｏ ｂｅ ｆｕｒｔｈｅｒ ｒｅｓｏｌｖｅｄ ｏｆ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｎ ｔｒｅｅ
ｓｐｅｃｉｅｓ ｏｆ Ｐｉｎａｃｅａｅ，ｓｕｃｈ ａｓ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｓｔｕｄｙ， ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｎ ｍａｔｕｒｅ ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｏｒｔｅｔ ｔｒｅｅｓ， ｂｒｏｗｎｉｎｇ， ｒｏｏｔ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ，
ｐｌａｎｔｌｅｔ ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ ａｎｄ ｃｏｍｍｅｒｃｉａｌ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ， ａｎｄ ｃｒｙｏｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎ ｏｆ ｇｅｒｍｐｌａｓｍ， ｗｅｒｅ ｐｒｏｐｏｓｅｄ．
Ｋｅｙｗｏｒｄｓ： Ｐｉｎａｃｅａｅ； ｉｓｏｌａｔｅｄ ｃｕｌｔｕｒｅ； ｏｒｇａｎｏｇｅｎｅｓｉｓ； ｓｏｍａｔｉｃ ｅｍｂｒｙｏｇｅｎｅｓｉｓ； ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔ ｃｕｌｔｕｒｅ； ｕｌｔｒａ⁃ｌｏｗ
ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ｓｔｏｒａｇｅ
　 　 松科（Ｐｉｎａｃｅａｅ）是裸子植物中最大的科，有 １０
属 ２３０ 种，主产北半球。 松科树种（简称松树）种
数多、干形通直、木材优良，既是重要的实木用材树
种，也是优良的纸浆材树种。 有些可供采脂、提炼
松节油等多种化学原料，有的种子可食或供药用，
有些可作园林绿化树种［１］。 由于多数松树以常规
方法无性繁殖困难，良种以实生繁殖为主，难以在
遗传改良过程中获得最大遗传增益，同时也无法达
到生产所需种苗的一致性要求。 通过离体培养技
术实现快速繁殖，不仅可推进优良苗木大规模高效
繁殖和商业化生产，实现松树良种品种化应用的捷
径，并可为松树改良过程中的分子育种搭建平台，
同时为其种质资源的中长期保存提供帮助。
１９３４年，Ｇａｕｔｈｅｒｅ以海岸松（Ｐｉｎｕｓ ｐｉｎａｓｔｅｒ）和
欧洲冷杉（Ａｂｉｅｓ ａｌｂａ）形成层为外植体开始了松树
离体培养的研究，并获得了愈伤组织。 １９７４ 年
Ｓｏｍｍｅｒ 等首次获得火炬松 （ Ｐ． ｔａｅｄａ） 试管苗；
Ｓｏｍｍｅｒ于 １９７５年以长叶松（Ｐ．ｐａｌｕｓｔｒｉｓ）成熟合子
胚为外植体，经直接器官发生获得再生植株；１９８５
年 Ｈａｋｍａｎ等在挪威云杉（Ｐｉｃｅａ ａｂｉｅｓ）的未成熟合
　 第 １期 季孔庶，等：松科树种的离体培养研究进展
子胚培养中，首次获得了松树的体细胞胚胎再生植
株［２］。 随后，松树的离体培养植株再生研究取得
了不断突破。 １９８７年 Ｇｕｐｔａ 等［３］首次以火炬松未
成熟合子胚为外植体，采用改良 ＭＳ 培养基获得体
细胞胚和再生植株。 到 ２０世纪 ８０年代中期之后，
随着林业生物技术研究的热潮涌起以及林业生产
对优质种苗的需求日益增长，松树的离体培养与植
