全 文 ：中国蔬菜　2009 (10):7-12
CHINAVEGETABLES
收稿日期: 2009-02-09;接受日期: 2009-03-03
基金项目:国家科技支撑计划 (2006BAD13B06, 2008BADB1B03)
作者简介:扈新民 , 硕士研究生 , 专业方向:蔬菜遗传育种 , E-mail:hxm821219@ 126.com
＊通讯作者 (Corespondingauthor):李锡香 , 研究员 , 博士生导师 , 专业方向:蔬菜种质资源 , E-mail:lee0612@sina.
com.cn
甘蓝与萝卜属间杂交及其胚挽救技术优化
扈新民 1, 2　李锡香 2＊　梁　燕 1　方智远 2　沈　镝 2　邱　杨 2
(1西北农林科技大学园艺学院 , 陕西杨凌 712100;2中国农业科学院蔬菜花卉研究所 , 北京 100081)
摘　要:以甘蓝显性雄性不育系 C08-11为母本 , 以萝卜自交系 Q07-12为父本进行属间杂交 , 对杂交
子房和胚珠进行离体培养 , 筛选适合甘蓝与萝卜属间杂种胚挽救的适宜取材时间 、 培养基及外源添加物。 结
果表明 , 胚珠培养优于子房培养;所有处理子房培养仅获得 3株杂交苗 , 取材时间以授粉后第 9天为宜 , B5
培养基中添加合适的生长调节剂 、 水解酪蛋白和活性炭为子房培养所必需;胚珠培养各处理共获得 29株杂交
苗 , 适宜取材时间为蕾期授粉后第 14天 、 花期授粉后第 16天 , 对生长调节剂的需求取决于不同取材时期及
培养基。
关键词:远缘杂交;子房培养;胚珠培养;属间杂种
中图分类号:S635.1　　文献标识码:A　　文章编号:1000-6346 (2009)10-0007 -06
OptimizationofTechnologyforEmbryoRescueinDistantHybridization
betweenCabbageandRadish
HUXin-min1, 2 , LIXi-xiang2＊ , LIANGYan1 , FANGZhi-yuan2 , SHENDi2 , QIUYang2
(1ColegeofHorticulture, NorthwestA＆FUniversity, Yanglin712100, Shaanxi, China;2InstituteofVegetablesandFlowers,
ChineseAcademyofAgriculturalSciences, Beijing100081, China)
Abstract:Thedistanthybridizationbetweendominantmalesterilelineofcabbage`C08-11 and
radishinbredline`Q07-12 wasmadeinthisexperiment.Throughinvitrocultureofcross-bredovary
andovuleatdiferentdevelopmentalstages, theappropriatesamplingtime, culturemediumandadditives
fortheembryorescueindistanthybridizationbetweencabbageandradishwerestudied.Theresultswereas
folows:ovuleculturewasobviouslybeterthanovaryculture.Byovarycultureonly3 hybridseedlings
weregotenandthesuitabletimefordetachingovarywas9daysafterpolination.Addinggrowthregulators
(6-BA, NAA), caseinacidshydrolysateandactivatedcharcoalinbasicmediumB5 wasnecessaryfor
ovaryculture.Byovuleculture, 29 hybridseedlingsweregotenandtheappropriatetimefordetaching
ovulewasrespectively14 daysafterbudpolinationand16 daysafterflorescencepolination.Whether
addinggrowthregulatorornotdependedonthesamplingperiodandculturemediumforovuleculture.
