全 文 ：第 37 卷 第 6期
2 0 0 4年 1 2月
实 验 生 物 学
Ac t ai Bo l
o g i e aE x Pei rm e n t ali
s
报
S i ni
丫 01 .3 7 , N 吸一 6
D e e e n l h
e l
·
2 0口4
兰属 14 种植物遗传多样性 R A P D 及 A F L P 分析 `
王慧中 沙 王 玉东 ’ ,2 周晓云 “ 应奇才 ’ 郑康乐 ’
(
’ 杭州师范学院生命科学学院生物化学与分子生物学重点实验室 , 杭州 3 10 036 ;
,浙江工业大学生物工程学院 , 杭州 3 10 0 14 ; ’ 中国水稻研究所 , 杭州 3 10 0 06)
摘要 用 RA PD 和 A F L P 技术分析了 14 种兰属植物 的遗传多样性 。 RA P D 筛选 出 12 个随机引物
和 A FL P 3 对选择性 引物组合均扩增出 了丰富的多态性 片段 。 分析结果按 U P G M A 类平均法进行
聚类 , 所得到的 R A P D 和 A F L P 聚类结果基本一致 , 显示建兰 与墨 兰 , 寒兰 与峨眉春葱以及大雪 兰
与独 占春之间的亲缘关系最近 。
关键词 : 兰属 RA P D A F L P 遗传多样性
兰属植物在我 国也被称为国兰或中国兰 , 全世
界约有 4 8 种 ,我国有 2 9 种 〔’ 〕,具有重要的药用和观
赏价值 。 目前对兰花的研究多集中于组培快繁技术
和品种分类的研究上 ,其分类主要以形态学指标为
主 , 而对细胞学 、 发育学及分子生物学的相关指标
研究较少 2j[ 。 D N A 指纹技术在研究真核生物和原核
生物的系统分类 、 发展进化和亲缘关系等方面已被
证明是一种非常有效的分子标记技术叫 。 本文利用
R A PD 和 A F LP 技术 ,在分子水平上对 14 种兰属植
物亲缘关系进行探讨 , 以求为兰属植物 的系统分类
和发育进化关系的研究 , 以及为今后兰属植物的育
种和杂交亲本的选择提供依据 。
对兰属植物的种质资源的 R A P D 多态性分析
很少有报道 。 文李等!4]用 R A PD 分析了兰属植物 5
个种 2 个变种的 13 个品种的亲缘关系 , 其结果与
形态学分类结果不完全一致 , 其中建兰和墨兰的亲
缘关系最近 , 而 A FLP 分析至今未见报道 。
1 材料和方法
L l 材料
实验所用 的 14 种材料取 自杭州市余杭区大观
山兰花种植园 (表 1 ) 。
L Z 基因组 D N A 提取
取保存于 一 7 0℃新鲜叶片约 0 . 5一 1 9 , 用 液氮研
碎 , 加人 C T AB 提取缓冲液 ( 10 Om m o l / L T r i; 一 H C I ,
2 0 m m o l / L E DAT
,
1
.
4 m o l / L Z% (
v八 ) 琉基 乙 醇 ,
2% ( W八 ) C I, A B ) , 6 5℃水浴 30m i n : 加人氯仿 /异戊醇
( 24
: l) 抽提 , 取上清液加人等体积异丙醇 , 静置
l h 或一 2 0℃过夜 ;用玻璃钩捞出絮状沉淀 ,转 人 E p -
p e n d o fr 管中 , 加人 7 0% 的乙醇漂洗 2一 3 次 ; 弃乙
醇 ,风干 DN A 沉淀 ,加人适量 T E 缓冲液溶解 , 再加
人 R Nas e A , 37 ℃ 15 m in ;用等体积苯酚 、 苯酚 / 氯仿 /
异戊醇 ( 25 : 2 :4 1 ) 、 氯仿 /异戊醇各抽提一次 , 离心
吸 上清液于 E P en do rf 管中 , 加 人 1八 0 体 积 的
N a A C 和二倍体积冷的无水乙醇 , 一20 ℃放置 1 以
上 , 10 0 0 0 9 离心 10 m i n , 用 70 % 的乙醇漂洗 D N A
沉淀 2一 3 次 ,风干后溶于 10 0闪 花 缓冲液中 。〕 用
0
.
