全 文 ：高效液相色谱-系统聚类分析方法
在风轮菜属药材分类中的应用
张雪辉 , 陈建民
(中国协和医科大学 中国医学科学院 药用植物研究所 ,北京 100094)
[ 摘要] 目的:探讨高效液相色谱技术应用于风轮菜属中药的鉴定研究。方法:利用高效液相色谱提供药材
的内在成分信息 ,结合模式识别技术 , 对风轮菜属植物进行了分类及鉴定。结果:色谱数据的系统聚类结果得到了
预期效果 ,这对于研究风轮菜属药材的类别及近缘性提供了依据。结论:本方法具有简便 、快捷 、重现性好等优点。
[ 关键词] 风轮菜属;系统聚类分析;药材分类
[ 中图分类号] R 282 [ 文献标识码] A [ 文章编号] 1001-5302(2003)09-0812-05
风轮菜 Clinopodium chinensis (Benth)O.
Kuntze 始载于 《救荒本草》 , 荫风轮 C.poly-
cephalum (Vaniot)C.Y.Wu et Hsuan 始载于《植物
实名图考》 。1995年版《中国药典》收载了这 2个品
种 ,药名:断血流 。其制剂断血流片亦列入药典。断
血流微苦 ,辛凉 ,归肝经。功能止血 ,用于崩漏 ,子宫
肌瘤出血 ,尿血 ,牙龈出血 ,创伤出血 。另该属植物
中还有 5种植物是传统的民间草药 ,功能大致相同 。
唇形科风轮菜属植物约有 20种 ,分布于欧洲 、中亚
及亚洲东部 ,在我国共 11 种 、5 个变种和 2 个变
型[ 1] :荫风轮 C.polycephalum , 匍匐风轮菜 C .
repens (D.Don)Wall.,长梗风轮菜 C .longipes C.
Y.Wu et Hsuan.Ex H .W.Li ,风轮菜 C.chinense ,
风车草 C .urticifolium (Hance)C.Y.Wu et Hsuan
ex H .W.Li ,寸金草 C.megalanthum (Diels)C.Y.
Wu et Hsuan ex H.W.Li , 寸金草(原变型)C .
megalanthum var.megalanthum , 粗壮变种 C .
megalanthum var.robustum C.Y.Wu et Hsuan ex
H.W.Li ,美丽变种 C.megalanthum var.speciosum
C.Y.Wu et Hsuan ex H .W.Li , 居间变种 C .
megalanthum var.internedium C.Y.Wu et Hsuan
ex H .W.Li ,披针叶变种 C .megalanthum var.lan-
cifolium C.Y.Wu et Hsuan ex H.W.Li , 异
[ 收稿日期] 2002-09-10
[通讯作者] 陈建民 Tel:(010)62899730 Fax:(010)
62899730 E-mail:chenjianmin@hotmail.com
色风轮菜 C.discolor (Diels)C.Y.Wu et Hsuan ex
H.W.Li ,疏花风轮菜 C .laxi f lorum (Hayata)C.
Y.Wu et Hsuan ,细风轮菜(瘦风轮菜)C .gracile
(Benth.)Matsum ,邻近风轮菜(光风轮)C .conf ine
(Hance)O.Kuntze ,邻近风轮菜(原变型)C .conf ine
var.con f ine ,球花变种 C.conf ine var.globosum C.
Y.Wu et Hsuan ex H .W.Li , 峨嵋风轮菜 C.
omeiense C.Y.Wu et Hsuan ex H.W.Li。
戴金瑞[ 2] 对荫风轮 C .polycephalum 、风轮菜
C .chinensis 、邻近风轮菜 C .conf ine 、细风轮菜 C.