Keywords:Distanthybridization;Ovaryculture;Ovuleculture;Inter-generichybrid
在蔬菜作物遗传育种中 , 由于长期的品种间杂交和人工选择 , 育种亲本材料的遗传背景日渐
狭窄 , 栽培品种的遗传多样性明显降低 。为了拓宽育种材料的遗传背景 , 许多学者将物种间的远
中 国 蔬 菜　CHINAVEGETABLES 2009年 5月 (下)
缘杂交作为主要手段 。由于远缘杂交具有较强的杂交不亲和性或不稔性 , 常规人工杂交较难获得
成功 〔1-2〕。在十字花科作物中 , 研究人员通常利用胚挽救技术克服远缘杂交中幼胚死亡或败育的
问题 。赵德培 〔3〕利用胚珠培养在改良式 H培养基上获得萝卜 ×大白菜属间杂种 9株 , 但子房培养
没有得到杂种 。陈树忠等 〔4〕利用子房培养在添加 6-BA和 NAA的 B5培养基上得到甘蓝型油菜 ×
羽衣甘蓝杂种 3株。方智远等 〔5〕用萝卜雄性不育系与甘蓝杂交 , 通过幼胚培养得到胞质雄性不育
杂种 , 其中 48A×甘蓝杂种获得频率为 0.15%, 262A×甘蓝杂种获得频率为 0.41 % 〔杂种获得
频率 = (杂种株数 /杂交花朵数) ×100 %〕。程雨贵〔6〕通过萝卜和甘蓝正反交 , 发现以萝卜为母
本 , 平均每杂交 100朵花仅获得真杂种 3.9株 , 以甘蓝为母本 , 杂种获得频率为 0, 而通过胚培养
技术使甘蓝 ×萝卜的杂种获得频率由 0提高到 1.0 %, 但在子房培养中没能得到杂种 。
目前 , 在远缘杂交胚挽救中普遍存在的问题是杂种获得频率不高 , 而且不同的种间或属间的
胚挽救尚无共性技术可借鉴。萝卜和甘蓝是十字花科中的重要栽培作物 。为了提高甘蓝 ×萝卜远
缘杂种的获得频率 , 促进两属作物间的优异基因交流 , 本试验以甘蓝显性雄性不育系为母本 , 以
萝卜优异自交系为父本 , 通过对不同发育阶段的杂交子房和胚珠在不同培养基上的离体培养 , 筛
选出适合甘蓝与萝卜属间远缘杂交胚挽救的优化技术 。
1　材料与方法
1.1　试验材料
甘蓝 (Brasicaoleraceavar.capitata, 2n=18 , CC)显性雄性不育系 C08-11由中国农业科学
院蔬菜花卉研究所方智远院士提供;萝卜 (RaphanussativusL., 2n=18, RR)自交系 Q07-12由
中国农业科学院蔬菜花卉研究所种质资源室创制 , 抗黑腐病和病毒病。
1.2　试验方法
试验于 2008年 4月在中国农业科学院农业环境与可持续发展研究所试验大棚内进行 , 甘蓝与
萝卜分别与其他作物隔离种植 , 常规栽培管理 。以甘蓝显性雄性不育系 C08-11为母本 , 以萝卜
自交系 Q07-12为父本配制属间杂交组合 , 蕾期套袋 , 人工授粉 。于杂交前 2 ～ 3 d摘除父 、 母本
花序上已开放的花朵 , 套袋隔离 。于套袋父本开花当天取花药 , 对母本植株上新开放的花朵直接
授粉 , 同时对母本植株上 3 mm左右的花蕾进行剥蕾授粉 。授粉后套袋隔离 , 严格控制父本以外
的花粉污染 。杂交后分别取材进行子房培养和胚珠培养 , 对获得的属间杂种苗进行鉴定 。
1.2.1　子房培养　分别剪取花期和蕾期授粉后 5、 7、 9、 11 d的子房 ,用 70%酒精浸泡 0.5 ～
表 1　子房培养培养基成分
处理 基本培养基
6-BA
mg· L-1
NAA
mg· L-1
水解酪
蛋白 /%
活性
炭 /% 处理
基本
培养基
6-BA
mg· L-1
NAA
mg· L-1
水解酪
蛋白 /%
活性
炭 /%
B0 B5 0 0 0 0 B13 B5 0 0.2 0.5 0.5
B1 B5 0 0.2 0 0 B14 B5 1 0.2 0.5 0.5
B2 B5 1 0.2 0 0 B15 B5 2 0.2 0.5 0.5
B3 B5 2 0.2 0 0 B16 B5 3 0.2 0.5 0.5
B4 B5 3 0.2 0 0 B17 B5 0 0.5 0.5 0.5
B5 B5 0 0.5 0 0 B18 B5 1 0.5 0.5 0.5
