全 文 ：·综述进展·
农杆菌介导的芸薹属植物遗传转化技术的研究进展
Advances in Plant Genetic Transformation Techniques of
Brassica by Agrobacterium-mediated Method
蓝海燕　　陈正华
Lan Haiyan　Chen Zhenghua
中国科学院遗传研究所 , 　北京 100101
Institute of Genetics , Chinese Academy of Sciences , Beijing 100101
摘要:本文从芸薹属植物遗传转化技术的几大要素:植物基因型;农杆菌株系;外植体生理状态及培养条件;筛选标
记及抗生生素类型;AgNO3 的作用;褐化及玻璃苗的防治等方面对农杆菌介导的转化技术的研究进展进行了综述。
Abstract:In this paper ,we summarized the advances in Genetic Transformation Techniques of Brassica
mediated by Agribacterium .Analysed the main facto rs w hich affect this techniques , such as , geno types
of varieties , Agrobacterium st rains , physiological state of explants.selection markers , AgNO3 funct ion
and vit rification prevent ion , etc.
　　芸薹属(Brassica),属于十字花科(Cruciferae),
约包含100个种[ 1] ,其中许多是重要的油料 、蔬菜和
饲料作物。长久以来 ,育种家对此类作物进了广泛
的品种改良 ,但常规育种方法常局限于种质资源的
匮乏 。植物基因工程技术在农业上的应用为有效改
良芸薹属作物提供了新途径。由于芸薹属中许多种
对组织和细胞培养技术较敏感[ 8] 。故芸薹属作物
的遗传转化技术的研究进展较快 ,农杆菌介导法 、电
激法 、基因枪法 、显微注射法 、激光微束穿刺法 、脂质
体法 、转化丝法等[ 2 ,3]方法分别在甘蓝型油菜 、白菜
型油菜 、芥菜 、黑芥 、花椰菜 、芜菁等作物改良中得到
了利用[ 9] 。比较而言 ,农杆菌转化法在其中具有独
特的优势 ,它能使被转化基因稳定整合到植物基因
组中 ,并以孟德尔规律传给下一代[ 4 ,5] 。在许多芸
薹属种中此方法被证明具有高效性[ 10] 。它简便 、成
本低 、转化频率较高。利用此法已将改良的油成
份[ 11] 、除草剂抗性[ 12 , 13] 、改良蛋白组份[ 14] 等新性
状导人甘蓝型油菜中 。已成为油菜遗传转化中最常
用的方法 。
在利用农杆菌转化技术的过程中 ,有许多因素
对转化过程和转基因植株的再生产生影响。其中关
键的有:植物基因型 、农杆菌株系(染色体背景 、毒性
基因)、接种方法 、靶细胞生理状态及对转化植株的
筛选程序等。以下就对此方面的研究进展进行综
述 ,期望为芸薹属的遗传转化提供理论和技术的借
鉴 。
1　不同的植物基因型及转化受体对农杆菌
转化效率的影响
在农杆菌介导的转化方法中 ,最广泛应用的供
试材料为甘蓝型油菜(Brassica napus)。而在甘蓝
型油菜中 ,以春性品种研究较多 。在过去的几年中 ,
最常用的春油菜品种是 Westar。原因是春性甘蓝
型油菜品种比其它芸薹属种具有转化频率高 、品种
间差异不大等优点 。Boulter 等(1990)从两个春油
菜及一个冬油菜品种 Cobra 中获得转基因植株 ,其
中 Cobra 的转化率只有春油菜 Westar 的 25%[ 15] 。
Stefanov(1994)也得到相似的结果[ 16] 。春油菜与冬
油菜在转化率上差异的原因还有待研究。冬油菜的
