全 文 ：应用与环境生物学报　2001 ,7(1):29～ 32 　 　
Chin J Appl Environ Biol=ISSN 1006-687X 　 2001-02-25
　
利用 RAPD技术分析兰属(Cymbidium)
品种间的亲缘关系＊
文　李　叶庆生　王小菁＊＊　潘瑞炽
(华南师范大学生物系　广州　510631)
摘　要　本文利用 RAPD技术来检测兰属 13 个品种间的亲缘关系.通过对 55 种 10 个碱基随机引物的筛选 , 其中 4
种引物能得到重复性 、稳定性较高扩增产物 ,四种引物共扩增出 93条多态性带 , 多态率为 100%.根据 RAPD 标记进行
邻体聚类分析 ,表明兰属各种间的亲缘关系与形态学分类结果不完全一致.实验结果认为 RAPD技术可用于兰属植物
的系统学研究.图 2 表 3 参 13
关键词　兰属;RAPD;聚类分析
CLC　Q949.718.430.9 ∶Q75
ANALYSIS OF RELATIONSHIP AMONG CYMBIDIUM
CULTIVARS USING RAPD
WEN Li , YE Qingsheng , WANG Xiaoqing &PAN Ruichi
(Dept of Biology , South China Normal University ,Guangzhou　510631 , China)
Abstract　RAPD technique was used to detect the relationships among 13 Cymbidium cultivars.Four 10-mer
random primers that were screened from 55 primers obtained reproducible and constant amplified products , includ-
ing 93 polymorphic markers.The rate of polymorphism was 100%.The results of neighbor-joining cluster analysis
had some differences with those of morphological taxonomic study.It is shown that RAPD is a suitable method in
taxonomic study on Cymbidium .Fig 2 , Tab 3 , Ref 13
Keywords　Cymbidium ;RAPD;cluster analysis
CLC　Q949.718.430.9 ∶Q75
　　RAPD技术[ 1]近几年内已广泛地应用于遗传多
样性检测 ,基因定位 ,遗传图谱构建和系统学研究等
领域[ 2～ 4] .兰花是我国重要的花卉之一 , 具有很高
的观赏和经济价值.但兰属(Cymbidium)植物品种繁
多 , 对其花卉的整理和研究存在很大的困难.对兰
属植物的形态学[ 5] 和生化水平[ 6] 上的分析均有报
道;分子水平上 ,梁红健等人[ 7]曾用 20个碱基的随
机引物对兰属的部分品种进行过一些研究 ,而利用
10个碱基的随机引物扩增后对其基因组 DNA进行
多态性分析的研究尚未见报道.本文用 RAPD技术
研究兰属植物品种间的亲缘关系 ,为了解兰属植物
的系统发育研究作一些初步探讨.
收稿日期:1999-11-22　　接受日期:2000-10-11
＊广东省高教厅自然科学重点科研项目及广东省自然科学基金研究
团队项—花卉的发育生物学研究
＊＊通讯联系人　Corresponding author
1　材料和方法
1.1　供试材料
供试材料为兰属(Cymbidium)5个种 2 个变种
的 13个品种 ,除野生寒兰(C.kanran)购自华南植物
所外 ,其它品种均为本实验室栽培.兰属分类按吴应
祥方法[ 5] .
1.2　DNA的提取
DNA提取按常规酚/氯仿法稍加改变.取叶片 ,
用去离子水洗净 ,贮存于-80℃冰箱备用.称取叶片
各 0.5 g ,加液氮研磨成粉末 ,加入 8 mL 65℃提取缓
冲液[ c(Tris-HCl)=10 mmol/L , c(EDTA)=100
mmol/L ,1%Sarcosyle ,1%PVP , pH 8.0] ,65℃水浴 10
min ,加入 1/10 体积重蒸酚 , 65℃水浴 20 ～ 30 min ,
15 000×g , 4℃离心10 min ,取上清液 ,加入等体积氯
仿 ,65℃水浴 20 ～ 30 min ,离心 1次 ,取上清液 ,用-
20℃异丙醇室温沉淀 10 min ,离心 ,弃上清 ,用 70%
乙醇 ,无水乙醇分别洗涤沉淀 ,离心去上清液 ,真空
干燥沉淀 ,用 3 mL的 TE[ c(Tris-HCl)=10 mmol/L ,
c(EDTA)=100 mmol/L , pH 8.0] 溶解沉淀 , 加入
RNase ,摇匀 ,65℃处理10 min ,之后分别用等体积酚 ,
酚/氯仿(等体积的酚和氯仿混和液),氯仿各抽提 1
次 ,离心 ,取上清液 ,用-20℃异丙醇沉淀 1 h以上 ,
再用 70%和 100%乙醇各洗涤 1次 ,真空干燥沉淀 ,
复溶于TE分装成小体积 ,4℃或-20℃保存.
表 1　用于本实验分析的兰花品种
Table 1　Cymbidium cultivars used in this study
种名
Speices
编号
No.