B6 B5 1 0.5 0 0 B19 B5 2 0.5 0.5 0.5
B7 B5 2 0.5 0 0 B20 B5 3 0.5 0.5 0.5
B8 B5 3 0.5 0 0 B21 B5 0 1.5 0.5 0.5
B9 B5 0 1.5 0 0 B22 B5 1 1.5 0.5 0.5
B10 B5 1 1.5 0 0 B23 B5 2 1.5 0.5 0.5
B11 B5 2 1.5 0 0 B24 B5 3 1.5 0.5 0.5
B12 B5 3 1.5 0 0
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2009 (10) 扈新民等:甘蓝与萝卜属间杂交及其胚挽救技术优化
1.0 min, 再用 10 %次氯酸钠消毒 10 ～ 15 min, 然后用无菌水冲洗 4次 , 每次 5 min, 最后接种在
不同的培养基上 。试验所用培养基为 B5基本培养基 +0.8 %琼脂 +50 g·L-1蔗糖 , 再附加不同种
类和浓度的外源添加物 (表 1), 每处理接种 3个子房 , 3次重复 。供试子房总数为 1 800个 。接
种子房的三角瓶置于温度 (24±2)℃、 光照强度 1 500 lx、 每天光照 12 h的环境中培养 。接种 36
d后统计每处理膨大子房数 、 获得的种子数。
表 2　胚珠培养培养基成分
处理 基本培养基 6-BA/mg· L-1 NAA/mg· L-1
M0 MS 0 0
M1 MS 2.0 0.2
M2 1/2MS 0 0
M3 1/2MS 2.0 0.2
M4 MS 1.0 0.1
1.2.2　胚珠培养　分别取授粉后 14、 15、 16、
17、 18、 20、 22、 24、 30 d的子房 , 采用与子
房培养相同的消毒方法 , 在无菌条件下剥取胚
珠 , 接种在表 2所示的不同培养基上。每处理
接种 6个胚珠 , 3次重复 。共用子房 312个 , 接
种胚珠 1 620个 。培养条件同子房培养 。接种 7
d后开始调查胚珠出苗情况 。
2　结果与分析
图 1　水解酪蛋白和活性炭对甘蓝 ×萝卜
离体子房培养的影响
　　A—未添加水解酪蛋白和活性炭的培养基;
B—添加水解酪蛋白和活性炭的培养基。
2.1　子房培养
2.1.1　外源添加物对甘蓝 ×萝卜离体子房发育的影响
　在未添加水解酪蛋白和活性炭的培养基 (B0 ～ B12)
上 , 子房逐渐萎缩 , 甚至停止生长 , 愈伤组织分化严
重;而在添加水解酪蛋白和活性炭的培养基 (B13 ～
B24)上 , 子房没有形成愈伤组织 , 且都能伸长 、 膨大
(图 1)。
表 3　培养基对杂交子房发育的影响
培养
基
花期授粉
角果长 /mm 角果直径 /mm
蕾期授粉
角果长 /mm 角果直径 /mm
B13 37.21±8.37 3.56±0.49 31.92±4.60 3.52±0.69
B14 35.02±8.97 3.47±0.50 32.12±4.83 3.42±0.74
B15 33.12±7.26 3.46±0.79 31.49±5.20 3.38±0.60
B16 35.54±7.11 3.51±0.67 31.32±3.89 3.37±0.66
B17 36.75±8.72 3.44±0.56 31.44±4.55 3.36±0.57
B18 35.50±9.47 3.60±0.61 30.14±6.78 3.28±0.59
B19 42.40±11.75 3.88±0.53 31.40±5.97 3.49±0.73
B20 39.10±9.67 3.74±0.60 30.29±6.38 2.95±0.58
B21 38.52±8.52 3.54±0.50 30.98±8.35 3.31±0.64
B22 39.02±8.12 3.70±0.63 30.23±5.79 3.33±0.58
B23 36.39±9.41 3.65±0.53 32.11±5.37 3.44±0.50