这种较低的转化率及品种间很大的差异性是影响其
遗传转化的主要障碍。
转化受体通常来自于植物的原生质体及外植体
组织(包括下胚轴 、子叶柄 、茎段等)。在这些基因受
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生物技术通报　　Biotechnology Information　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　1999年第 3期
DOI :10.13560/j.cnki.bio tech.bul l.1985.1999.03.004
体中 ,较常用的为下胚轴 、子叶柄和茎段 。在不同实
验体系中不同外植体组织的再生频率不同。Pua
(1987)用茎段和下胚轴进行再生苗分化率的对比研
究得出“茎段再生能力通常比下胚轴高[ 17] ”的结论 。
而 Damgaard(1997)的研究认为:子叶柄的转化率比
下胚轴高[ 10] 。他观察到在共培养期间 ,子柄切面上
有广泛的细胞分裂活性 ,而在下胚轴切面上未观察
到此现象。作者认为 ,外植体切面上的愈伤组织的
快速拓展是成功转化的必要条件。而在愈伤细胞中
具有转化和再生活性的只占少数 。Damgaard 还观
察到子叶柄分化苗的速度比下胚轴快 ,这使得愈伤
的生长期缩短并降低了转化细胞被其它非转化愈伤
排挤的可性。Moloney(1998)建立了一种农杆菌介
导的高效转化方法 ,他认为 ,子叶柄切面的薄壁细胞
具有高效再生能力 ,且很易受农杆菌感染。在此过
程中无需用乙酰丁香酮及附加外源毒性启动子对毒
性区进行诱导。子叶柄表层受伤的细胞很容易接触
到细菌 ,而花茎段的薄壁细胞层也具有较高的再生
能力 ,但正如 Klimazew ska(1985)[ 18]提到的 ,此具有
再生能力的薄壁细胞位于表皮以下的较深层处 ,从
而极大地降低了与农杆菌 接触的可能性 ,它虽具有
高的再生能力 ,但却具有相对较低的转化苗率[ 19] 。
2　外植体生理状态及其培养条件对转化效
率的影响
外植体的生理状态对转化效率亦有很大影响 。
从不同培养天数的油菜无菌苗上取下的外植体中 ,
Molomny 等(1989)认为 , 4 ～ 5天的子叶柄具有最高
的转化效率 。而 Damgaard 等认为 7天后的子叶柄
和下胚轴较适合 。钟蓉等(1997)通过对不同品种不
同的外植体类型研究得出:不同生长期的无菌苗对
芽的分化率有较大影响 。品种 2133 无菌苗生长 4
～ 5d子叶柄和品种“中双 4号”无菌苗生长 10 ～ 12d
的下胚轴为转化最佳生理状态[ 20] 。由此看来 ,不同
品种 ,不同外植体类型具有不同的最适取材的时间 。
另外 ,外植体放置的方式及密度亦会影响转化率 。
通常认为插入培养基中比水平放置于表面转化率
高;而培养皿中外植体的密度较低时转化率高 。
不同的光照条件下无菌苗的外植体对芽分化率
也影响较大 。暗培养中无菌苗长势较弱 ,在农杆菌
侵染过程中 ,容易被菌抑制而死亡 ,而光照培养的无
菌苗长势强 ,具活力 ,易耐受农杆菌侵染[ 20] 。甘蓝
型油菜外植体与农杆菌共培养时 , 乙酰丁香酮
(acetosy ringone)对高效率的转化有一定的作用。
Damgaard 等研究证明 , 在共培养培养基中加入
200μM 的乙酰丁香酮是产生阳性转化子的前提条
件[ 10] 。这与 Charest等(1988)的研究结果一致[ 21] 。
然而也有不同的结果 。Moloney 等认为在共培养过
程中无需加入乙酰丁香酮一类的物质 。钟蓉等也认
为这类物质对甘蓝型油菜的遗传转化几乎无促进作
用 ,甚至会引起外植体褐化 ,其原因不详。
3　农杆菌不同菌株及染色体背景对转化效
率的影响
常用于植物遗传转化的农杆菌有根癌农杆菌
(Agrobacterium tumefaciens)和发根农杆菌(A.
