全 文 ：文章编号:　0490-6756(2005)05-1033-05
收稿日期:2004-03-20
基金项目:中国科学院重大项目基金 KSCX2-SW-104
＊通讯作者.E-mail:y zx j@vip.163.com
中国柏木属(Cupressus L .)植物的 petG-trnP 序列
分析及其系统学意义
牟林春 ,王丽＊ ,姚丽 ,郝冰清 ,罗 勤
(四川大学生命科学学院 , 成都 610064)
摘要:对中国柏科(Cupressaceae )柏木属(Cupressus L.)5个种及扁柏属 4个种的 cpDNA非编
码区 petG-t rnP 序列进行了分析 ,其片段的长度范围在 417bp ～ 479bp 之间.以侧柏(Platy-
cladus orientalis)作为功能性外类群 ,运用 PAUP＊和 MEGA 软件分别对其进行聚类分析 ,应
用最大似然法得到一棵最优系统树 ,其-Ln=2232.47.结果表明:用 petG-t rnP 序列来分析柏
木属和扁柏属的系统发育关系是可行的;中国柏木属植物是一个单系类群;Chamaecyparis
nootkatensis与扁柏属其它植物关系较远.因此 ,柏木(Cupressus funebris)和 Ch.nootkatensis
均应并入柏木属.
关键词:柏木属;petG-trnP 序列;分子系统发育
中图分类号:Q949　　　　文献标识码:A
柏科(Cupressaceae)柏木属(Cupressus L.)是一个古老的属 ,起源于地中海地区 ,共约 17种 ,间断分布
于北美南部 、东亚及地中海地区.在我国 ,共有 9种 1变种 ,其中 4种为中国特有[ 1] .柏木(Cupressus fune-
bris(Endlicher)Franco)广布于中国秦岭及长江以南地区 ,在各地分布海拔最高限略有不同 ,喜生于温暖
湿润的各种土壤地带.干香柏(Cupressusduclox iana Hickel)产于云南中部 、西北部及四川西南部海拔
14003300m地带 ,散生于干热或者干燥山坡林中 ,或小面积成林.岷江柏(Cupressus chengiana S.Y .Hu)
产于四川西部 、北部及甘肃南部等地海拔 12002900m 的干燥阳坡.巨柏(Cupressus gigantea W.C.Cheng
&L .K .Fu)产于西藏雅鲁藏布江流域的郎县 、米林及林芝等地 ,常在海拔 30003400m 沿江地段的中下部
组成稀疏纯林.藏柏(Cupressus torulosa D.Don)除我国西藏东部及南部外 ,还分布与尼泊尔等地.巨柏 、
藏柏 、干香柏 、岷江柏 ,沿青藏高原的南部和东南部的边缘地带依次形成地理替代 ,与克什米尔柏木(Cu-
pressus cashmeriana Royle)、地中海柏木(Cupressus sempervirens L.)等在地中海地区至亚洲西部的间断分
布 ,形成一条狭窄的东 、西向分布区[ 2] .因此 ,中国柏木属植物的系统发育对解明柏属系统演化具有十分
重要的意义.
　　迄今为止 ,对于国产柏木属植物的研究仅见于形态学 、细胞地理学 、同工酶分析[ 1 , 3 , 4] ,基于 DNA水平
的分子系统学分析尚属空白.其中柏木系统位置一直较受争议 ,Dallimore和 Jackson[ 5]及郑万钧等[ 6]将其
归在柏木属中 ,但 Bailey 等(1976)[ 7]却主张将柏木由柏木属组合到扁柏属中.而形态上与柏木比较相似的
扁柏属植物 Chamaecyparis nootkatensis (D .Don)Spach ,有的研究者将其置于柏木属[ 8 ,9] ,而有的则将其
置于 Xanthocuparis属中[ 10 ,11] .因此有必要对它们的系统位置在分子水平进行新的探讨.
叶绿体 DNA具有较低的进化速率 ,已经被广泛的应用于世界陆生植物较高分类阶元系统关系的重
建中.而用一些通用引物来扩增非编码区 cpDNA序列已经成功的应用于较低分类阶元如种间和种内系统
2005年 10月
第 42卷第 5期
四川大学学报(自然科学版)
Journal of Sichuan Universi ty (Natural Science Edition)
Oct.2005
Vol.42　No.5
发育重建上[ 12～ 18] .Wang等[ 19]已经将petG-t rnP序列成功地应用于扁柏属的系统发育分析上 ,因此 ,用 cpDNA
非编码序列进行柏木属的系统发育重建及柏木和 Ch.nootkatensis的系统位置的确定具有一定的可行性.