B24 37.91±11.52 3.69±0.69 28.38±7.38 3.52±0.80
2.1.2　授粉和取样时间以及培养基对甘蓝 ×萝卜离体
子房发育的影响　在添加水解酪蛋白和活性炭
的培养基 (B13 ～ B24)上 , 子房从接种后第 7
天开始伸长 、 膨大 , 到接种后 15 d左右基本都
伸长 、 膨大 。对不同培养基上培养 36 d的子房
大小进行分析 , 发现角果长和角果直径差异不
显著 (表 3)。这说明在子房培养中所选培养基
对子房的生长影响不明显 。
值得注意的是 , 经离体培养 , 大部分子房
虽能膨大 、 伸长 , 但实际上大多空瘪 、 无种子。
在培养 36 d的子房中 , 仅在培养基 B15、 B17、
B18、 B20、 B24上培养的子房中各得到一粒饱
满种子 。其中在培养基 B17、 B18上的为蕾期
授粉子房 , 其他为花期授粉子房 。将所得种子
直接接种到 MS培养基上 , 仅授粉后 9 d取样的
子房在 B15、 B18、 B20培养基上膨大 , 由其得到的种子发芽出苗 。所以子房培养较合适的取样时
间为授粉后第 9天。授粉后花期和蕾期结荚率分别为 67.49 %和 60.61 %, 其花期和蕾期杂种获
得频率分别为 0.31 %和 0.14 %。
2.1.3　生长调节剂对甘蓝 ×萝卜离体子房发育的影响　试验结果表明 , 在基本培养基 B5中添加
6-BA对子房培养具有一定的促进作用 。但过低浓度 (1.0 mg· L-1)6-BA的培养基 (B18)上
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中 国 蔬 菜　CHINAVEGETABLES 2009年 5月 (下)
得到的种子发芽 10 d左右就死亡;过高浓度 (3.0 mg· L-1)6-BA的培养基 (B20)上得到的
种子发芽形成的幼苗长势很弱;只有在 6-BA浓度为 2.0 mg· L-1的 B15培养基上得到的种子发
芽形成的幼苗长势良好 (图 2)。 NAA浓度太高不利于子房培养 , 适宜浓度为 0.2 ～ 0.5 mg· L-1。
图 2　甘蓝 ×萝卜离体子房获得种子的发芽情况
A—培养基 B20上子房培养获得种子的发芽情况;B—培养基 B15上子房培养获得种子的发芽情况;C—培养基 B18上子房培
养获得种子的发芽情况。
2.2　胚珠培养
从表 4可以看出 , 在添加低浓度生长调节剂的培养基 (M4)上胚珠出苗数最多;其次是不添
加生长调节剂的 1 /2MS培养基 (M2)和添加较高浓度生长调节剂的 MS培养基 (M1);在 MS培
养基 (M0)和添加较高浓度生长调节剂的 1 /2MS培养基 (M3)上的出苗情况最差 。
表 4　不同取材时间和培养基对胚珠出苗数的影响
授粉类型 培养基 胚珠出苗数 /株
14d 15d 16d 17d 18 d 20d 22d 24d 30d 合计
花期授粉 M0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 11
M1 0 2 2 0 1 0 0 0 1 6
M2 0 0 0 0 1 1 0 0 0 2
M3 0 0 0 0 0 1 0 0 0 1
M4 2 0 5 1 0 0 0 0 0 8
蕾期授粉 M0 0 0 0 0 0 1 1 0 0 2
M1 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1
M2 4 0 0 0 0 1 0 0 0 5
M3 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
M4 1 0 0 0 0 2 0 0 0 3
通过对花期和蕾期授粉的比较 , 发现在添加生长调节剂的培养基上 , 花期授粉胚珠出苗率好
于蕾期授粉 , 在不添加生长调节剂的培养基上则相反 。对胚珠培养而言 , 取材时间很重要 , 必须
在胚珠发育到一定时期但未开始退化前取样 , 才能取得较好的效果 。本试验花期授粉最适宜的取
样时间为授粉后第 16天 , 蕾期授粉最适宜的取样时间为授粉后第 14天 。