rhizogenes)。两者均含有巨大质粒。前者称 Ti质
粒(tumorinducing), 感染植物产生瘿瘤(Crown
gall);后者称 Ri质粒(root inducing),感染植物产生
毛状根(Hairy root)。两者的结构大致相似 ,均可使
T -DNA(Transfer -DNA)插入植物基因组从而
使植物体发生转化并在细胞中稳定存在 。因
而 Ti 和 Ri 均可作为导入外源基因的载体 。目
前这两种农杆菌均已在植物遗传转化中得到
利用 。然而在芸薹属植物中根癌农杆菌为常用
的菌种[ 9 , 12 ,15～ 17 , 19 ,20 ,22～ 24] 。 Boulter 等(19 90)
分别利用发根农杆菌和根癌农杆菌对甘蓝型
油菜进行转化结果显示 , 前者转化频率比后者
低 。但发根农杆菌也有其优势。它产生的毛状根较
容易再生植株 ,且其毛状根为单细胞起源 ,由它产生
的转化植株多为纯合体 。
在根癌农杆菌对甘蓝型油菜转化过程中 ,不同
的株系 ,即 ,染色体毒性基因的背景及毒性基因的来
源 , 对转化效率有很大的影响 。根癌农杆菌中有两
种质粒类型———章鱼碱型和胭脂碱型 ,带有各自的
毒性区(Vir), 且在染色体上亦有相应的毒性位点
Chv 。从前人利用这两种不同质粒派生载体在转
化过程中的结果发现 , 章鱼碱型株系比胭脂碱
型株系效率低[ 12 , 26] 。用 5 种带有不同的染色体
的毒性位点及质粒毒性区的农杆菌株系对甘
蓝型油菜的 8 个品种进行转化 , 结果显示 , 章
鱼碱型株系 LBA 44 04 pA L44 04 pJI T7 3 只在一
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个品种 Falcon 中转化成功 , 而另一种胭脂碱型
株系C58Cl pGV3850 pGSGLUCl对 8 个品种均有
一定的转化效率[ 10] 。然而在实验中发现 ,这种章鱼
碱型株系的毒性区可以被乙酰丁香酮或烟草叶盘受
伤细胞所激活[ 21] 。这可能说明 ,章鱼碱型株系的活
性需要比较高的酚类物质的诱导 , 或章鱼碱型 Vir
区基因对低浓度伤口分泌的信号物质不太敏
感[ 27] 。在发根农杆菌中也存在类似现象 , 一般
为农 杆 碱 型(ag ropine)株系 强 于 甘 露 碱 型
(mannopine)株系[ 28 ～ 30] 。原因可能是转化受体细
胞对生长素敏感性不同[ 31] 。因为农杆碱型 T -
DNA中含有生素合成基因 ,甘露碱型则没有[ 28] 。
发根农杆菌一个很大优越性是它的发根性基本保持
了再生植株的能力。但转化植株常表现异常:根的
向地性减弱 、叶片皱缩 、节间缩短 、育性降低[ 32 ～ 35] 。
4　筛选标记及抗生素对转化效率的影响
4.1筛选标记
被转化的组织能否长成植株在很大程度上依赖
于筛选体系的选择效果[ 26] 。新霉素磷酸转移酶 Ⅱ
(NPT Ⅱ)基因是目前最普遍被利用的选择标记。然
而对于甘蓝型油菜来说 ,有时效果很差 。Pua 等利
用油菜茎纵切片在 Kan 筛选培养基上根本分化不
出芽[ 17] 。Schieder 实验室转化甘蓝油菜和黑芥原
生质体 ,也未得到抗卡那霉素的转化子 。Charest 等
对转化油菜的筛选效果也欠佳[ 21] 。本试验室在利
用 Kanamacin做筛选标记的甘蓝型油菜转化实验中
也出现了绿苗率极低的现象(资料未显示)。除此之
外 ,潮霉素磷酸转移酶基因[ 2 ,36] 和二氢叶酸还原酶
基因[ 17]及 bar基因 、spt基因[ 24]也作为筛选标记被
利用 ,它们分别介导对潮霉素 ,氨甲喋呤 、除草剂
PPT 及链霉素的抗性。
最近 ,Schroder等(1994)研究了在甘蓝型油菜
转化过程中 4 种选择标记基因(npt Ⅱ , aadA , bar ,
spt)在筛选过程中的效果 ,认为 aadA 基因(介导对
链霉素和壮观霉素的抗性)在转化体的筛选过程中
是最合适的[ 24] 。
4.2抗生素的选择
采用农杆菌介导转化法 ,在培养过程中必须使
用抗生素以抑制农杆菌生长。选用不同的抗菌素对
植物转化效率也有影响。Charest等发现头孢霉素