株再生研究成了热点。 据初步统计，至今已涉及超
过百种（变种）松树的离体培养研究，并发现松科
多数树种的离体培养存在着一定技术难度。 为了
突破技术难关，开始着手离体培养相关基因的调控
研究［４－５］，试图从根本上解决松树离体培养和植株
再生的相关技术环节。
对目前已开展的松科 ５２ 种（包括 １ 个杂交
种）树种离体培养的研究统计［２－３，６－５６］发现，选择未
成熟胚、成熟胚、嫩茎、休眠芽、子叶、针叶、茎尖、大
配子体、不定芽、叶原基、下胚轴等 １０ 多种器官
（组织）为外植体，有 ３０ 多种的材料经诱导获得不
定芽或再生植株，２０ 多种的材料经诱导得到愈伤
组织或体胚发生。 松科中除雪松属（Ｃｅｄｒｕｓ）和油
杉属（Ｋｅｔｅｌｅｅｒｉａ）树种未发现有离体培养报道外，其
他 ８属树种均有相关报道。
１　 松科树种离体培养方式
松树的离体培养与多数植物的离体培养类似，
主要有直接器官发生、间接器官发生及体胚发生 ３
种形态重建方式。 据较早数据统计，离体培养成功
的松树中，通过直接器官发生方式得到再生植株的
占 ８３％，通过间接器官发生方式的占 ５％，而通过
体胚发生的途径获得再生植株的占 １２％［３３］。 为了
使松树离体培养在育种过程中发挥更大作用，有关
其原生质体培养的研究也有相继报道［７，３４－３６］。
１．１　 直接器官发生
直接器官发生是离体培养中普遍采用且易于
实现的一种离体快繁方式，其器官建成直接来自外
植体，不需经过愈伤组织诱导，因此培养过程相对
简便，增殖速度快，再生植株变异小，遗传稳定性
高，可保持母体的优良性状，在生产中具较高的实
用价值。
１９７５年 Ｓｏｍｍｅｒ等［１７］以湿地松子叶为外植体
诱导出了不定芽，３０多年来，对松科植物直接器官
发生的研究获得了较多的成果，如：培养短叶松
（Ｐ． ｅｃｈｉｎａｔａ，又称萌芽松）的子叶－下胚轴，诱导出
了不定芽［１６］；由欧洲山松（Ｐ． ｍｕｇｏ，又称中欧山
松）的针叶束获得了幼芽［２４］；以若松（Ｐ． ｔｈｕｎｂｅｒｇｉｉ
×Ｐ． ｍａｓｓｏｎｉａｎａ）成熟胚为外植体通过直接器官发
生获得了再生植株［３７］；以海岸松嫩茎为外植体培
养出了再生植株［２５］。 另外，已初步解决了马尾松
（Ｐ． ｍａｓｓｏｎｉａｎａ）成熟胚离体培养与植株再生的不
定芽诱导、分化、伸长及生根等技术环节［１７］；以火
炬松成熟合子胚为外植体，直接诱导出了再生植
株［３８］；以美国黄松（Ｐ． ｐｏｎｄｅｒｏｓａ，又称西黄松）、白
皮松（Ｐ． ｂｕｎｇｅａｎａ）成熟胚为外植体，建立了再生
体系［２６，３９］；以黑松（Ｐ． ｔｈｕｎｂｅｒｇｉｉ）带子叶顶芽为外
植体 建 立 了 植 株 再 生 体 系［３０］； 以 赤 松 （ Ｐ．
ｄｅｎｓｉｆｌｏｒａ）２１ ～ ２８ ｄ 的无菌幼苗子叶－胚轴为起始
外植体，也构建了植株再生体系［４０］。
在直接器官发生过程中所采用的外植体据松
树的不同而异，但从目前的总体情况来看，以当年
生松树成熟胚、种子萌发的子叶－胚轴、嫩茎等作
为外植体易获得成功。
１．２　 间接器官发生
间接器官发生是离体培养中通过外植体诱导
愈伤组织再分化的形态建成过程。 几乎所有高等
植物的器官（如根、茎、叶和花）以及各种组织（如
皮层、形成层等）离体在合适的条件下都能产生愈
伤组织。 尽管间接器官发生程序较为复杂，但对于
直接器官发生的顽拗型树种，间接器官发生是有效
的离体培养再生途径。 此外，间接器官发生较直接
器官发生具更高的潜在繁殖系数，且产生的愈伤作
为分子育种的平台更有优势，因此其应用前景更广
阔。 对于常规无性繁殖相对难的松树而言，通过间
接器官发生途径实现植株再生更具现实意义。