gracile 、匍匐风轮菜 C .repens5种风轮菜属植物进
行了形态 、性状 、解剖构造及显微观察和扫描电子显
微镜实验 ,比较了它们在生药学方面的异同 。在生
药性状方面 ,认为荫风轮与风轮菜形态基本相似 ,
茎 、叶均被糙硬毛。邻近风轮菜和细风轮菜植株矮
小纤细 ,茎 、叶毛稀少 ,其中邻近风轮菜茎 、叶无毛。
匍匐风轮菜略同风轮菜 ,但茎 、叶淡黄色 ,毛略稀但
更长 ,植株高为风轮菜的 1/2 ～ 1/3 。周翰儒对荫风
轮 C.polycephalum 、风轮菜 C.chinense 、邻近风
轮菜 C.conf ine 、细风轮菜 C .gracile 的营养器官进
行了解剖学研究 ,通过 4种植物的茎 、根检索表的相
似性认为其化学成分亦可能相似 。
为了较系统的了解我国风轮菜属植物之间的相
关性 ,我们应用HPLC对 8种 1变种植物不同产地 、
不同采收日期共计 10个品种 20个样品进行聚类分
析 。每种植物都含有许多化学成分 ,同属不同种的
植物必定含有一些相同的化学成分 ,这是化学分类
·812·
第 28卷第 9期
2003年 9月
中 国 中 药 杂 志
China Journal of Chinese Materia Medica
Vol.28 , Issue 9
September , 2003
学的基本观念之一。对每一种植物进行系统的植化
工作 ,分离鉴定化学成分 ,最后进行归纳比较 ,这是
植物进行化学分类的经典方法 ,但是费力费时 ,投入
巨大 。利用色谱-光谱联用技术 ,采用有用数据进行
聚类分析 ,也是化学分类学研究的一条途径。
1 实验材料
1.1 仪器与试剂
WatersTM 600 Controller 液相色谱仪 ,WatersTM
600 泵 , WatersTM 996 二极管阵列检测器 , Waters
M illennium 2020数据处理系统 。甲醇为色谱纯 ,水
为双蒸水 。
1.2 色谱条件
Agilient ZORBAX SB-C18柱(4.6 mm ×150
mm ,5 μm);流动相梯度变化见表 1;柱温为室温;检
测波长 230 nm(皂苷类供试品)及 265 nm(黄酮类
供试品);灵敏度为 1AUFS 。
表 1 流动相梯度表
时间 /min 甲醇/ % 水/ %
0 10 90
5 25 75
10 30 70
20 40 60
30 45 55
35 40 60
40 30 70
50 10 90
注:流速均为 1.00 mL·min-1
1.3 药材来源
10种风轮菜属药材样品见表 2。
表 2 药材样品植物学分类及鉴定
药材编号 来源 鉴定种类
1 霍山 ,安徽 , 1995-05采集 Clinopod ium.ch inense1)
2 霍山 ,安徽 , 1995-07采集 C.con f ine1)
3 丽江 ,云南省 , 1996-07采集 C.repens2)
4 霍山 ,安徽 , 1995-05采集 C.graci le1)
5 霍山 ,安徽 , 1995-05采集 C.ur tici folium 1)
6 峨眉山 ,四川省 , 1995-09采集 C.omeiense2)
7 丽江 ,云南省 , 1996-07采集 C.megalan thum 2)
8 丽江玉龙山 ,云南省 , 1996-07采集 C.mega lanth um var.internedium a 2)
9 丽江玉龙山 ,云南省 , 1996-07采集 C.mega lanth um var.internedium b 2)
10 霍山 ,安徽 , 1992-05采集 C.polycephalum 1)
11 霍山 ,安徽 , 1995-05采集 C.chinense1)
12 霍山 ,安徽 , 1995-07采集 C.con f ine1)
13 丽江 ,云南省 , 1996-07采集 C.repens2)
14 霍山 ,安徽 , 1995-05采集 C.graci le1)
15 霍山 ,安徽 , 1995-05采集 C.ur tici folium 1)
16 峨眉山 ,四川省 , 1995-09采集 C.omeiense2)
17 丽江 ,云南省 , 1996-07采集 C.megalan thum 2)
18 丽江玉龙山 ,云南省 , 1996-07采集 C.megalan thum var.internedium a2)
19 丽江玉龙山 ,云南省 , 1996-07采集 C.megalan thum var.internedium b2)
20 霍山 ,安徽 , 1992-05采集 C.polycephalum 1)