我们对 5种中国柏木属植物及 4 种扁柏属植物的 cpDNA非编码序列 petG-trnP 基因序列进行了分
析 ,并以侧柏属为外类群 ,对其种间关系进行了探讨 ,以期对柏木属中有争议类群的系统分类提供分子证
据 ,同时也为柏木属及柏科的系统演化提供必要的分子基础.
1　材料和方法
1.1　材料
我们对柏木属 5个种 、侧柏属一个种进行了 petG-t rnP 序列的测定 ,其它扁柏属植物及侧柏材料的序
列来源于 Genebank ,用于 DNA提取的材料为新鲜的或硅胶干燥的当年生新鲜小枝.实验材料的采集信息
及凭证标本见表 1.
表 1　材料来源＊
Table 1　The origin of ma terials used in the research
Taxon Voucher Locality or Reference
C.chengiana SZ00016188 Lixian Sichuan
C.gigantean TE125896 Linzhi Xizang
C.torulosa TE1605744 Kunming Yunnan
C.duclox iana SZ00016199 Kunming Yunnan
C.f unebris SZ00016267 Kunming Yunnan
Ch.nootkatensis AF43875 Wang et al , 2003
Ch.pisi fera AF435879 Wang et al , 2003
Ch.formosensis AF435873 Wang et al , 2003
P.orientalis 1 SZ00016768 Chengdu Sichuan
P.orientalis 2 AF435896 Wang et al , 2003
　　　　　　　　＊C 代表 Cupressus;Ch 代表Chamaecyparis;P 代表Platycladus
1.2　方法
1.2.1总 DNA提取　分别取各种植物的新鲜或硅胶干燥叶片 0.1g 左右 ,采用改良CTAB 法[ 20]提取总 DNA.
1.2.2　引物设计及选择 　 petG-t rnP 序 列 的 扩 增 引 物 采 用 的 引 物 为 5 -GGTCTAATTCC-
TATAACT TTGGC-3 和 5 -GGGATGTGGCGCAGCTTGG-3 [ 21] .
1.2.3　petG-t rnP 序列的扩增和纯化　petG-t rnP 序列采用上述引物进行扩增 ,其扩增的程序如下:95℃
预变性 4min;然后 95℃变性 45s ,55℃退火 1min ,72℃延伸 1min , 40个循环;最后 72℃延伸 7min.扩增反
应在 Biorad MyCyclerTMPCR仪上进行.PCR产物经 Omega公司纯化试剂盒进行纯化后直接用于测序反
应.
1.2.4　测序反应及检测　测序工作在 ABI377 DNA测序仪上进行.每个物种的 petG-trnP 序列均用于扩
增相同的两个引物对正 、反链进行测定并校准以保证测序的准确性.
1.2.5序列分析及系统树的构建　所测定的序列用 CLUSTAL-X软件[ 22]排序后 ,手工做适当调整以尽量
减少排列所需缺隙(gap)的数目.排列好的序列以侧柏为外类群 ,用 Mega软件对序列进行统计分析 ,计算
各类群间的核苷酸差异值及差异矫正值.然后用 PAUP＊4.0(beta version 4.0b10)进行系统发育分析.以
HKY模式[ 23] 采用最大似然法(maximum-likelihood)获得最大相似性树(MLTs),所得系统树用自展法
(bootst rap法)进行检验 ,自展数据集为 1000次.
2　结果
　　研究测得 5种柏木属植物和侧柏的 petG-trnP 序列的长度为 417 ～ 478bp之间 ,与同为柏科的扁柏属
petG-trnP 序列长度相类似.序列排列后 ,对柏木属和扁柏属共 9个序列用 Mega2.0分析得到各类群间的
1034 四川大学学报(自然科学版) 第 42卷
绝对遗传距离和相对遗传距离(表 2).共对 517个位点进行了分析 ,其中稳定位点 189(36.6%)个 ,变异位
点 328个(包括 289个(55.9%)信息位点).在柏木属 petG-t rnP 内含子中 G +C含量(见表 3)在 35.9%到
37.2%之间 ,相对于大多数非编码序列其A +T 含量较高.
