全 文 ：[作者简介 ] 马云淑 (1966 ～ ), 女 , 云南文山州人 , 医学硕士 , 副教授 , 主要从事中药资源开发与中药制剂研究.
昆 明 医 学 院 学 报　2007, (4):31 ～ 34 CN 53 - 1049 /R
Journal ofKunm ingM ed ica l College
论　著
正交实验法优化千金藤属植物的 DALP反应体系
马云淑 1) , 李永谊 2) , 虞　泓 3)
(1)云南中医学院中药学院 , 云南 昆明　650200;2)云南英茂生物技术实验室 , 云南 昆明　650106;
3)云南大学生命科学学院生态遗传学实验室 , 云南 昆明　650091)
　　[摘要 ] 目的　建立一套稳定的千金藤植物 DALP反应体系 , 为开展该属植物的 DALP分子标记奠定基
础. 方法　采用正交实验设计 , 以云南地不容 Stephania yunnanenses Lo与地不容 S tephania epigaea Lo基因组
DNA为模板 , 对 DALP反应程序的重要参数进行优化. 结果　最佳的反应体系为 20μL, 包含模板 DNA
2. 0μL, 2. 5 mm ol /L的 M gC l
2
2. 5μL, 2. 5 mmo l /L的 dNTPs 2.0μL, 5 pmo l /L的选择性引物 1μL, 5 pm ol /L的反
向引物 3μL, 0.5 U /μL的 Taq酶 5μL, 10×Bu ffer 2. 0μL, 灭菌超纯水 2. 5μL. 结论　该 DALP应用反应体系
稳定 、 可靠 、 重现性好 , 可有效的地应用于千金藤植物的种间及居群间分类鉴定.
[关键词 ] 千金藤植物;直接扩增片段长度多态性;分子标记;反应体系
[中图分类号 ] R28　 [文献标识码 ] A　 [文章编号 ] 1003 - 4706 (2007) 04 -0031 - 04
Optmi izing DALP Reaction System ofStephania
Yunnanenses Lo ByO rthogonal Design
MA Yun - shu
1) , LIYong - yi2) , YU Hong3)
(1)Dept.of Traditional ChinesePharmacy, YunnanUniversity of Traditional ChineseMedicine, Kunm ing 650200;
2)Yunnan Inmol Laboratory of B iotechnology , Kunm ing 650106;
3)Laboratory of Ecolog ica lGenetics, School of L ifeScience, Yunnan University , Kunm ing 650091, China)
[ Abstrac t] Objective　To establish a set of stable DALP reaction system of Stephania species and se t
foundation for DALP molecu larmarkers of this genus. Methods　O rthogona l design w as used and the DNA o f
S tephan ia yunnanenses Lo and S tephania epigaea Low ere taken as samp les to optim ize some significan tparameters
of DALP reac tion sy stem. Results　The 20μL op timum DALP reac tion sy stem contains:2.0μL sample DNA ,
2.5mmol /L M gC l22.5μL, 2.5mmo l /L dNTPs 2.0μL, 0.5U /μL TaqDNA po lymerase 5μL, 5 pmo l /L selec-
tive primer 1μL, 5 pmo l /L reve rse Primer 3μL, 10 ×Bu ffer 2 0μL, and sterilized u ltrapu re w ate r 2.5μL.
Conc lusion　Th is reac tion system is steady, reliab le and repeatab le. It is an effective reaction sy stem for iden tif-
y ing spec ies and local popu la tions ofS tephania spec ies.
[ Keywords] S tephania;DALP;M olecularma rke r;Reaction sy stem
　 　防 已 科 ( Men ispermaceae ) 千 金 藤 属
(S tephania)植物全世界约 60余种 , 据 《中国植
物志》[ 1] , 我国有 39种 , 西南和华南地区分布较
广 , 该属植物在云南省有广泛丰富的蕴藏 , 民间
俗称 “山乌龟” , 可供药用的植物种类较多 , 主
要有清热解毒 、 舒筋活血 、 理气止痛等功效. 该
属植物生物碱含量往往很高 , 活性较强 , 药用价
值较高 [ 2] . 多年来已从该属植物中开发出活性较
强的化学成分如镇痛的 l -四氢巴马汀 ( l - tetre-
hydropalm atine, 颅痛定), 具升白作用的千金藤素
(cepharanthine, 西法安生 )等 , 同时还含多种目
前尚未开发利用的 、 值得深入研究开发的生物活
性物质.