间接器官发生途径的研究中，具代表性的有加
勒比松（Ｐ． ｃａｒｉｂａｅａ，由侧芽和顶芽培养出愈伤，进
而诱导了出芽） ［４１］、山白松（Ｐ． ｍｏｎｔｉｃｏｌａ，成熟胚间
接器官发生实现植株再生） ［２３］、辐射松（Ｐ． ｒａｄｉａｔｅ，
由成熟胚诱导出愈伤，进而得到再生植株） ［２７］、乔
松（Ｐ． ｗａｌｌｉｃｈｉａｎａ，由成熟胚诱导出再生植株） ［３１］、
湿地松（Ｐ． ｅｌｌｉｏｔｔｉｉ）、晚松（Ｐ． ｓｅｒｏｔｉｎａ） ［１８］、火炬松
（成熟合子胚为外植体，诱导出淡黄色、疏松、有光
泽的颗粒状愈伤组织，获得了高频率发生的不定
芽） ［４２］；此外，湿地松、欧洲赤松（Ｐ． ｓｙｌｖｅｓｔｒｉｓ）、马
尾松、华山松（Ｐ． ａｒｍａｎｄｉｉ）、樟子松 （Ｐ． ｓｙｌｖｅｓｔｒｉｓ
ｖａｒ． ｍｏｎｇｏｌｉｃａ）等树种的离体间接器官发生技术研
究也取得了不同程度的突破，得到了试管苗［４３－４４］。
这些研究为松树的间接器官发生与植株再生技术
构建提供了帮助。 现有的研究表明，利用松树成熟
胚作为外植体，采用筛选出的合适培养条件，易诱
导出淡黄色、有光泽的疏松愈伤，在此情形下更易
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南 京 林 业 大 学 学 报 （ 自 然 科 学 版 ） 第 ３９卷
成功实现其间接器官发生。
１．３　 体细胞胚胎发生
与器官发生相比，体细胞胚胎（简称体胚）发
生具有数量多、速度快、再生率高等优点，可用于生
物反应器来高效生产良种，且适于为分子育种搭建
平台，已愈来愈受重视。
松树体胚发生在国外研究相对深入，从 １９８５
年 Ｈａｋｍａｎ等［２］首例报道挪威云杉体胚发生技术
获得成功开始，针对不同松树，重点围绕着影响体
胚发生各个环节（胚性愈伤诱导、胚性愈伤保持和
增殖、体胚发育和成熟、体胚萌发和植株再生、体胚
苗移植）的相关因素，在如何提高体细胞胚的质量
和诱导频率的方法，以及体胚发生进程中的分子生
物学和生理生化领域开展了广泛研究［１２－１３］。 近年
已着手开展以松树顶芽为外植体的体胚发生技术
研究，并试图揭示功能基因在体胚发生各环节中的
作用［４］。
国内松树的体胚发生技术研究进展较快。 围
绕着火炬松［４２］、湿地松［４３］、马尾松和云南松（Ｐ．
ｙｕｎｎａｎｅｎｓｉｓ） ［４４］、华北落叶松［１０］、红皮云杉（Ｐ． ｋｏ⁃
ｒａｉｅｎｓｉｓ） ［４５］、杂种落叶松［９］、丽江云杉 （Ｐ． ｌｉｋｉａｎ⁃
ｇｅｎｓｉｓ） ［１１］、北美蓝云杉 （Ｐ． ｐｕｎｇｅｎｓ） ［１４］、白皮松
（Ｐ． ｂｕｎｇｅａｎａ） ［１５］等树种，以成熟或未成熟合子胚
为外植体，构建了不同树种的体胚发生技术。 江波
等［４６］综述了松科植物体胚发生的研究进展，为相
关树种体胚发生的研究提供了重要参考。
松树体胚发生的成功多采用不同发育阶段的
未成熟胚或成熟胚作为外植体，在 ＤＣＲ、ＧＤ 基本
培养基中易诱导出胚性愈伤，不同树种采用何种外
植体及其合适的具体培养条件，需做相应的试验才
能得出。
１．４　 原生质体培养
随着分子育种和体细胞杂交等现代种质创新
技术的研究，离体培养中的原生质体培养技术构建
逐渐得到重视。 对火炬松（从悬浮培养细胞获得
原生质体） ［３４］、大果松（Ｐ． ｃｏｕｌｔｅｒｉ，从子叶分离得
到原生质体） ［３５］、糖松（Ｐ． ｌａｍｂｅｒｔｉａｎａ，从子叶悬浮
细胞系和针叶愈伤分离原生质体） ［３６］、欧洲冷杉
（从非成熟胚诱导的胚性愈伤分离原生质体） ［７］等
树种均开展了原生质体培养的研究。 这些研究结
