全 文 ：基于 PCR-RFLP多态的部分菊属
与亚菊属植物亲缘关系研究
吴国盛 , 陈发棣 , 陈素梅 , 赵宏波 , 房伟民
(南京农业大学园艺学院 ,江苏南京 210095)
　　摘要:运用 PCR-RFLP技术对 12份菊属与 2种亚菊属植物进行了亲缘关系研究。结果发现 , 菊属与亚菊
属植物的 rbcL-EcoRⅡ 、rbcL-MspⅠ 、ndhF-HinfⅠ 、petA-MboⅠ酶切片段均无长度多态性 ,而 petA-MboⅡ酶切
结果显示 A.pacifica、A.shiwogiku的酶切图谱不同于其他菊属植物 , 表明菊属物种间有很近亲缘关系 , 且菊属与
亚菊属间亲缘关系也很近 ,但仍存在差异。
　　关键词:菊属;亚菊属 、PCR-RFLP;亲缘关系
　　中图分类号:S682.1　　文献标志码:A　　文章编号:1002-1302(2008)02-0058-04
收稿日期:2007-09-24
基金项目:国家自然科学基金(编号:30400308);上海市农委重点攻
关项目(编号:沪农科攻字 2006-4-3)。
作者简介:吴国盛(1983—),男 ,湖北武汉人 ,硕士研究生 ,研究方向
为花卉遗传育种。 E-mail:wgsavav2000@163.com。
通讯作者:陈发棣 ,博士 ,教授 ,博士生导师 , 研究方向为花卉遗传育
种。 Tel:(025)84395231;E-mail:chenfd@njau.edu.cn。
　　菊属植物以染色体基数 9组成一个多倍体系列
(2n=18 ～ 90),物种间存在广泛的基因渗入和基因
漂移[ 1-2] 。许多物种分布交叉 、性状重叠 、有很好的
杂交亲和性 、大量的属间或种间天然或人工杂种的
存在等 ,使得传统分类方法难以对菊属和亚菊属物
种进行界定 ,迄今为止其分类地位和种属间关系仍
存在很多争议。 PCR技术的诞生使我们极易获得
目的基因 ,进而进行 RFLP分析 ,免去了进行 South-
ern杂交过程 DNA转移 、探针标记 、杂交及检测等繁
琐的实验步骤。 PCR-RFLP分析成本低廉 ,耗时
少 ,是非常有效的分子系统学研究手段 ,为植物亲缘
关系研究提供了一条新的途径 [ 3] 。运用该技术已
经对许多观赏植物成功进行了系统发生与亲缘关系
研究 ,如月季 [ 4] 、常绿杜鹃[ 5] 、百合 [ 6]等。
利用其他分子标记技术对菊属植物进行亲缘关
系的研究已有若干报道[ 7-9] ,但利用 PCR-RFLP技
术对菊属进行系统发生关系研究的报道还较少 [ 10] ,
对菊属和亚菊属间关系研究尚未见报道。本研究利
用 PCR-RFLP方法对部分菊属和亚菊属植物进行
亲缘关系分析 ,探讨 PCR-RFLP方法用于两属植
物亲缘关系研究的可行性 。
1　材料与方法
1.1　试验材料
供试材料为南京农业大学中国菊花种质资源保
存中心保存的 12份菊属植物 、2份亚菊属植物(表
1)。取嫩叶 ,置冰盒中带回实验室 ,液氮速冻后置
超低温冰箱保存备用。
1.2　研究方法
采用略加修改的 CTAB法[ 11]提取供试菊属与
亚菊属植物基因组 DNA。叶绿体基因 rbcL、ndhF和
petA片段的 PCR扩增均采用 25 μl反应体系:100
ng模板 DNA, 正向反向引物各 500 pmol/L, 200
μmol/LdNTP, 1单位 ExTaqDNA聚合酶 (TaKaRa,
Tokyo, Japan)和 2.5 μl10×Bufer(含 Mg2+),用
双蒸水补齐至 25 μl。 PCR扩增引物见表 2。 PCR
扩增在 PTC-100 PCR仪 (MJResearch, Waltham,
USA)上进行。 rbcL基因的 PCR反应条件为:95 ℃
预变性 5min;30个循环 ,每个循环包括 94 ℃变性
45 s, 56.5℃退火 1 min, 72 ℃延伸 2min30 s;最后
在 72℃下保温 10min。ndhF和 petA的扩增除退火
温度分别为 48 ℃和 62 ℃、72 ℃延伸时间分别为 3
min和 2 min30 s外 ,其他反应条件同 rbcL基因扩
增。扩增产物用 1.5%的琼脂糖凝胶电泳检测 。
酶切反应过程:(1)取 5 μl上述 PCR扩增产
物;(2)按各限制性核酸内切酶使用说明依次加入 2
μl10×Bufer, 1 μl限制性核酸内切酶及其他辅助
溶液(BSA等),之后用双蒸水补足 20μl反应体系 ,
混合均匀;(3)37℃下酶切 16h;(4)酶切产物用
3%的琼脂糖凝胶电泳检测 。本研究使用的限制性
—58— 江苏农业科学　2008年第 2期DOI :10.15889/j.issn.1002-1302.2008.02.048
表 1　供试材料及其 PCR扩增产物
代号 材　料 种　名 PCR扩增产物
rbcL ndhF petA
1 野菊 D.indicum(L.)DesMoul.