从胚珠培养获得的幼苗长势上看 (图 3), 大多花期授粉胚珠培养的幼苗长势优于蕾期授粉 ,
在培养基 M4上花期授粉胚珠培养得到的幼苗生长正常 、 健壮 , 且株形整齐;在培养基 M2上花期
授粉胚珠培养得到的幼苗长势较好;蕾期授粉材料在培养基 M2上生长最佳 , 而在培养基 M4上分
化较严重;在培养基 M1上幼苗分化严重 , 而在培养基 M0上得到的幼苗过早生根 , 致使根茎叶生
长不平衡 , 在培养基 M3上仅从花期授粉材料中得到 1株苗 , 且幼苗茎叶不分 , 黄化严重 。
总的来看 , 甘蓝与萝卜的杂交胚珠离体培养在杂种获得频率上明显优于子房培养 , 所有处理
共获得 29株苗 。其中 , 以花期授粉后第 16天取样 , 胚珠在 M4培养基上成苗数最多;蕾期授粉后
第 14天取样 , 胚珠在 M2培养基上成苗较多 。换言之 , 花期授粉胚珠适宜在 MS培养基上培养 ,
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2009 (10) 扈新民等:甘蓝与萝卜属间杂交及其胚挽救技术优化
添加激素对胚珠发育有利 , 且低浓度激素优于高浓度;蕾期授粉胚珠适宜在 1 /2MS培养基上培养 ,
以不添加激素的培养基较好。成苗最好的处理 , 按授粉花数计算 , 其杂种获得频率达到 17.3%。
图 3　甘蓝 ×萝卜花期和蕾期杂交胚珠在不同培养基上的成苗情况
图中均为转接在 MS培养基上的幼苗。 M0-A和 M0-B:花期和蕾期授粉离体胚珠在培养基 M0上长成的小苗;M1-A和 M1-
B:花期和蕾期授粉离体胚珠在培养基 M1上长成的小苗;M2-A和 M2-B:花期和蕾期授粉离体胚珠在培养基 M2上长成的小苗;
M3-A:花期授粉离体胚珠在培养基 M3上长成的小苗;M4-A和 M4-B:花期和蕾期授粉离体胚珠在培养基 M4上长成的小苗。
2.3　培养基对属间胚珠培养获得的杂种幼苗生长的影响
将胚挽救所获得的幼苗分别转接到 MS和 B5培养基上 。观察发现 , 转接到 MS培养基上的幼
苗生长健壮 , 但不能生根 。转接到 B5培养基上的幼苗生长相对较弱 , 下胚轴细长 , 但能同时长出
大量的根。将转接到 MS培养基上生长的幼苗分别移入生根培养基 RI(1/2MS+IBA0.15 mg·
L-1)和 RN(MS+NAA0.2 mg· L-1)上生根 , 发现在培养基 RI上幼苗生长 7 d左右就可以生
根 , 但生根较少且弱 , 在培养基 RN上幼苗需要生长 10 d左右才可以生根 , 但生根多且粗壮 。由
此可见 , 杂种幼苗转接到 MS培养基较适宜。
3　结论与讨论
子房培养在十字花科作物远缘杂交中应用较广 , 但是在不同的种间或属间杂交采用不同培养
方法时成功率不同。李琳等 〔7〕将不同组合甘蓝型油菜 ×诸葛菜的杂交子房在不同培养基上培养 ,
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在 Nitsch培养基上接种 392个子房 , 杂种获得频率为 0, 在 MS和 B5培养基上分别接种 730个和
300个子房 , 杂种获得频率分别为 0.13 %和 0.26 %。本试验中授粉后花期和蕾期结荚率分别为
67.49 %和 60.61 %, 甘蓝 ×萝卜杂交子房培养共得到 3株苗 , 其花期和蕾期杂种获得频率分别
为 0.31 %和 0.14 %, 该结果高于油菜 ×诸葛菜的杂种获得频率和程雨贵等 〔8〕在甘蓝 ×萝卜子房
培养杂种获得频率 (0)。本试验亦表明 , 在杂交子房离体培养中 , 水解酪蛋白和活性炭可以有效
地抑制子房愈伤组织分化 , 促进子房的生长发育 。授粉后剪取子房的时间和培养基成分都明显影
响子房培养的效果。所以 , 尽管子房培养作为胚挽救的效果有限 , 但针对不同作物优化子房培养
技术仍有一定空间。
Harberd〔9〕采用离体胚培养获得甘蓝 ×白菜杂种 , 而且发现影响杂交胚珠培养的因素是多方面
的 , 其中胚龄大小对胚珠培养的影响较大 , 一般来说胚龄越小则要求培养的条件越复杂 。 Takeshi-