果为后续松树的原生质体培养技术构建提供了
依据。
国内在这方面的研究有待开展，该领域的突破
将为松树基因工程平台搭建和体细胞杂交奠定实
验基础。
２　 影响松科树种离体培养的因素
２．１　 外植体及其预处理
松树离体培养常用的外植体有：成熟胚、未成
熟胚、子叶、下胚轴、子叶－下胚轴、小孢子叶、大孢
子叶、苗尖、针叶束、腋芽、顶芽、茎段、嫩梢（带顶
芽的茎段）等，不同树种或同一树种的不同基因型
采用不同外植体开展离体培养的结果各异。 总体
而言，成熟胚、未成熟胚、种子萌发的胚轴和子叶是
松树离体培养的适宜外植体。
相同培养基中不同外植体类型会影响离体培
养结果。 如长白落叶松（Ｌａｒｉｘ ｏｌｇｅｎｓｉｓ）顶芽、腋芽、
胚轴、子叶、小孢子叶、大孢子叶的分化率各异［８］。
马尾松不同外植体产生愈伤组织的能力及生长速
率差别较大，其中幼茎的诱导率高于幼叶，而且幼
茎诱导愈伤组织的速度快，生长比其他外植体更
快［４７］。 因此，研究和筛选合适的外植体是松树离
体培养成败的关键内容之一。
同时，处于不同发育阶段的外植体其细胞的分
化程度有异，也会影响其离体培养的成功率。 已有
的研究表明，松科多数树种采用未成熟胚作为外植
体诱导愈伤及其体胚发生比用成熟胚容易，用成熟
胚又要优于用实生苗的幼嫩组织。 在黑云杉、糖
松、 美 国 五 针 松 （ Ｐ． ｓｔｒｏｂｕｓ ） 和 北 美 黄 杉
（Ｐｓｅｕｄｏｔｓｕｇａ ｍｅｎｚｉｅｓｉｉ）的体胚诱导中，发现仅某一
发育时期内采集的球果可适于建立良好的体胚发
生体系［４８］。 马尾松不同发育阶段未成熟胚其胚性
愈伤组织的诱导率也有差异［４９］。
为了提高外植体离体培养的成功率，预处理也
必不可少。 观察发现，松树的种子在低温（４ ℃）条
件下预处理 ７ ～ ２０ ｄ，可显著提高其胚的萌发率。
低温（４ ℃）预处理科罗拉多冷杉（Ａｂｉｅｓ ｃｏｎｃｏｌｏｒ）
种子 ２４～４８ ｈ，其胚的萌发率可高达 ９３％以上［５０］。
用赤霉素（ＧＡ３）和聚乙二醇（ＰＥＧ）处理湿地松种
子，能显著提高种子活力［５１］；用尿素处理也可在一
定程度上提高种子活力。 用 ＢＡ、ＮＡＡ 及截顶处理
长白落叶松，可使外植体的分化率提高 ２５％［８］。
２．２　 培养基类型
松树离体培养的常用基本培养基主要有 ＧＤ、
ＭＳ、ＬＭ、ＳＨ、ＤＣＲ、ＷＰＭ、ＬＰ、ＭＮＣＩ 等，不同松树对
基本培养基的要求不尽相同，应用时应针对不同树
种具体调整。 不同外植体或同一外植体的不同发
育时期所用培养基也有所差异［４６］。 ＤＣＲ 培养基
已被证实适合于糖松、湿地松、美国五针松和展叶
松等松树胚性愈伤组织及体胚的诱导。 ＤＣＲ 培养
４４１
　 第 １期 季孔庶，等：松科树种的离体培养研究进展
基相比 ＢＭ、ＬＰ、ＭＳＧ 培养基更有利于马尾松胚性
愈伤的诱导［２２］。 已发现 ＬＭ 培养基适合于云杉属
植物胚性愈伤及体胚的诱导［１４］。 Ｔｒｅｍｂｌａｙ［５２］发现
黑云杉和红云杉体胚发生所需还原态氮的适宜质
量浓度分别是 ２７２～８００ ｍｇ ／ Ｌ和 ２７２～１ ２００ ｍｇ ／ Ｌ，
因此，云杉属树种的体胚发生常用 ＬＰ 或 １ ／ ２ＬＰ 培
养基，很少用 ＭＳ培养基，主要原因是 ＭＳ培养基中
ＮＨ４ＮＯ３浓度过高。 马尾松幼苗茎段愈伤诱导的适
宜培养基为改良 ＧＤ 培养基，利用 ＷＰＭ 培养基也
能达到较好的诱导效果，但在后期的试验中发现，
ＷＰＭ培养基中诱导出的愈伤在继代培养中容易褐
化死亡；ＭＳ培养基和 ＳＨ 培养基则诱导率较低且
诱导出的愈伤直径小。 ＧＤ比 ＳＨ更适于马尾松胚
外植体的存活和诱导不定芽［２１］。 ＭＳ 和 ＳＨ 对阿