表 2　类群间的遗传距离＊
Table 2　Pairwise distances between taxa used in the present study
1 2 3 4 5 6 7 8 9
1 C.Chengiana 0.004 0.026 0.022 1.059 1.036 0.150 0.140 0.140
2 C.gigantean 1 0.022 0.018 1.041 1.019 0.145 0.136 0.136
3 C.torulosa 7 6 0.007 1.078 1.073 0.154 0.154 0.154
4 Ch .nootkatensis 6 5 2 1.064 1.059 0.149 0.149 0.149
5 C.ducloxiana 153 152 154 153 0.011 1.123 1.046 1.046
6 C.f unebris 152 151 154 153 3 1.16 1.079 1.079
7 Ch .thyoides 37 36 38 37 157 59 0.038 0.038
8 Ch_taiwanensis 35 34 38 37 153 155 10 0
9 Ch .obtuse 35 34 38 37 153 155 10 0
　　　　＊ Below diagonal:Absolute distances;Above diagonal:Mean distances
以侧柏为外类群 ,以 HKY模式用最大似然法(启发式搜索)共检验了 1077棵系统树 ,从中得到了一
棵最优系统树 ,其-Ln =2232.47.结果见图 1.C.nootkatensis 与柏木属的 5 个种聚为一支 ,而与 C.
nootkatensis同属的其它扁柏植物为一支 ,且支持率为 100%.另外 ,柏木属植物又分为两支 ,一支由巨柏与
岷江柏构成 ,而藏柏 、柏木 、干香柏及 C.nootkatensis构成另外一支 ,支持率分别为 71%和 91%.
附图　以侧柏为外类群 ,基于 petG-trnP序列分析得到的最大相似树(MLTs)
Fig.　Maximum likelihood tree generated from cpDNA petG-trnP sequences using
Platyclad us orientalis as outg roup
3　讨论
3.1　petG-t rnP 序列在柏木属系统学研究中的应用
petG-trnP 这一 cpDNA非编码基因间隔序列已经成功的用于柏科扁柏属[ 19] 、杉科杉木属[ 24]的系统
发育分析上.在扁柏属中 ,除去外类群 ,在 517个位点中有 113(21.9%)个可变位点 ,其中包括 41(7.9%)
个信息位点.相比较而言 ,柏木属 505个位点中可变位点 281个 ,其中包括 253个(50.1%)信息位点.故本
文应用 petG-t rnP序列来研究中国柏木属的系统发育是可行的.在本研究中 ,petG-trnP 序列提供了足够的
系统发育信息并且清晰的阐明了中国柏木属内的种间发育关系.因此 ,可以用 petG-trnP 序列来研究柏木
属的种间关系.
1035第 5期 牟林春等:中国柏木属(Cupressus L.)植物的petG-trnP序列分析及其系统学意义
表 3　各类群的 pe tG-trnP 序列长度及各种核苷酸含量＊
Table 2　The size and nucleic acid content of petG-trnP sequence of thirteen species
in Cupressus and Chamaecyparis
T(%) C(%) A(%) G(%) Size(bp)
C.chengiana 30.5 18.5 32.4 18.7 417
C.gigantean 30.6 18.2 32.4 18.9 435
C.torulosa 30.7 17.4 33.4 18.5 437
Ch .nootkatensis 31.7 17.9 31.3 19 457
C.duclo xiana 31.6 19 31.6 17.8 478
C.f unebris 32 18.1 32 17.9 469
Ch.thy oides 30.5 20.3 30.9 18.4 479
Ch .taiwanensis 31.1 18.9 30.7 19.3 476
Ch .obtuse 31.1 19.1 30.5 19.3 476
Avg. 31.2 18.5 31.6 18.8 450.6
　　　　　　　＊ C 代表 Cupressus;Ch 代表Chamaecyparis;P 代表Platycladus
3.2　中国柏木属植物的系统关系
　　Rushforth等[ 25]用 RAPD的方法探讨了东半球柏木属的系统发育关系 ,认为干香柏和巨柏组成一支 ,
而岷江柏 、藏柏 、柏木构成另外一支;而 Laurence等[ 26]通过化学分类的方法则认为岷江柏 、藏柏 、柏木 、干
香柏的亲缘关系较近 ,而巨柏则独立构成另外一支.本研究的 petG-t rnP 序列分析表明 ,中国特有的柏木
属植物是一个单系类群 ,其内部支持率为 91%,这一结果与 Rushfo rth等[ 28]和 Laurence等[ 29]的研究结果
相同.聚类分析显示 ,中国柏木属植物在系统树上分为两支 ,一支由巨柏与岷江柏构成 ,其内部支持率为
91%;而藏柏 、柏木 、干香柏及 Ch.nootkatensis构成另外一支 ,其支持率为 71%.两支都具有较高的支持
强度 ,说明系统树上各组的系统关系可信度较高 ,每一支内各个种聚在一起是自然的.该分析所得到的种
间关系与 Rushforth 等[ 25]和 Laurence等[ 26]略有不同.另外 ,Fu等[ 1]提到巨柏与藏柏在形态上具有较高的
相似性 ,可以将巨柏作为藏柏的一个变种来看待.在本研究中 ,巨柏与藏柏分别属于为两支 ,说明在分子水
平上巨柏与藏柏的亲缘关系较远 ,不支持将巨柏作为藏柏的一个变种这一看法.