ta等 〔10〕利用胚珠培养获得油菜和萝卜的属间杂种 , 并指出用芸薹属作母本时 , 采用胚珠培养在产
生杂种的频率方面优于胚培养和子房培养。程雨贵 〔6〕利用离体胚培养技术 , 使甘蓝 ×萝卜的杂种
获得频率达到 1.0 %。本试验胚珠培养花期和蕾期授粉的各处理杂种获得平均频率分别为 7.79 %
和 4.27 %, 在优化的培养基 MS+6-BA1.0 mg· L-1 +NAA0.1 mg· L-1上 , 胚珠培养最优处
理 , 花期授粉杂种获得总频率可达 17.3 %。可见利用优化的胚珠培养技术可使有关种属间远缘杂
种获得频率得到明显提高 。
在本试验胚珠培养中 , 花期授粉的最佳取样时间为授粉后第 16天 , 蕾期授粉的合适取样时间
为授粉后第 14天 。过早或过晚取样的胚珠培养成活率明显下降 , 过早不易成功的原因可能是雌雄
配子的受精结实能力较差;过晚不易成活可能是由于此时异源遗传物质的导入致使胚珠内遗传不
协调 , 使胚胎逐渐退化 。
本试验还表明 , 蕾期授粉的胚珠培养在未添加激素的培养基上出苗率要高于相应处理的花期
授粉 , 而在添加激素的培养基中结果相反 , 其原因可能是蕾期杂交胚珠代谢尚处平衡状态 , 而花
期杂交胚珠因外来遗传物质的导入而导致其代谢不平衡 , 需要外源物质的调节。在未添加激素的
培养基上 , 用 1/2MS培养基进行胚珠培养的效果明显优于 MS培养基 。这说明较低浓度的氨态氮
和硝态氮可能为胚珠中胚的生长提供了更适宜的生长条件 。在不添加激素的培养基上获得幼苗说
明添加激素并非是胚珠培养的必要条件。
在本研究的田间试验中 , 属间花期和蕾期人工授粉分别获得角果数 282个和 283个 , 得到饱
满和半饱满种子数为 6粒和 3粒 , 而且所获得的种子全部没有萌发 。试验证明胚挽救在克服甘蓝
与萝卜属间杂交不亲和性方面具有一定意义 。甘蓝与萝卜属间杂种的获得 , 为属间基因的交换 ,
特别是为创造萝卜显性雄性不育系提供了原始材料 。
参考文献
〔1〕 　朱媛 , 林良斌.甘蓝型油菜和芸芥属间杂交的亲和性研究 〔J〕.中国农学通报 , 2005, 21 (12): 173-174, 189.
〔2〕 　刑少辰 , 周开达 , 蔡玉红.植物远缘杂交的研究 〔J〕.吉林农业科学 , 2000, 25 (4): 18-21.
〔3〕 　赵德培.通过组织培养获得萝卜与大白菜的属间杂种 〔J〕.实验生物学报 , 1983, 16 (1):21-26.
〔4〕 　陈树忠 , 殷家明 , 唐章林.甘蓝型油菜与羽衣甘蓝远缘杂交初步研究 〔J〕.西南农业大学学报 , 2000, 22 (3): 208-
210.
〔5〕 　方智远 , 孙培田 , 刘玉梅.萝卜与甘蓝远缘杂交研究初报 〔J〕.园艺学报 , 1983, 10 (3):187-191.
〔6〕 　程雨贵.萝卜和甘蓝属间杂种的创建和研究 〔D〕.武汉:华中农业大学 , 2006.
〔7〕 　李琳 , 蓝泽蘧 , 陈祥荣.影响甘蓝型油菜与诸葛菜远缘杂交结实率的几个因素 〔J〕.中国油料 , 1987, 19 (4): 5-6.
〔8〕 　程雨贵 , 吴江生 , 陈洪高 , 张明海.萝卜和甘蓝远缘杂交研究 〔J〕.中国油料作物学报 , 2006, 28 (1):1-6.
〔9〕 　HarberdDJ.AsimpleefectiveembryoculturetechniqueforBrasica〔J〕.Euphytica, 1969, 18:425-429.
〔10〕 　TakeshitaM, KatoM, TokumasuS.ApplicationofovuleculturetotheproductionofintergenericorinterspecifichybridsinBrassica
andRaphanus〔J〕.JapanJGenetics, 1980, 55 (5): 373-387.
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