对甘蓝型油菜薄层细胞芽分化具有抑制作用[ 21] 。
Deblock等发现用羧苄青霉素抑菌比使用头孢霉素
对芽分化的抑制作用小[ 12] 。但头孢霉素对生根却
有促进作用 。
5　AgNO3 在植物转化中的作用及可能机制
在遗传转化过程中 ,筛选培养基中加入 AgNO3
可明显地提高转化效率。DeBlock 等报道 , AgNO3
对遗传转化中油菜外植体再生是必需的 ,且在筛选
培养基中应尽早加入适量的 AgNO3 ,否则 ,芽的再
生就很困难。程振东等研究表明 ,AgNO3 可提高农
杆菌转化甘蓝型油菜的频率 。张鹏等[ 37 , 38] 对
AgNO3促进菜心子叶柄离体植株再生的组织学的研
究证明 , AgNO3 可使子叶柄维管薄壁细胞直接参
与到芽原基形成并发育成苗 ,不定根和愈伤组织的
形成及生长则被抑制 。AgNO3 的应用也解决了芸
薹属植物组织培养过程中由于根的产生而抑制不定
芽形成的关键问题 。除此之外 , AgNO3对再生十分
困难的白菜型品种 Tobin有促进作用 。
在促进遗传转化的再生中 ,AgNO3 的最适浓度
因不同基因型而不同 。一般在筛选条件下 AgNO3
的常规用量为 1 ～ 10mg/L。通常外植体应避免长
期在含 AgNO3的培养基上生长 ,否则会导致再生植
株畸形生长。不同植物品种及器官对 AgNO3 的反
应不同。在菜心[ 37]及白菜[ 39] 中 ,子叶比下胚轴对
AgNO3 的敏感性高 。在使用 AgNO3 时应注意:
AgNO3需先过滤灭菌;并在培养基温度小于 60℃时
加入;同时加入羧苄青霉素(250 ～ 500mg/L)可防止
培养基变褐及Ag+的毒害作用 。
AgNO3之所以促进植物培养物的再生 ,主要因
为起了乙烯活性抑制剂的作用。植物组培过程中产
生的大量乙烯 ,影响分化多种芸薹属植物因产生大
量乙烯导致植株畸形生长发育[ 40] 。Ag+可以竞争
性乙烯作用部位而促进器官发生和体细胞胚胞发
生 。对 Ag+作用机制的深入研究表明 ,Ag+与乙烯
及多胺的生物合成代谢有密切的关系 。乙烯抑制器
官发生而多胺则促进它们的发生[ 41～ 44] 。乙烯的生
物合成与多胺的生物合成中的重要酶 ADC(精氨酸
脱羧酶)和 SAMDC(S-腺苷甲硫氨酸脱羧酶)的活
性 , 而 AgNO3 可抑制乙烯在这方面的作用 , 从而
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促进体细胞胚胎发生 。然而 Chi 等[ 46 , 47] 研究
却认为 AgNO3 不是抑制乙烯合成 , 而是促进
ACC 合成酶活力和 ACC 的积累 ,与另一种乙烯
抑制剂AVG(aminoethoxyviny lglycine)的作用完全
不同 。也有人研究认为 ,Ag+在促进植株再生上似
乎与多胺代谢无关。Ag+抑制乙烯活性可能是通过
竞争性结合细胞上的乙烯受体蛋白 ,起到阻止或降
低乙烯的作用[ 48～ 49]的效果 。因而关于 AgNO3 的
作用机理还有待深入研究 。
6　褐化及玻璃苗现象的防止
不同的品种 ,在组培中都会出现褐化及玻璃化
现象。褐化的组织很难分化出芽 ,而玻璃化的再生
苗很难生根 ,通常在转移到温室后不久死亡。为克
服褐化现象 ,可在培养基中加入 500mg/L PVP(聚
乙烯吡咯烷酮)和 5mg/LAgNO3 。
玻璃化现象常被认为与培养基浓度低 、相对湿
度较高 、培养容器中存在温度梯度 、分裂素高浓度等
因素有关[ 50～ 52] 。针对这些原因 ,采取将培养基浓
度提高至 0.1%～ 1.2%,加入 20%山梨醇 ,用透气
膜封口 ,用容积较大的三角瓶代替容积较小的平皿 ,
防止培养容器底部温度高于上部 ,使 BA<2mg/ L ,
NAA<0.2mg/L 等等措施均可有效减少玻璃苗现
象的发生 。
综上所述 ,利用农杆菌介导的芸薹属植物遗传
转化体系已逐渐成熟 ,特别是在甘蓝型油菜中研究
较深入 。然而因其中涉及的因素很多 ,其转化效率
因不同的品种及操作人员有很大的差异 ,因而要获
得稳定的高效的遗传转化程序 ,还需要进行更深入
的研究。
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