直接扩增片段长度多态性 (direct amp lifica-
tion o f leng th po lymo rphism s, DALP), 是 1998年
法国科学家 Desm arsis E , Lanne lucl I和 Langel J发
展起来的基于随意扩增 PCR (AP - PCR), 用于
检测基因多态性并用扩增产物直接测序的一种新
方法[ 3] . DALP拥有随机扩增多态性 DNA (ran-
dom amp lified po lymorphic DNA , RAPD)信息量大
的优点 , 同时也不需要被分析样品的基因组参考
序列 , 而其引物序列相对 RAPD较长 (RAPD引
物不多于 10个碱基 ), PCR扩增时使用以相对高
的退火温度 , 使得 DALP的结果比 RAPD有更高
的重复性和稳定性. 本研究分别对千金藤属植物
中分属于不同组 、 亲缘关系较远的云南地不容
(S.yunnanenses Lo, 山 乌 龟 组 ) 与 地 不 容
(S.epigaea Lo, 地不容组)的 DNA为模板 , 通过
对 PCR反应体系中各种参数的优化设置 , 分析比
较各种因素对 DALP扩增结果影响 , 找出合适的
反应体系 , 为下一步开展千金藤属植物分子标记
奠定基础.
1　材料与方法
1.1　供试品与试剂
供试云南地不容 (S tephania yunnanenses Lo)
与地不容 (S tephania epigaea Lo)采自云南省耿马
并种植在实验地内.
引物 (P1 、 P2、 P3)为上海生工合成 , 其序
列见表 1. Taq DNA 聚合酶 、 Buffer、 MgC l2 和
dNTP均购自上海生工公司.
1.2　仪器
PE 9700扩增仪:美国 PE公司;Kodak Im age
S tation 440CF凝胶成像系统:日本 Kodak公司;
M illi—Q型净水机:美国 M illipore公司.
表 1　引物序列
Tab. 1　Sequences of the prim er used
引物类型 名　称 序列 (5’ → 3’ ) 　　
选择性引物 DALP 221 (P1) GTTTTCCCAGTCACGACGC
选择性引物 DALP 232 (P3) GTTTTCCCAGTCACGACGAC
反向引物　 DALP R1 (P3) TTTCACACAGGAAACAGCTATGAC
1.3　方法[ 4]
1.3.1　DNA提取
基因组 DNA提取采用改良 CTAB法[ 5, 6] . 取
1 g左右的新鲜植物叶片 , 洗净放入灭菌研钵中 ,
加入少许 PVP 40、石英砂及 120μL β -巯基乙醇
充分研磨后加入 4mL缓冲液 (100mL /L T ris -
HC l, 50mmoL /L EDTA , 1 000mmoL /L N aC l),
洗去多糖和次生代谢物. 离心后弃上清 , 加入
4mL DNA 提 取 液 ( 100mL /L Tris - HC l,
50mmoL /L EDTA , 750mmoL /L N aC l), 混 匀 ,
65℃水中保温 60m in , 离心 , 取上清加入等体积
C I (氯仿∶异戊醇 24∶1, V /V)抽提 2次 , 取上清
加等体积异丙醇 , - 20℃静置 1 h, 离心后沉淀
用 70%乙醇洗两次. 沉淀晾干后 , 用 200μL 1 ×
TE缓冲液溶解. 1%琼脂糖凝胶电泳 , 溴化乙锭
染色 , 利用 Kodak 1D 分析软件分析并标定到
20 ng /μL备用.
1.3.2　DNA扩增　在扩增仪上进行 , PCR反应
体系为 18μL. 根据有关文献报道和试验要求对
DNA扩增中的一些重要参数进行梯度设置 , 并严
格控制其它参数和反应条件 , 确保试验的准确性
和可比性. 反应程序均为 95℃预变性 5m in,
94℃变性 30 s, 61℃退火 30 s, 72℃延伸 1m in ,
12个循环;再 94℃变性 30 s, 50℃退火 30 s,
72℃延伸 1m in, 28个循环 , 最后 72℃延伸
1m in, 完成整个 PCR反应.
1.3.3　电泳检测　扩增产物在 1×TAE、 1%的琼
脂糖凝胶中电泳 , 电压 3V /cm , 溴化乙锭染色 ,
32 昆 明 医 学 院 学 报　　　　　　　　　　　　　　　　　第 28卷　
K odak紫外凝胶成像仪观察照像.
1.3.4反应体系的筛选　 (1)预试验:将体系中
影响反应结果的主要因素在一定范围内选择几个
梯度用量 (单位:μL):即 25mmo l /L M gC l:1.5
～ 3.0;0.5 U /μL Taq酶:3.0 ～ 5.5;2.5mmo l /L
dNTP M ixture 1.0 ～ 2.5;及引物 P1 或 P2 1.0 ～
3.5;引物 P3 1.0 ～ 3.5 , 将以上各因素交替由小
至大与由大至小组合 , buffer均为 2μL, 用灭菌
超纯水补足 18μL, 加入模板 DNA 2μL, 经 PCR
扩增 、 琼脂糖凝胶电泳检测 , 初步筛选出各因素
较好的用量范围进行正交实验.
(2)反应体系筛选[ 5] :在预试验基础上 , 利
用正交实验法对影响 DALP反应条件的主要参数
进行优化实验. 在反应体系的各影响因素中 , 选
择对扩增影响较大的 4个因素 , 每个因素选择 3
个常用量作为 3个水平 , 按下列用正交实验表 ,
分别对云南地不容 (SY)与地不容 (SE)二者
的模板 DNA反应体系进行筛选 , 结果见表 2、 表
3、图 1.