8%琼脂糖凝胶 (含 E B 0 . 5林 g / m l) 电泳检测片段
大小 , 用 U V 一 2 4 0 1P (C 岛津 )紫外分光光度 计检测
A翻 、 A姗 值并定量 。
L 3 R A P D 分析
从 10 对随机引物 (购 自上海生工生物工程技
术公司 )中筛选出 12 个引物 。 总反应体积为 25 闪 ,
其 中 含 约 s o n g 模 板 D N A , 2 0 0林m o l / L . IN r P 、 ,
2
·
o m m o l / I
·
M g Z
+ ,
10
·
0林m o l / L 引物 , l 单位 T a g 酶 (购
自上海生 工 生 物工 程技术服务有 限公 司 ) 。 用
PE R K IN E L M E R 9 6 0 0 扩增仪进行扩增反应 , 反应
参数为 : 94 ℃预变性 3m in ; 94 ℃变性 l m in , 36 ℃复性
l m i n
,
7 2℃ l m i n , 4 0 循环 ; 7 2℃延伸 I Om i n 。 扩增完毕
用 1 . 2%琼脂糖 (含 E B .0 5协g/ m l) 电泳分离 , 在紫外
灯下用数码相机照相 。
本文 20 04 年 4 月 2 日收到 。 2 0 4 年 8 月 20 日接受
’ 浙江省自然科学基金 ( 3 0 14 0 6 ) , 浙江省 “ 巧 1” 、杭州市 “ 131 ”
人才基金资助项目。
` ’ 通讯作者 , 电话 : (0 57 1 )8 88 0 5 22 0 ; E一m a il : w h z6 @2 16 3 . o o m
6期 兰属 4 1种植物遗传多样性 R APD 及 AL F P分析
表 1材料名称
T ab le 1 M atr e ia lst e sd t e in x eP r e im en t
编号 材料名称 编号 材料名称
N
o
.
SP e e ie sN
( )
.
SP
e c i e s
l兔耳兰 C. ln a e如 li u8 m墨兰 C、 in en 、 e
2邱北冬蕙兰 C. ( li“ h e ien 、 e 9建兰 C en 、如 li u m
3春剑 C go er i卿 1v r t lo l卿b r act et a u m 10大雪兰 C m ot e o i
4春兰 C ge or in z g in 独占春 C ob uz r e lu m
5峨眉春蕙 C二娜 r e i:. r a o m e ie。 。 2 1文山红柱兰 C、 e ohn a已L Is e
6寒兰 . C人。 :n r a 13虎头兰 h C o ker in a u m
7珍珠矮 C.n n a u lo m 4 1黄蝉兰 Cr id i oid e,
1
.
4 A F L P 分析
接头与引物由上海 生工 生物工程技术服务有
限公司合成 ,预扩增引物对选用 E + A / M + C , 选用 3
对选择性引物对 E + A C T / M + e A A 、 E + A Cw M + e A e 、
E+ A C T / M + C A G 分别进行扩增 。
1
.
4
.
1 酶切连接
模 板量 约 为 2 5 0 gn , .2 5闪 10 x 酶切 缓冲 液 ,
2
·
5林1 I O X几 D N A 连接酶切缓冲液 , S U cE o R I ,
s u 肠 。 I , ZU 毛 连接酶 , SOp m o l 腼 e l 接头 , s p m o l
cE
o R I 接头 , 双蒸水补至 25 闪 。 37 ℃过夜反应后 , 于
65 ℃ I Om in 灭酶活 。 反应液置 一 20 ℃保存 , 作为预扩
增模板 。
1
.
.4 2 预扩增
取 3闪 酶切 连接产物 , 加人 7 5 n g E + A , 7 5 n g
M + C 引物 , 15m m o l / L M g , + , 2 5 m m o l / L dN Tp s , 1 单
位 Tag 酶 , 3闪 10 x P CR 缓 冲液 , 加 双 蒸水 补 至
3 0卜l 。 反应参数为 : 9 4 oC 9 0 s ; 9 4℃ 30 5 , 5 6℃ l nr i n , 7 2℃
l m i n
,
30 循环 ; 7 2℃ s n l i n 。 反应结束后 , 取 3协l 产物
释稀 2 0 倍 。
1
.
4
.
3 选择性扩增
取释稀后 的产物 3闪 , 加入 cE o R I 选择性引
物 、胜、 。 I 选 择 性 引 物各 75 gn , 15 m m ol / L M g , + ,
2 5m m o l / L dN T p s
,
l 单位 T a g 酶 , 3林1 10 x p C R 缓
冲液 , 加双蒸水补至 30 浏 。 反应参数为 : 94 ℃ 90 5 ;
9 4℃ 3 0 5 , 6 5℃ l m i n , 7 2℃ l m i n , 1 3 循环 (每循环降
0
.