注:1)安徽中医学院中药系王德群副教授采集 、鉴定 2)中国医学科学院药用植物研究所顾志平副研究员采集 、鉴定
2 实验方法
2.1 供试品溶液的制备
该属植物的主要成分是皂苷和黄酮 ,我们从这
两个方面对生药样品进行处理 ,从而分别获得皂苷
类供试品溶液和黄酮类供试品溶液 。
皂苷类供试品溶液的制备:精密称取生药样品
2 g ,加 40 mL 甲醇超声提取半小时 ,放置过夜再超
声半小时 ,过滤 ,滤液浓缩至近干 ,走大孔树脂(内径
15 mm ,柱高 10 ～ 12 mm ,先用乙醇冲洗 20 mL ,后
用蒸馏水继续冲洗至无醇),先用蒸馏水冲洗 20 ～
40 mL至淡黄色 ,后用 95%乙醇洗脱 ,收集乙醇液
75 ～ 80 mL ,浓缩至干 ,甲醇定容于 5 mL 量瓶中 ,作
为母液。测量时取 0.2 mL 母液 ,用甲醇稀释定容
至 2 mL ,待测 。
黄酮类供试品溶液的制备:精密称取生药样品
2 g ,加 40 mL 甲醇超声提取半小时 ,放置过夜再超
声半小时 ,过滤 ,滤液浓缩至近干 ,再用甲醇定容至
10 mL ,作为母液备用。测量时取 0.4 mL ,用甲醇
·813·
第 28卷第 9期
2003年 9月
中 国 中 药 杂 志
China Journal of Chinese Materia Medica
Vol.28 , Issue 9
September , 2003
稀释定容至 2 mL ,待测。
2.2 HPLC色谱图的制备
在上述色谱条件下 ,分别吸取待测样品 10 μL
进样 ,得色谱图。部分色谱图见图 1。
图 1 风轮菜属部分药材 HPLC 图
a.峨嵋风轮菜皂苷类供试品 b.荫风轮皂苷类供试品
c.峨嵋风轮菜黄酮类供试品 d.荫风轮黄酮类供试品
2.3 HPLC方法学研究
2.3.1 精密度实验 分别准确吸取峨嵋风轮菜
皂苷类供试品溶液和黄酮类供试品溶液 10 μL ,每
个溶液各连续进样 5 次 ,记录每个色谱峰的保留时
间及其峰面积积分值 ,获得每个色谱峰保留时间的
RSD为 0.6%～ 1.0%,其色谱峰峰面积的 RSD 为
0.8%～ 1.4%。
2.3.2 重复性实验 取 5份峨嵋风轮菜药材粉
末 ,精密称定。按 2.1项下皂苷类供试品溶液的制
备方法制备 5份峨嵋风轮菜的皂苷类供试品溶液 。
准确吸取上述供试品 10 μL 进样 ,记录每个色谱峰
的保留时间及其峰面积积分值 ,获得每个色谱峰保
留时间的 RSD 为 0.5%～ 1.5%,其色谱峰峰面积
的 RSD为 0.8%～ 2.0%。
另取 5份峨嵋风轮菜药材粉末 ,精密称定 。按
2.1项下黄酮类供试品溶液的制备方法制备 5份峨
嵋风轮菜的黄酮类供试品溶液 。准确吸取上述供试
品10μL 进样 ,记录每个色谱峰的保留时间及其峰
面积积分值 ,获得每个色谱峰保留时间的 RSD 为
0.8%～ 2.0%,其色谱峰峰面积的 RSD为 1.0%～
2.2%。
2.3.3 稳定性实验 取上述精密度实验中的供
试品溶液 ,每隔 2 h进样 1次 ,连续进样 5次。记录
每个色谱峰的保留时间及其峰面积积分值 ,获得每
个色谱峰保留时间的 RSD为 1.0%～ 2.0%,其色
谱峰峰面积的 RSD为 1.0%～ 2.5%。
2.4 数据分析
2.4.1 系统聚类分析 把所有样品的色谱峰的保
留时间从小到大排列起来 ,并记录其下的色谱峰面
积 ,若此保留时间处无色谱峰出现 ,则其面积为 0 ,
这样就得到了 10个风轮菜属药材品种其 20个样品
的色谱峰面积表 ,并以此进行系统聚类分析 。经过
SPSS 统计软件的分析 ,得到如下树状聚类图谱(图
2)。
从图 2中可以清晰地看到样品分类结果相当
好 ,同种生药聚类距离很短 ,而不同种生药之间聚类
的距离较长 ,从标尺 20处截下可将该 10 种生药分
成 4类:风轮菜 、细风轮菜 、峨嵋风轮菜与邻近风轮
菜为 1类 ,荫风轮单独为 1类 ,风车草与寸金草居间
变种 b为 1类 ,寸金草与寸金草居间变种 a 为 1类;
前二者在标尺 21 处又合为 1类 ,后二者在标尺 23
处也合为 1类 ,该分类情况与植物学分类情况相吻
合 。
2.4.2 Fisher线性判别函数 每个样品取 5个样
本 ,总样本量为 100。在正确分类的前提下 , 利用
Fisher判别法建立了各类的判别函数 ,即 Fisher线·814·
第 28卷第 9期
2003年 9月
中 国 中 药 杂 志
China Journal of Chinese Materia Medica
Vol.28 , Issue 9
September , 2003