2 神农架野菊 D.indicum(Shennongjia)
3 毛华菊 D.vestitum(Hemsl.)Ling
4 河南毛华菊 D.vestitumvar.lanceifolium
5 菊花脑 D.nankingense(Hand.-Mazz.)Y.R.Ling
6 小红菊 D.chaneti(Levl.)Shih
7 甘菊 D.lavandulifolium(Fisch.exTrautv.)LingetShih
8 紫花野菊 D.zawadski(Herbich)Tzvelev
9 异色菊 D.dichrumShih
10 杭白菊 D.×grandiflorum“Hangbaiju”
11 银星 D.×grandiflorum“Yinxing”
12 神马 D.×grandiflorum“Shenma”
13 矶菊 A.pacifica(Nakai)K.Bremer＆Humphries
14 盐菊 A.shiwogiku(Kitam.)K.Bremer＆Humphries
　　注:“ ”为有效扩增。
表 2　3个叶绿体基因片段的 PCR扩增引物序列
基因
名称 引物名称 引物序列(5′※ 3′) 引物来源
rbcL rbcL-forTCACCACAAACAGAGACTAAAGCA 本研究设计
rbcL-revCAAAGTATCCATTGCCTGGAA 本研究设计
ndhF ndhF-forCAGACATATCAATATGCGTGGA 本研究设计
ndhF-revGAAAAATAAAAGAACAGATAAGAGGAA 本研究设计
petA petA-forTATGAAAATCCACGAGAAGC 文献 [ 10]
petA-revTATCAGCAATGCAGTTCATC 文献 [ 10]
核酸内切酶有:EcoRⅡ 、MspI、HinfI、MboI、MboⅡ
(TaKaRa)。
2　结果与分析
2.1　rbcL、ndhF和 petA基因片段 PCR扩增产物
供试菊属与亚菊属植物基因组 DNA的叶绿体
基因 rbcL、ndhF和 petA片段的 PCR扩增结果分别
见图 1、图 2、图 3。其中 rbcL和 ndhF基因易于扩
增 ,全部 14份材料均得到目的条带 ,且条带清晰 ,无
杂带 ,片段长度分别约为 1 400bp和 2 000bp。petA
基因扩增稍难 ,除 1条长度约为 2 300 bp清晰的主
带外 ,有少数杂带 , D.indicum(Shennongjia)和 D.