3.3　柏木的系统位置
柏木由于其发育特征(球果在第二年成熟)、小枝下垂 、两面同型等形态与柏木属的相接近 ,但其生鳞
叶的小枝扁平排成平面 、球果较小且每种鳞的种子数目较少等特征与柏木属其它类群有所不同 ,比较接近
扁柏属[ 1] ,因此其分类地位一直有所争议.从 petG-t rnP序列分析结果来看 ,柏木与干香柏先聚为一支(其
boo tst rap支持率为 100%),然后与柏木属其它类群聚在一起.这一结果支持 Dallimore 等[ 5] 、郑万钧[ 6] 等
将柏木归为柏木属的观点 ,且也与李林初[ 3] 的细胞学 、Laurence等[ 26]的化学分类结果是互相支持的.另
外 ,柏木和干香柏虽然在形态上差异较大(Fu等 , 2000)[ 1] ,但在分子水平上柏木与干香柏的系统关系十
分相近 ,与 Laurence 等[ 26]用化学分类法分析的结果相一致.
3.4　Ch .nootkatensis的系统位置
　　Ch.Nootkatensis的系统位置较为混乱 ,不同的学者将其划分到不同的属:柏木属[ 8 , 9 , 27] 、扁柏属[ 28]和
Xanthocuparis属[ 10 ,11] .在本研究中 , Ch .nootkatensis首先与柏木 、藏柏 、干香柏聚为一支 ,再与巨柏及岷江
柏构成一个更大的类群 ,而与扁柏属的其它类群相隔较远.这一结果支持 Ch .nootkatensis 放入柏木属这
一观点[ 8 ,9 ,29] .但是要确切阐明 Ch.nootkatensis的系统位置则有待更进一步的研究.
致谢:本文部分材料由昆明植物所张挺提供 ,所用 PAUP ＊软件由四川大学生命科学学院何兴金教授提
供 ,在此一并表示感谢.
1036 四川大学学报(自然科学版) 第 42卷
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The Application of petG-trnP Sequence to the Systematic Study
of Chinese Cupressus Species
MU Lin-chun , WANG Li , Y AO Li , HAO Bing-qing , LUO Qin
(College of Life science , Sichuan University , Chengdu 610064 ,China)
Abstract　Chinese Cupressus comprises five species.The molecular phylogenetic relat ionships of the species
of Cupressus and Chamaecyparis were inferred by comparing 479bp of chloroplast petG-trnP intergenic spacer
sequence.In PAUP ＊ analysis , Platycladus oriental is was used as the functional outgroup , the maximum
likelihood method examined 1077 trees and found one tree w ith a best score of -Ln=2232.47.The phyloge-
netic t ree show s that Chamaecyparis nootkatensis is clearly diverged from other Chamaecyparis species.Based
on the results , together with evidence f rom o ther aspect , we consider that Cupressus funebris and Chamaecy-
paris nootkatensis should placed in genus Cupressus.Utility of cpDNA intergenic spacer petG-t rnP in Cupres-
sus is also discussed.
Keywords:Cupressus;petG-t rnP sequence;molecular phylogenetic
1037第 5期 牟林春等:中国柏木属(Cupressus L.)植物的petG-trnP序列分析及其系统学意义