7℃ ) : 9 4℃ 3 0 5 , 5 6℃ l m i n , 7 2℃ l m i n , 2 5 循环 ; 7 2℃
sm i n
。
1
.
4 .4 电泳和银染
选 择性扩增产物 中加 人等体积上样缓 冲液
( 9 8% 甲酞胺 , 10m m o l / L E D T A , 0 . 2 5% 二 甲苯青 ,
.0 25 %嗅酚蓝 ) 94 ℃变性 s m in ,结束后迅速置于冰上
直到点样 , 用 6%变性聚丙烯酞胺胶和 l x TB E 电泳
缓冲液电泳分离 。 银染程序按 rP o m ge a 公司 D N A 测
序系统技术手册中的银染方法进行 , 并有改动 。 用
数码相机拍照纪录结果 。
L S 数据分析
电泳图谱中根据分子迁移率及其有无进行统
计 : 有带计为 1 , 无带或模糊不能辩认计为 O 。 其
中 A F LP 图谱只分析用 3 对选择性引物组合扩增
后 电泳分离较清楚的条带 (分子量在 10 一 30 h p
之间 ) 。 用 N T SY S 软件计算出遗传相似性系数并
构建聚类图 , 该软件的聚类分析方法采用 u PG M A
法 。
2 结 果
12 对引物 R A PD 扩增结果共得到 2 54 条带 , 多
态 性 带有 243 条 。 扩 增产 物 多集 中 在 25 01 )p -
Zo 0 0 h p
。 其中引物 543 对样本扩增结果参见 图 1 , 各
种遗传相似系数见表 2 , 数据分析聚类图参见 图
2
。
3 对引物组合 A F廿 扩增结果得到 2 7 6 条带 ,
多态性带 2 21 条 。 其中引物组合 E+ A C T / M + C A A 扩
增结果见图 3 ,各种遗传相似系数见表 3 ,数据分析
聚类图见图 4 。
图 1 引物 5 43 扩增结果
F ig
.
1 R A P D P r o if l e s g e n e r a et d b y P r im e r 5 4 3
M
:
G
e n e
R
u
l
e r
I K b D N A l a dd e r : l 一 14 : e x p e ir n l e n t a l
s a m P l
e n u m b
e r s t h a t a r e th e s a m e a s i n *a b le 1
.
4 84王慧中 王玉东 周晓云 应奇才 郑康乐 37 卷
表 2根据A R P D标记计算的各种间遗传相似系数
Ta b le 2Ge ne tie s im i la ri ty be twe e s n Pe e ie s o n t he ba s i s o f RA P Dm a rke rs
13 2 457 69 81 1 0里 1 213 1 4
l l
2 0
.
53 01 1
3 0
.
5 2 27 0
.
53 4 21
4 0
.
4 02 2 0
.
4 88 8 0
.
5 4 821
5 0
一
5 0 0 0 0
.
3 5 03 5 5 055 0
.
57 8 01
6 0
.
43 5 8 0
.
5 4 6 4 0
一
57 0 0 0
.
5 65 1 0
.
67 41 0
7 0
.
4 64 2 0
.
497 0 0 4 623 0
.
7 9 43O
.
5 05 2 0
.
5 2 01 8
8 0
.
4 64 0 0
.
7 5 4 2 0
一
5 025 0
.
53 6 4 0557 1 0
.
5 07 3 0
.
5 13 01
9 0
.
4 8 80 0
.
47 33 0
.
5 l 6 lO
.
5 60 8O 47 9 4 0
.
5 4I 6 0
.
43 9 4 0
.
5 5 4 4 l
1 0 0
.
5 22 2 0
.
7 1 47 0
.
4 22 8 0
.
1 47 5 0
.
4 2 45 0
.
464 0 0
.
55 4 0 0
.
3 3 43 0
.
4 07 1 1
1 1 0
.
3 5 01 0
.
43 1 1 0
.
4 23 9 0
.
459 8 0
.
5 00 0 0
.
5 5 0 2 0
.
4 43 1 07 41 6 0
.
4 43 7 1 07 2] 2
1 2 0
.
4 6 85 0
.
5 27 2 0
.
3 4 6 6 0
.
49 87 0
.
7 5 17 0
.
4 824 0
.
3 4 24 0
.
5 5 0 0 0
.