品种名
Cultivars
建兰
C.ensifolium
1
2
3
四季兰　Si ji lan
大凤素　Dafengsu
铁杆素　Tiegansu
独占春
C.eburneum
　象牙白花兰(变种)
　C.var.parisshii
4 象牙白花兰　Xiangyabai Hualan
春剑
C.longibracteatum
　通海剑兰(新变种)
　C.var.tonghaiense
5 通海剑兰　Tonghai Jianlan
兔耳兰　C.lancifolium 6 兔耳兰　Tuerlan
寒兰　C.kanran 7 野生寒兰　Yesheng Hanlan
春兰　C.georingii 8 莲瓣春兰　Lianban chunlan
墨兰　C.sinense
9
10
11
12
13
海南墨兰　Hainan Molan
白墨　Baimo
徽州墨　Huizhou Mo
企黑　Qihei
金嘴　Jinzui
1.3　RAPD反应条件
PCR总反应体系参照Williams等 1990[ 1] 年的方
法略作改动:2.5 μL 10×Buffer [ c(Tris-HCl)=10
mmol/L pH 8.3 , c(KCl)=50 mmol/L , c(MgCl2)2
mmol/L , 0.001% gelatin] , c(dNTPs)=400 μmol/L ,
c(primer)=0.2 μmol/L , 15 ng DNA , 2-3U Taq DNA
polymerase(加拿大真达公司),反应总体积为25 μL.
PCR扩增条件为:94℃ 1 min , 35℃ 1 min , 72℃ 2
min ,5 个循环;94℃10 s , 35℃30 s ,72℃90 s , 35 个
循环;72℃7 min ,扩增完后置 4℃保存.反应在 Am-
plitron II型PCR仪(美国Thermolyne公司)上进行.每
种引物重复 2次 ,每次扩增均设无模板 DNA CK ,以
检测反应体系是否受污染.
1.4　电泳检测
将所有的反应产物与 5 μL 溴酚兰(0.25%溴酚
兰 ,400 g/L蔗糖水溶液)混匀 ,点入 1.5%琼脂糖凝胶
中 ,5 V/cm电泳 1～ 2 h ,凝胶放入0.5 μg/mL EB溶液
中染色15min左右 ,取出凝胶用Bio-RadGel Doc1000
凝胶成像仪观察电泳结果 ,并打出电泳图谱.
1.5　数据分析
用 λDNA/EcoRI+Hind III 或 PBR322DNA/BstN
I做分子标记 ,确定反应产物在凝胶上对应的位置 ,
有扩增带记为“1” ,无扩增带记为“0” ,将信号很弱的
带记为“n” ,根据DNA带记录计算相似系数 S c(Sim-
ilarity coefficient),相似系数为两品种同时为 1或0的
带数之和与总带数的比值 ,得到相似系数矩阵 ,对 13
个兰属品种进行聚类分析[ 7～ 8] ,作出系统聚类图.
2　结果与讨论
2.1　4种引物的扩增结果
实验过程中筛选了 55 种随机引物 ,其中 40种
为Operon公司的C组和Q组引物 ,另外15种为上海
生工生物工程公司的第 17组引物 ,一共筛选出 10
种引物可用于兰属植物的扩增 , 但仅有 OPC-09 ,
OPC-19 ,OPQ-01和S468这 4种引物能扩增出重复性
和稳定性较高的多态性带 ,表 2为 4种引物的序列
及扩增带数的统计.4种引物共获得 93条扩增带 ,全
为多态性带 ,多态率为 100%,大多数扩增带在 200
～ 4 000 bp范围内.图 1为 4种引物的扩增图谱.根
据 1.5统计方法得出相似系数的矩阵如表 3.
2.2　讨 论
本实验结果表明 ,RAPD标记较同工酶和蛋白质
表现出更大的多态性(同工酶和蛋白质的多态率为
80%左右),这可能是由于 RAPD标记检测 DNA的随
机序列 ,而同工酶和蛋白质标记的位点相对稳定.
兰属植物的分类主要以形态学特征为主 ,形态
分类学家德国学者施莱希特 ,英国的 Puy 和 Cribb将
建兰 、寒兰和墨兰被划为建兰组 ,而春兰被归于春兰
组[ 5] .
表 2　四种不同引物碱基序列及扩增结果
Table 2　Sequence and amplification efficiency of the four primers
引物编号
No.of primers
碱基序列
Sequence of primers
扩增总带数
Total amplified bands
多态性带数
No.of polymorphic bands
多态率 %
% of polymorphism
OPC-09 CTCACCGTCC 23 23 100
OPC-19 GTTGCCAGCC 32 32 100
OPQ-01 TTCGAGCCAG 18 18 100
S468 ACATCGCCCA 20 20 100
30　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　应 用与 环境 生物 学 报　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　 7卷
吴应祥将春兰划为兰组 ,建兰 、墨兰 、寒兰和春剑等划
为蕙组的小花亚组 ,独占春等划在大花亚组;兔耳兰
划在宽叶组[ 5] .一般认为建兰 、寒兰和墨兰的亲缘关
系较近 ,春兰与以上几种兰花的距离较远 ,而独占春
和兔耳兰与它们的距离更远.梁红健等人用同工酶和
RAPD标记都证实了寒兰和建兰的亲缘关系最近[ 7] .