尔及利亚杉（Ａｂｉｅｓ ｎｕｍｉｄｉｃａ）胚的萌发无显著差
异［６］。 １ ／ ２ＭＳ基本培养基适合于柴松胚的分化增
殖培养［２９］。
２．３　 生长素与细胞分裂素
一般认为，离体培养过程中生长素能促进愈伤
和根的生长，而细胞分裂素抑制愈伤和根的生长，
因此要配比使用才有利于提高离体培养的效率。
对于大多数松树来说，胚性愈伤诱导要求含高浓度
生长素的培养基［５４］。 ２，４－Ｄ是诱导植物离体培养
的体细胞转变为胚性细胞的重要激素，ＮＡＡ 和
ＩＡＡ对植物细胞的毒害作用较小，产生的愈伤较易
分化，适用质量浓度范围为 ０．００１ ～ １０．０ ｍｇ ／ Ｌ。 生
长素和细胞分裂素以适当的比例配合使用，可使愈
伤组织生长速度适中，利于愈伤组织处于适度增殖
状态，这样才能使胚性细胞得到充分发育，进而产
生体细胞胚。 添加一定浓度的 ２，４－Ｄ 能显著促进
嫩茎愈伤组织的产生和增殖；在愈伤组织诱导初
期，宜设置较低的 ６－ＢＡ浓度；在随后的增殖中，可
适当提高 ６－ＢＡ浓度，有利于愈伤组织的增殖［２１］。
有些松属树种的体胚诱导不需要生长素，细胞分裂
素就可诱导体胚，如塞尔维亚云杉（Ｐ． ｏｍｏｒｉｋａ）的
外植体先在只含 ２．０ ｍｇ ／ Ｌ ６－ＢＡ的 ＬＰ 培养基上培
养 ４ 周，然后转到不含植物激素的培养基上，４～６ 周
后开始产生胚性愈伤［１３］；在云南松胚性愈伤诱导
中，要求有较高浓度的外源激素 ２，４－Ｄ，并配合较低
浓度的细胞分裂素［３２］。
２．４　 碳源
离体培养常用的碳源为蔗糖和麦芽糖。 蔗糖
作为碳源可保持合适的渗透压，适当降低培养基中
的蔗糖浓度，能有效促进美国黄松不定芽的增殖；
蔗糖浓度过高又会降低不定芽的增殖率，在其他因
素合适时，１ ／ ２ ＧＤ 培养基中加 １０．６ ｇ ／ Ｌ蔗糖，１ ／ ２
ＳＨ培养基中加 ２０．５ ｇ ／ Ｌ蔗糖，有利于美国黄松不
定芽的增殖，但当蔗糖浓度超过或低于适宜浓度
时，又会抑制不定芽的增殖。 在离体胚培养时，低
浓度蔗糖有利于子叶、胚轴等外植体分化为愈
伤［５５］。 使用葡萄糖或蔗糖作为碳源不会显著影响
子叶愈伤鲜质量，但它们的浓度明显影响子叶愈伤
鲜质量；随着愈伤鲜质量的增加，需要较高浓度的
糖类来维持其生长；糖类还可改变愈伤的质地，从
而影响体胚发生［５６］。 添加 ２．５％蔗糖时油松离体胚
的愈伤诱导率最高，不利于子叶诱导不定芽；蔗糖添
加量为 ７％时，在红光下促进了子叶分化为不定芽，
且有利于芽的伸长生长，并促进茎和叶的生长［２８］。
２．５　 其他添加物
在松树离体培养中运用活性炭已较普遍，并得
到了较好的效果。 如在晚松、火炬松和湿地松离体
胚培养研究中证实，活性炭对嫩梢的生长具有良好
的作用［１８］。 在 ＧＤ和 ＳＨ两种培养基上，阿尔及利
亚冷杉不定芽增殖系数均随着活性炭的增加而下
降，但是活性炭对不定芽的生长，特别是不定芽的
伸长具显著促进作用；在其促进生根研究中发现，
嫩梢高度与生根率成正相关［６］。 深入研究还发
现，适量活性炭能促进松树的诱导根生长，但它不
能促进根的发生；高浓度活性炭又会大量吸附培养
基中营养元素和生长调节剂，从而影响根的生长。
所以，在培养基中添加活性炭的量要适中，在诱导
出根后再转入含低浓度活性炭的培养基中效果
较好［２０］。
此外，水解酪蛋白、水解乳蛋白、Ｌ－谷氨酰胺
等常被附加到诱导分化培养基中，能更好地诱导出
愈伤或直接发生器官分化［５６］。 谷氨酰胺对胚性愈
伤的诱导影响较大已在云南松胚性愈伤诱导及增
殖的研究中得到证实［３２］。 在培养基中添加谷氨酰
胺，有利于提高氨态氮与硝态氮的比例，从而促进
胚性愈伤的获得。 在松树的体胚发生研究中，常用