45 4 0 0
.
5 2 87 0
.
5 6 83 1
3 1 0
.
47 27 0
.
3 5 85 0
.
459 0 0
.
40 86 0
.
9 1 4 4 0
.
47 61 0
.
3 885 0
.
9 4 83 0
一
7 5 4 4 0
.
5 243 0
一
3 7 5 1 0
.
3 5 81 4
1 4 01 45 0 0
.
4 86 8 0
.
4 03 2 0
.
47 67 0
.
497 1 0
`
465 8 0
.
43 7 4 0
.
4 4 8 2 0 43 47 0
.
5 0 66 0
,
4 7 7 9 0
.
4 88 0 0 569 6 1
表 3 根据 A F L P 标记计算的各种间遗传相似系数
T a b l e 3 G e n e it e 5 1而 la r ity b e tw e e n s P e e i e s o n th e b a s i s o f A F L P m a r ke r s
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 1 2 1 3 14
1 1
2 0
.
7 8 16 1
3 0
.
7 7 9 2 0
.
8 0 2 1 1
4 0
.
8 125 0
.
8 15 0 0
.
82 17 1
5 0
.
8 32 0 8 08 5 0
.
84 6 1 0
.
8 7 40 1
6 0
.
8 1 5 3 0
.
7 8 1 0 0
.
8 3 4 6 0
.
826 5 0
.
8 9 1 1 1
7 0 7 4 66 0
.
7 25 2 0
一
7 5 6 6 0
.
7 63 9 0 8 10 5 0
.
80 4 1 1
8 0
.
7 840 0
.
7 69 2 0
.
7 7 7 7 0 7 69 2 O
.
7 7 36 0
.
7 9 8 9 0
一
7 5 5 4 1
9 O
.
7 4 45 0
.
7 7 87 0
.
7 8 l 6 0
.
7 94 5 0
.
8 l 50 0
.
80 8 5 0
.
7 64 5 0
.
7 8 l 1 l
1 0 0 7 5 7 4 0
.
7 19 1 0
.
7 6 2 1 0
.
7 53 3 0
.
7 4 7 3 0
.
7 62 6 0
.
7 16 6 0
.
7 5 55 0
一
72 52 1
1 1 0
.
7 4 23 0
.
69 7 1 0
.
7 0 3 2 0
.
7 1 6 2 0
.
7 1 5 8 0
.
7 4 2 5 0 7 1 1 8 0
,
7 2 8 8 0 6 85 8 0
.
8 6 12 1
12 0
.
7 2 3 2 0
.
68 36 0
一
7 1 7 3 0
.
7 0 84 0
一
7 3 5 1 0
.
7 66 7 0
.
7 3 18 0 69 27 0
.
69 5 1 0
.
7 08 5 0
.
7 26 7 1
1 3 0
.
70 0 8 0
.
65 29 0
.
69 4 9 0 7 1 38 0
.
7 134 0
.
7 0 1 9 0
.
7 03 4 0
.
68 02 0
.
7 12 1 0
.
7 14 2 0
.
7 27 2 0
.
7 42 5 1
1 4 0
.
7 27 7 0
.
7 2 7 7 0
.
7 4 9 3 0
.
7 5 13 0 7 2 8 7 0
.
7 5 0 0 0
一
7 19 5 0
.
69 6 8 0
一
7 1 6 7 0
.
7 7 6 8 0
.
7 66 9 0
.
7 46 3 0
.
7 84 1 1
根据图 4 , 由 R A P D 技术得到的聚类图可将这
14 种兰属材料分为两类 : I 类和 n 类 。 I 类包括 1 、
10
、
1 1
、
1 2
、
1 3
、
14
,
1 类包括 2 、 3 、 4 、 5 、 6 、 7 、 8 、 9 , 其中
I 类又分为 1 和 1 0 、 1 1 、 1 2 、 1 3 、 14 。 由 A F LP 技术得
到的聚类图也可将这 14 种材料分为 I 类和 n 类 。
I 类包括 1 、 2 、 3 、 4 、 5 、 6 、 7 、 8 、 9 , fl 类包括 1 0 、 1 1 、
12
、
13
、
1 4
0
3 讨 论
在 D u P uy & cr ib b 分类系统中将独占春 、 大
雪兰划分为腋花组 ,黄蝉兰 、 虎头兰 、 文 山红柱 兰分
列在大花组 ,这两组同属大花亚属 ;将建兰 、 墨兰 、
珍珠矮分为建兰组 ,寒兰 , 春兰 、 春剑 , 峨眉春蕙 、邱
北冬蕙兰分为春兰组 , 兔耳兰列为兔耳兰组 。 吴应
祥将春兰划为春兰组 , 建兰 、寒兰 、春剑和墨兰划为
蕙组的小花亚组 ,独占春划为大花亚组 s[] 。 我们得到
的 R A P D 和 A F LP 聚类结果显示建兰与墨兰亲缘关
系最近 ,寒兰与峨眉春蕙 、 春兰 、 春剑 、 邱北冬蕙兰
聚为一类 , 其中寒兰与峨眉春蕙亲缘关系最近 , 与
春兰稍远 ;独占春与大雪兰亲缘关系最近 , 首先聚
在一起 , 而与黄蝉兰 、虎头兰 以及文山红柱兰都较
远 。 这与 D u p u y & C r ib b分类比较一致。 叶庆生等 [6 j利
6 期 兰属 4 1种植物遗传多样性 P D R A及L F P A分析
!