根据本实验的聚类结果 ,以上 7组根据亲缘关系的远
近又可聚为5类:建兰组和墨兰组在 0.734处聚为类
I;类 II为春兰 ,其与类 I在 0.726处聚合;类 III为春
剑和寒兰 ,这类与类 II 在0.720处聚合;类 IV为独占
春中的变种象牙白花兰 ,其与类 III 聚合于 0.707;类
V兔耳兰与类 IV 在 0.688处聚合.从聚类结果可以
看出建兰和墨兰的亲缘关系最近 ,而建兰 、墨兰和春
兰这 3种兰花的亲缘关系较近.春剑 、寒兰 、独占春和
兔耳兰与类 I 的亲缘关系较远 ,这三类兰花中春剑 、
寒兰离类 I的距离最近 ,独占春其次 ,兔耳兰离得最
远.墨兰各品种间的亲缘关系十分相近 , 5个品种间
的相似系数为 0.852-0.925.建兰各品种在相似系数
为 0.765处聚合 ,品种间的遗传距离较墨兰品种间的
距离大.本研究的聚类结果与形态学分类 、同工酶和
SDS-PAGE[ 9]以及 CE-SDS[ 10] 的结果基本一致 ,但
也有些差异 ,主要体现在寒兰和春兰的分类地位上的
差异.在这点上 ,此实验的结果与同工酶和 SDS-PAGE
的实验结果一致 ,与 CE-SDS 实验结果及形态学分类
结果不同.目前用于分类最有效的还是形态学分类
法 ,而生化和分子水平的分析只能作为辅助资料[ 6] .
本实验从分子水平上印证了兰属形态学分类的结果 ,
同时也发现了与其在春兰和寒兰的分类地位上存在
不同之处.建兰 、春兰 、寒兰和墨兰到底处于分类学的
什么地位 ,还有待进一步的研究.
RAPD聚类分析结果与形态学分类结果及本实
验室生化水平上的研究结果基本一致 ,说明 RAPD技
术适用于兰属植物的系统学研究.RAPD多态性从分
子水平上揭示了基因组的差异 ,无疑将成为今后兰属
植物的育种和杂交亲本选择的重要依据.有人因
RAPD技术稳定性和重复性较差 ,且是随机扩增 ,因
图 1　四种随机引物扩增 RAPD图谱
Fig.1　Maps of RAPD products from 4 primers
1-13同表(1～ 13 Same as Table 1)M 1-λDNA/ EcoRI+Hind III , M2-PBR322DNA/ Bst I;A:S468 , B:OPC-19 , C:OPQ-01 , D:OPC-09
31　1期 文　李等:利用 RAPD技术分析兰属(Cymbidium)品种间的亲缘关系 　　
表 3　兰属 13个品种 RAPD标记的相似系数矩阵
Table 3　Matrix of similarity coefficient measures among 13 Cymbidium cultivars according to RAPD markers
2 0.747
3 0.765 0.848
4 0.700 0.658 0.671
5 0.586 0.562 0.561 0.677
6 0.598 0.584 0.610 0.624 0.634
7 0.635 0.517 0.595 0.680 0.573 0.680
8 0.678 0.618 0.634 0.707 0.720 0.688 0.707
9 0.707 0.714 0.675 0.705 0.659 0.682 0.543 0.716
10 0.734 0.708 0.659 0.667 0.613 0.656 0.613 0.720 0.795
11 0.689 0.697 0.659 0.688 0.624 0.645 0.587 0.699 0.784 0.882
12 0.632 0.674 0.646 0.677 0.645 0.624 0.627 0.688 0.761 0.849 0.871
13 0.713 0.708 0.659 0.700 0.645 0.688 0.640 0.726 0.852 0.925 0.925 0.903
样品
Samples
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
而有可能不同序列但大小相同的 DNA 片段出现在凝
胶上相同的位置 ,对其是否能应用于系统学研究表示
怀疑 ,但也有大量实验证明 RAPD技术是用于分类的
十分有效的方法之一[ 11] .目前 ,许多农作物和园林植
物上均有 RAPD在系统学研究的报道[ 12 ～ 13] .
(CS)
图 2　根据相似系数(C S)构建的兰属品种的树状图
Fig.2　Dendrogram of Cymbidium cultivars listed in
Table 1 based on similarity coefficient(CS)
　　对兰属种质资源的 RAPD多态性分析很少有报
道 ,关于它的优点与缺点的更详尽的分析还有待于更
深入的研究以及更多的统计.从本研究的聚类分析结
果来看 ,效果较好 ,用分子标记来研究物种的遗传背
景由于不受表型和环境因子的影响 ,因此比根据同工
酶和蛋白质等生化指标更为准确可靠.
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