图 2 风轮菜属药材系统聚类分析树状图谱
样品编号见表 2
性判别函数 ,各个生药的分类函数如下:
风轮菜:Y =-385.989 -1.985 ×10-4 X2 +5.363×
10-3 X 7;
邻近风轮菜:Y =-3 963 836+1.119×10-4X 5+
29.918X 6-1.792×10-4X 8-1.6X 23;
匍匐风轮菜:Y =-107 944.8+1.866×10-3X 3+
2.017×10-6X 5+0.537 X 6-3.228×10-6X 8+0.172X 21-
2.883×10-2X 23;
细风轮菜:Y =-1 897 189+12.699X 16;
风车草:Y =-35 185 500+5.475X 2+23.418X 4;
峨嵋风轮菜:Y =-8 596.806-8.246×10-9X 3-
8.207×10-8X 5-2.375×10-6X 6+5.857×10-6X 8+
1.274×10-7X 23;
寸金草:Y =-8 303.806+4.619×10-3 X 3+1.184×
10-4X 5+1.330 X6-1.895×10-4X 8-7.136×10-2X 23;
寸金草居间变种 a:Y =-2.21×10-8+13.711 X 2+
58.651 X4+5.472×10-2X 7;
寸金草居间变种 b:Y =-2143.51+2.512×10-5X 3+
2.5×10-4 X5+7.236×10-3X 6-4.002×10-4X 8-
3.882×10-4X 23;
荫风轮:Y =-661 303.6-1.362×10-2 X 3-1.472×
10-5X 5-3.923 X6+2.356×10-5X 8+1.860 X 23;
判别函数用于将观测值分类 ,即将新例观测值
代入上述判别函数 ,哪个判别函数值最大 ,就判为哪
一类(表 3)。
X 2-X 6分别为皂苷类样品在7.1 , 8.3 , 9.2 ,
9.6 ,10.0 ,10.6及 28.0 min 处色谱峰面积;X 21与
X 23为黄酮类样品在 7.2和 8.8 min处色谱峰面积 。
由表 3可见 ,错判样品数为 0 ,错判样品数的百
分数为 0.00%,判对样品百分数为 100%。
3 讨论
对于同一批样品 ,用不同的系统聚类方法进行
表 3 各组原始样品的 Fisher判别结果
样品编号 原类别 判别归类 样品编号 原类别 判别归类
1 风轮菜 风轮菜 11 风轮菜 风轮菜
2 邻近风轮菜 邻近风轮菜 12 邻近风轮菜 邻近风轮菜
3 匍匐风轮菜 匍匐风轮菜 13 匍匐风轮菜 匍匐风轮菜
4 细风轮菜 细风轮菜 14 细风轮菜 细风轮菜
5 风车草 风车草 15 风车草 风车草
6 峨嵋风轮菜 峨嵋风轮菜 16 峨嵋风轮菜 峨嵋风轮菜
7 寸金草 寸金草 17 寸金草 寸金草
8 寸金草居间变种 a 寸金草居间变种 a 18 寸金草居间变种 a 寸金草居间变种 a
9 寸金草居间变种 b 寸金草居间变种 b 19 寸金草居间变种 b 寸金草居间变种 b
10 荫风轮 荫风轮 20 荫风轮 荫风轮
聚类 ,所得到的结果是不同的 。看一个聚类方法是
否可取 ,主要取决于这种方法所得的结果是否正确 。
本文尝试用原始数据直接进行分类 ,分类效果不好 ,
先将原始数据进行标准化变换后再进行聚类 ,效果
要好得多。通过对数据的变换 ,消除了变量变化幅
度的影响 ,使变化范围较小的变量与变化范围较大
的变量成为同等重要 ,但这种现象有时未必合理。
在样本的相似性量度计算方法的选择上 ,本文
没有采用常用的欧氏距离或绝对值距离 ,这两种方
法的聚类结果都不理想 ,而采用夹角余弦法 ,分类结
果较好 。
由于样本量的限制 ,文中建立的 Fisher 判别函
数会存在一定的“病态” ,但其可根据色谱峰面积直
接进行判别 ,非常简明方便 。
·815·
第 28卷第 9期
2003年 9月
中 国 中 药 杂 志
China Journal of Chinese Materia Medica
Vol.28 , Issue 9
September , 2003
综上所述 ,本文利用高效液相色谱获得植物的
内在成分信息 ,同时借助数学和计算机技术 ,利用多
学科手段 ,探讨风轮菜属药材的分类及鉴定问题 ,从
结果来看基本可行。从另一角度看 ,本方法较为客
观地克服了认为的主观因素。因此 ,本方法作为一
种辅助手段用于风轮菜属药材的分类及鉴定是可行
的。
[参考文献]
[ 1] 中国科学院中国植物志编辑委员会.中国植物志(66 卷).北
京:科学出版社 , 1977.222.