F A任 34 562 98 70 11ll 3l 42 I0 . 0 7
C o ef i
e
in et
0名 50 0 10刀0 0 7 7住8 5
(二 o ef i` in et
图 2
F i g
·
2 P U G M A
mr a kr e s
P D R A标记的 UP G M A聚类图 AFL P 标记的 P U G M A聚类图
d en d
r o gr a m s g en r e at edfr o mP R ADF ig
.
4
图 4
P U GN IA
mr a k er s
d en dr o gr a m s g en r e at
e
dfr o mL F AP
0 0 3b P
2 0 b P 5
2 0 0 b P
1 50 b P
P D R A和L F P A分析结果表明建兰与墨兰亲缘关系
最近 ,而珍珠矮与它们并不聚为一类 。 在兔耳兰的
位置划分上 , A FL P 结果将其与建兰亚属植物划分
在 一起 , 这与 D u P uy & Cr ib b 分类系统接近 , 而
R A P D 结果显示其与大花亚属材料并 为一类 。 张明
永等川对兰属 27 种 、 3 个栽培品种 的 D N A IT S 区段
序列分析显示 : 兔耳兰偏离出去成为兰属植物最基
部一分支 。 这些差别表明对兔耳兰的系统分类定位
还有待进一步研究 。
另外由上述可见 , 虽然 R A PD 和 A F L P 两种标
记技术所得数据有所差别 , 但其分析结 果基本一
致 ,且与 D u uP y & Cr ih 分类系统基本一致 ,表 明
两种方法皆可用于兰属植物遗传多样性评估 。 兰属
种 内材料正在收集当中 , 下一步将结合种 间差异 ,
进一步开展种内遗传多样性分析 。
1 0 0 b P 参 考 文 献
图 3 引物对 E + A C T / M + C A A 扩增结果
F ig
·
3 A F L P 6 n g e r P r i n t us in g P r im e r e o m P a r is o n o f E +
A C T / M + C A A
.
M : D NA la n d e r ; 1一 14 : e x p e r in m e t a l s a m p le n u m b e r s th a t
a er th e s a m e a s in t a h le 1
.
用同工酶和 SD S一 P A G E 技术分析也得出建兰 与墨
兰亲缘关系十分相近 ,寒兰与这两种兰花相距较远
的结果 , 与我们的结果一致 。在 D u Puy & C ir b h 分类
系统中将建兰 、 墨兰 、 珍珠矮同分为建兰组 , 而
仁1 〕陈心启 、吉占和 , 20 00 ,中国兰花全书 , 第二版 北京 : 中
国林业出版社 , 72 一75 。
〔2 〕李玉阁 、 郭卫红 、 吴伯骥 , 2 002 , 国产七种和一变种兰属
植物的核型研究 。 植物分类学报 , 4 0( 5) : 4 0 6一 4 1 3
〔 3 ] S p o o n e r , D . M . , J . T iv a n g , J . N ie n h u i s , J . T . M il le r , D . S
D o u c h e ; & M
.
A
.
C
o n e er ar s
,
19 96
,
C
o m p a ir s o n o f of
u r
m o l e o u la r m a r k e r s in m e a s u r in g r e la t io n s h ip s 翻 o n g t h e
初 l d P o t a t o re la t iv e s S o l an u , n s e o t io n E r o b e o u m (s u b -
g e n u s P
o tat o e )
·
hT
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A尸尸.1 G e n e t , 9 2 : 5 32一5 4 0 .
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