×grandiflorum“Shenma”未能得到有效扩增。所有
材料间 3个叶绿体基因均无长度多态性。
2.2　rbcL、ndhF和 petA片段的 PCR-RFLP多态
3个叶绿体基因片段与限制性核酸内切酶的组
合为:rbcL-EcoRⅡ 、rbcL-MspI、ndhF-HinfI、petA
-MboI、petA-MboⅡ 。 12份菊属植物 rbcL基因扩
增片段 EcoRⅡ酶切结果见图 4,各样本均产生 3条
酶切片段 ,且各样本间 3条酶切片段长度基本一致 ,
其长度分别约为 1 100 bp、160 bp、140 bp。 11份菊
属植物 rbcL基因扩增片段的MspⅠ酶切结果见图
5,酶切多态性基本一致 ,各样本均产生 3条酶切片
段 ,其长度分别约为 960bp、300bp、140bp。结果表
明 rbcL基因 PCR扩增片段的 EcoRⅡ和 MspⅠ限制
性内切酶酶切未产生片段长度多态 。由于 2份亚菊
属植物 rbcL基因 PCR扩增产物的量不足 ,无法得到
EcoRⅡ和 MspⅠ限制性内切酶酶切图谱 , 同样 ,
D.×grandiflorum“Hangbaiju”也未得到 MspⅠ限
制性内切酶的酶切图谱 。
—59—吴国盛等:基于 PCR-RFLP多态的部分菊属与亚菊属植物亲缘关系研究
　　12份菊属植物 ndhF基因扩增片段 HinfⅠ酶切
结果见图 6,各样本均产生 4条酶切片段 ,且各样本
间 4条酶切片段长度基本一致 , 其长度分别约为
800bp、700 bp、310 bp、190 bp。结果表明 , ndhF基
因扩增片段的 HinfⅠ限制性内切酶酶切也未产生片
段长度多态 。由于 2份亚菊属植物 ndhF基因 PCR
扩增产物的量不足 ,无法得到 HinfⅠ限制性内切酶
酶切图谱。
　　10份菊属及 2份亚菊属植物 petA基因扩增片
段 MboⅠ酶切结果见图 7,各样本均产生 6条酶切片
段 ,且各样本间 6条酶切片段长度基本一致 ,其长度
分别约为 520 bp、400 bp、380 bp、250 bp、150bp、80
bp,说明 petA基因扩增片段的 MboⅠ限制性内切酶
酶切也未产生片段长度多态。 10份菊属及 2份亚
菊属植物 petA基因扩增片段 MboⅡ酶切结果见图
8,除 A.pacifica、A.shiwogiku外 ,每个物种均产生 5
条长度基本一致的酶切片段 ,其长度分别约为 700
bp、500 bp、420 bp、200 bp、150 bp。而 A.pacifica、
A.shiwogiku则产生 4条酶切片段 ,其长度分别约为
1 120 bp、500 bp、200 bp、150 bp。由于 D.indicum
(Shennongjia)和 D.×grandiflorum“Shenma”未得
到 petA基因 PCR扩增产物 ,因此未进行 MboⅠ和
MboⅡ限制性内切酶酶切反应。
3　讨论
本研究供试菊属和亚菊属植物的 rbcL、ndhF和
petA3个叶绿体基因片段 PCR扩增产物均无限制
性核酸内切酶酶切片段长度多态性 。对 rbcL、ndhF
基因片段的扩增较为容易 ,对 petA基因片段的扩增
较为困难 。
用于植物分子系统学研究的分子标记种类非常
多 ,如限制性片段长度多态性(RFLP)、随机扩增片
段的多态性 (RAPD)和扩增片段长度多态性
(AFLP)以及 DNA指纹标记如简单序列重复 SSR
等 ,而且新的方法仍然在不断地被创立 [ 12] 。经典的
RFLP研究含 Southern转移 、探针标记 、杂交及检测
等繁琐的实验步骤 ,成本高 ,耗时多 ,有时还要受到
探针来源的限制 。 PCR技术的诞生使我们极易获
得目的基因 ,进而进行 RFLP分析 ,产生了 PCR-
RFLP方法。由于这一方法的成本低廉 ,耗时少 ,实
验流程简单 ,很快得到了广泛应用。 PCR-RFLP所
得到的信息有时并不比单个基因序列所获得的信息
量少 ,因为用少量的内切酶酶切就可以产生和获得
能够反映分类群遗传差异的大量多态性 ,为研究植
物类群特别是属间 、种间甚至品种间的亲缘关系 、系
统发育与演化提供有力的依据[ 3] 。