[ 2] 戴金瑞.研究生毕业论文摘要汇编.上海:上海医科大学出版
社 , 1983.60.
[ 3] 张福良.聚类分析与中药质量研究.北京:人民卫生出版社 ,
1994.10.
Application of Hierarchical Cluster with High-Performance Liquid
Chromatography in the Classif ication of Genus Clinopodium chinensis
ZHANG Xue-hui , CHEN Jian-min
(Institute of Medicinal Plant Development , Chinese Academy of
Medical Sciences and Peking Union Medical Colleg e, Beijing 100094 , China)
[ Abstract] Objective:To realize the relationships of the plants of genus C.chinensis in our country and confirm the feasible
quality o f the application of Hierarchical cluster in the classification of genus C.chinensis.Method:The chemical info rma tion of 20
samples o f 10 kinds of plants w as obtained w ith high-perfo rmance liquid chromatog raphic method and classification based on their
chemical information was made through Hierarchical cluster.Flavonoids and saponins were the main components o f the C.chinensis
plants.We did the high-perfo rmance liquid chromatography from the flav onoids and saponins side respectively.Result:Expected re-
sults w ere achieved in the Hierarchical clusters of the chromatographic data of the plants o f genus C.chinensis which supplied the
foundation for studying crude drugs catego rys and those close of C.chinensis.Conclusion:The cluster and identi fication results show
the method is acceptable , simple , rapid , inexpensive and repeatable.
[ Key words] genus Clinopodium chinensis;Hierarchical cluster;Fisher function;classification of medicinal plants
[ 责任编辑 袁桂京]
《新编中药志》第 4卷简介
《新编中药志》是著名中药学专家 、中国工程院院士肖培根研究员主编 ,化学工业出版社出版的一部全面介绍我国中药资
源与现代研究的大型工具书。全书共 4 卷 ,其内容丰富 、翔实 ,保持了与 2000 年版《中华人民共和国药典》一部的一致性 , 可以
作为是药典的注释。本书第 1～ 3 卷全部为植物药 , 已于 2002 年初面世并受到广大中医药界专家的高度评价 ,现在第 4 卷也
出版了。《新编中药志》第 4 卷内容分为两部分 ,第一部分 收载常用动物与矿物药 70 余种 , 第二部分为全书总索引。第一部
分 ,收载的常用动物与矿物药涵盖了《药典》一部中的全部动 、矿物药。对每个中药品种 , 均就其历史 、原动(矿)物 、采制 、药材
及产销 、化学成分 、药材鉴定 、性味及功效 、药理作用及临床应用 , 以及地方代用品 、伪品等情况作了全面介绍 , 并附了参考文
献。同时为适应中药质量评价和现代化 、国际化的需要 , 加强了化学成分与中药成分的定性鉴定 ,中药特征性成分或有效成
分的定量分析等方面的内容;对一些重要的常用中药 , 还加强了药材的宏观与微观鉴别的内容;文献追踪至 2001 年 , 个别到
2002 年上半年。第二部分 ,包含全书总索引 7 种:中药功能索引 、药理作用索引 、化学成分中文名索引 、化学成分英文名索引 、
药材与原植(动)物拉丁学名索引 、药材与原植(动 、矿)物名称汉语拼音索引 、药材与原植(动 、矿)物名称中文笔画索引。这些
索引是根据不同读者的多种需求而编制 ,可满足在中药现代化研究 、新药研发 、药品检验管理 、药材经销等各种部门工作的专
业人员使用。本卷正文前还附有本卷所收载药材 、原动物与原矿物的彩色插图 92 幅。
·816·
第 28卷第 9期
2003年 9月
中 国 中 药 杂 志
China Journal of Chinese Materia Medica
Vol.28 , Issue 9
September , 2003