肌醇或聚乙二醇做渗透剂，提高培养基的渗透压。
３　 松科树种离体培养中亟待解决的
问题
　 　 离体培养作为现代林业生物技术的重要内容，
对于林木良种高效快繁、种质定向创新和高效保
存、分子育种等领域正起着极为重要的作用，其地
位也日趋提高。 但多数松树属于离体培养难度较
大的植物，虽然已经取得了一定的成效，一些关键
问题仍有待进一步解决。
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南 京 林 业 大 学 学 报 （ 自 然 科 学 版 ） 第 ３９卷
３．１　 揭示离体培养过程中相关机理
松树与其他树种类似，在开展其离体培养研究
过程中更多关注技术性的探索，对培养过程的相关
机理性研究存在欠缺，易造成技术性研究的盲目
性，使得研究效率不高，甚至走重复的弯路。 而事
实上，离体培养中的细胞脱分化和再分化既涉及细
胞学和发育生物学相关原理，也会涉及基因调控的
相关机制［４－５，５７］。 今后若能更侧重离体培养的机
理性研究，特别是离体细胞脱分化与再分化的调控
机制、体胚发生的关键基因调控机理、离体培养过
程中发生变异的机制等，这些问题的化解将有利于
离体培养的关键环节———发育同步化技术的构建，
从而推进松树及其他树种的离体培养技术，并提高
相关研究的效率，使培养技术的可靠性得到提高。
３．２　 研发成年优树营养器官为外植体的离体培养
技术
　 　 离体培养的一个重要目标在于高效扩繁良种。
按照经典林木遗传育种的方法，很多经济性状需要
被选优树成年后才能对其作出相对准确的评价。
而从目前开展的松树离体培养实情来看，绝大多数
是以胚（未成熟或成熟）、子叶－胚轴、幼龄母树顶
芽等作为外植体，尽管目前很多学者注重利用已建
松树种子园的优良家系材料开展上述外植体的离
体培养，但从理论上讲毕竟是经过了有性过程，难
以达到最大遗传增益的获取，因此有必要以成年优
树营养器官为外植体开展松树离体培养技术研究，
使其真正为无性系育林事业服务。
３．３　 构建种质资源的超低温保存技术
离体培养的另一重要功能在于保存种质。 为
了实现种质资源中长期保存和高效保存，离体超低
温保存已有 ４０多年的发展历程。 目前已建立了包
括二步降温法、预培养法、干燥法、预培养干燥法、
包埋干燥法、玻璃化法、包埋玻璃化法和小滴冰冻
法等多种保存方法［５８］，但至今鲜见关于松树的相
关报道。 因此，有必要结合离体培养领域的相关研
究，开展松树种质资源超低温保存的相关研究，借
鉴其他树种研究的相关经验，研发出适于不同松树
种质资源的超低温保存方法，使离体培养技术在此
领域中发挥应有作用，为珍稀种质的高效长期保存
创造条件。
３．４　 化解愈伤组织褐化问题
在植物离体培养中，愈伤组织褐化是常见现
象，主要原因是培养过程中酚类物质的产生。 影响
褐变的因素有培养基中无机盐、植物生长调节剂、
植物材料、取材部位和时期、抗氧化剂、吸附剂、培
养基状态、外植体大小及受伤程度、光照、温度、继
代周期等。 松树在愈伤组织诱导培养中，如外植体
分割时，造成的创伤细胞中的酚类物质遇空气中氧
气也同样极易被氧化成棕褐色或暗褐色的醌，并会
慢慢扩散到培养基中，抑制酶类的活性，从而毒害
整个外植体。 糖含量过高或激素含量过高或置于
光照条件下培养时，愈伤组织都很容易褐化。 应及
时地调整培养条件，如缩短继代周期、加入抗氧化
剂或吸附剂等以避免褐化对愈伤诱导及增殖的影
响。 因此，应据不同松树的特点，研究化解褐化
问题。
３．５　 优化试管苗的生根诱导与移栽技术
目前，大量的松树离体培养取得不同程度的进