表 2　因素水平表
Tab.2　The factors and leve ls for the orthononal test
水　平
因　素
M gC l2 (μL, A)
(25 mm o l /L)
Taq酶 (μL, B)
(0. 5 U /μL)
dNTPM ixture (μL, C)
(2. 5 mm ol /L)
反向引物:选择性引物 (μL, D)
(5 pm o l /L)
1 1. 5 3 1.5 1∶3
2 2. 0 4 2.0 2∶2
3 2. 5 5 2.5 3∶1
表 3　L9 (34) 正交试验表与结果
Tab.3　L9 (34) orthogonal design and re su lt
列　号 因　素
A (MgC l2) B (Taq酶) C (dNTPs) D (P2∶P3)
结果 (条带数)
SY SE
1 1 (1.5) 1 (3.0) 1 (1.5) 1 (1∶3) 4 长带
2 1 (1.5) 2 (4.0) 2 (2.0) 2 (2∶2) 0 0
3 1 (1.5) 3 (5.0) 3 (2.5) 3 (3∶1) 0 0
4 2 (2.0) 1 (3.0) 2 (2.0) 3 (3∶1) 长带 0
5 2 (2.0) 2 (4.0) 3 (2.5) 1 (13∶3) 0 4 (模糊)
6 2 (2.0) 3 (5.0) 1 (1.5) 2 (2∶2) 0 0
7 3 (2.5) 1 (3.0) 3 (2.5) 2 (2∶2) 0 0
8 3 (2.5) 2 (4.0) 1 (1.5) 3 (3∶1) 5 1
9 3 (2.5) 3 (5.0) 2 (2.0) 1 (1∶3) 5 4
2　结果
图 1凝胶电泳结果中 , 云南地不容 (SY)的
1 ～ 9号谱带与 10 ～ 18号地不容 (SE)的谱带 ,
均按正交设计表 (表 3)中 9组反应体系依次排
列 , 图 1中第 9号与 18号图谱带 , 均为表 3中的
第 9号反应体系组合 A3B3C2D1对 SY与 SE两种
DNA模板的扩增结果 , 其带型清晰 、 条带数较
多 , 故确定为最优化反应体系. 即 20μL反应体
系 , 包含模板 DNA 2.0μL, 2.5mmo l /L M gC l2
2.5μL, 2.5mmo l /L dNTPs 2.0μL, 5 pmo l /L选择
性引物 1μL, 5 pmo l /L反向引物 3μL, 0.5U /μL
的 Taq酶 5μL, 10 ×Buffer 2.0μL, 灭菌超纯水
33　第 4期　　　　　　　　　　　　马云淑 , 等 .正交实验法优化千金藤属植物的 DALP反应体系
2.5μL.
图 1　正交实验凝胶电泳结果
1 -9:SY;10 - 18:SE
Fig.1　Resu lt o f o rthogona l test by ge l e lectrophoresis
3　讨论
实验优化的反应体系可直接利用在千金藤属
植物的系统分析和分子鉴定上 , 实验显示 DALP
图谱带型清晰 、 条带数多. 凝胶电泳结果 (图 1)
也显示其它反应体系组合在扩增后或条带数很少 ,
不清晰 (如图 1中 2 ～ 7、 10 ～ 13、 15 ～ 17号图谱
带 ), 或仅对某一物种效果好 , 不能兼顾两个物
种 , 如图 1中反应体系相同的谱带 1号与 10号
(第 1号反应体系 )、 5号与 14号 (第 5号反应体
系 )、 8号与 17号 (第 8号反应体系 ), 均仅有一
个种扩增谱数较好.
以选定的反应体系应用于该属植物 5个种
(均属于山乌龟组或地不容组) 20余个居群共 200
余份 DNA样品 , 以及 5组引物的 DALP分析中 ,
均显示其重现性好 、 稳定性高. 实验模板所选的
两种植物 , 因在分类上分属不同的组 , 故对二者
均适用的反应体系用于这两组的其它植物中也取
得良好效果.
由于千金藤属植物为雌雄异株 , 药用部位为
块根 , 其分类鉴定主要依据花与果的形态性状 ,
故仅凭药用部位很难鉴定其种类和产地. DALP
分子标记技术重复性高 , 技术难度低 、 耗费小 ,
方法简便 , 且 DALP是共显性标记 , 能检测出纯
和基因型和杂和基因型 , 将其应用在传统中药材
的鉴定上 , 共显性数据提高了数据可信度 , 克服
了传统分子鉴定 (如 RAPD、 AFLP)的不足 , 有
望成为今后中药分子鉴定的重要技术.
[参考文献 ]
[ 1] 　中国科学院中国植物志编辑委员会. 中国植物志
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[ 5] 　马云淑 , 侯安国 , 卜文超. 华痛愈颗粒的制备工艺
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1 -3
(2007 - 03 - 15收稿)
34 昆 明 医 学 院 学 报　　　　　　　　　　　　　　　　　第 28卷