戴思兰等 [ 7] 曾使用 RAPD技术对菊花起源进
行了研究 ,通过对 7种野生菊属植物 、14种栽培菊
花和 5个种间杂种的随机扩增条带的分析发现:在
7个野生种中 , D.indicum、D.vestitum和 D.nankin-
gense与栽培菊花亲缘关系较近 ,而 D.zawaski的关
系最远 。验证了现代栽培菊花是以 D.vestitum、
D.indicum种间天然杂交为基础 ,然后 D.zawaski、
D.nankingense等又参与杂交 ,再经过人工选择形成
的栽培杂种复合体 。人工种间杂种多数被聚合在其
亲本组内 ,但有个别并没有被聚合到其杂交亲本的
组内 ,再一次说明了杂种苗在进化上可能是多方向
的。各类栽培小菊交叉分布在进化类群和原始类群
—60— 江苏农业科学　2008年第 2期
之间 ,表明了这些类群进化上的复杂性。周春玲
等 [ 8]利用 AFLP技术 ,对菊属植物 12个分类群进行
分析 ,结果发现所选的 2个栽培品种与 D.vestitum、
D.indicum、D.lavandulifoium亲缘关系相对较近 ,
D.zawaski次之 , D.chaneti相对最远 。综合前人
研究可以认为 ,菊属物种间亲缘关系复杂 。
El-Twab等在进行 GISH分析时 , 无法将
D.boreale、D.chaneti、 D.indicum、 D.japonicum、
D.lavandulifoium、D.japonense、D.yoshinaganthum
和 D.zawaski等基因组区分开 ,表明它们的基因组
有很高的同源性 , 物种彼此间亲缘关系很近 [ 1] 。
Kishimoto等 [ 10]对原产日本的 12个野生菊和 1个栽
培菊花品种进行叶绿体 DNA的 PCR-RFLP分析 ,
用 32个限制性核酸内切酶对 10个叶绿体基因进行
酶切 ,结果只有 9个酶切组合产生了具多态性的酶
切图谱 ,但没有发现与栽培菊花有相同酶切谱带的
野生种 ,因此认为菊花的起源不在日本 ,而 D.indi-
cum可能是菊花的主要祖先。本研究中 ,菊属与亚
菊属植物的 rbcL-EcoRⅡ 、rbcL-MspⅠ 、ndhF-
HinfⅠ 、petA-MboⅠ酶切片段均无长度多态性 ,难
以将它们区分开来 ,一方面与所用叶绿体基因片段
和限制性核酸内切酶较少有关 ,另一方面也再次表
明菊属物种间有很近亲缘关系 ,且菊属与亚菊属间
亲缘关系也很近 。
在日本 ,亚菊属一直被作为菊属的一个组来处
理 , Kitamura等认为形态变异和遗传隔离尚不足以把
菊属和亚菊属区分开 ,因为 2个属间存在着广泛的物
种间杂交 ,已报道至少有 20多个组合;此外 ,菊属一
些物种与亚菊属的亲缘关系比菊属物种间亲缘关系
还要近[ 13-14] 。Ohashi等把 A.pacificum、A.shiwogiku
等都归到菊属[ 14] ,而 Bremer等则把它们划到亚菊
属 [ 15] 。虽然本研究结果无法解决菊属植物的亲缘关
系问题 ,但 petA-MboⅡ酶切结果显示 A.pacifica、A.
shiwogiku的酶切图谱不同于其他菊属植物 ,表明菊属
与亚菊属间仍存在差异 ,这为将 A.pacifica、A.shi-
wogiku这 2个亚菊属的种区别于其他菊属植物提供
了一定的分子证据。因此 PCR-RFLP技术有望在今
后应用于对亚菊属与菊属的区分研究。总体上来说 ,
本研究获得的 PCR-RFLP多态信息较少 ,仅 petA-
MboⅡ的酶切结果产生了一些酶切多态 ,可能与本研
究中根据已知相关序列选择限制性内切酶的策略有
关 ,所选用的限制性内切酶较少 。物种间基因序列的
不同 ,限制性酶切位点不同 ,因此尝试多种限制性内
切酶酶切有望提供更多的分子信息。本研究仅对源
自中国和日本的部分菊属植物进行了初探 ,开展其他
分布地区的更多菊属植物及多基因领域 ,特别是开展
适合于研究较低分类阶元和较晚分化类群的目的基
因序列的 PCR-RFLP研究十分必要。
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