展，但是多数树种的试管苗生根仍然比较困难，而
且还存在生根率低、不定根数少和移栽成活率低的
问题。 离体培养得到的不定芽生根与许多因素有
关，例如外植体基因型、外植体年龄、生理状态、激
素的种类与浓度等。 所以要使试管苗生根，必须筛
选适宜种类和浓度的生长调节剂、选择适宜的处理
方法和时间。 进行移栽时，要严格控制移栽条件，
如温度与湿度、培养基质的灭菌等。 在马尾松成熟
胚离体培养中，虽然获得了较高的生根率，但发现
移栽苗的成活率仍很低［２０］。 因此，选择合适的移
栽条件才能为商业化生产提供保障。
３．６　 实现试管苗商业化生产
由于很多松树的离体培养目前仍仅限于实验
室培养。 与很多其他树种类似，松树离体培养技术
在由实验室培养成功的基础上放大到规模化生产
过程仍有待进一步优化相关的技术条件，至今很多
松树仍未能达到可工厂化育苗的要求。 同时，有关
其离体培养的成本核算也少有人问津。 因此，想要
实现松树的离体培养如一些桉树和杨树般可商业
化育苗的目标，还需要通过机理性研究结果来支撑
优化由实验室培养进入规模化培养的各个技术环
节，使脱分化、再分化和再生植株的技术体系变得
成熟。 此外，应积极探索研发松树的体胚发生技
术，并朝着生物反应器生产良种的方向迈进。
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南 京 林 业 大 学 学 报 （ 自 然 科 学 版 ） 第 ３９卷
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Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｆｕｊｉａｎ Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｆｏｒｅｓｔｒｙ，２００５，２５（３）：２６０－２６３．
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ｖｉｔｒｏ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ Ｐｉｎｕｓ ｐｏｎｄｅｒｏｓａ ｃｏｔｙｌｅｄ ｏｎ ｅｘｐｌａｎｔｓ ［ Ｊ］ ．
Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ， Ｔｉｓｓｕｅ ａｎｄ Ｏｒｇａｎ Ｃｕｌｔｕｒｅ，１９９０，２０ （１）：４７－５２．
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［Ｊ］ ． 湖南农业大学学报：自然科学版，２０１２，３８（４）：３４７－３５３．
Ｘｉｏｎｇ Ｙ Ｘ， Ｌｉ Ｙ Ｌ． Ｐｒｏｇｒｅｓｓ ｉｎ ｃｒｙｏｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎ ｏｆ ｗｏｏｄｙ ｐｌａｎｔ
ｇｅｒｍｐｌａｓｍ［Ｊ］ ． Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｈｕｎａｎ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ：Ｎａｔｕｒａｌ
Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，２０１２，３８（４）： ３４７－３５３．
（责任编辑　 郑琰燚）
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