全 文 ：基于 ITS2 序列的秤星树等冬青属 8 种药用植物的分子鉴别
童家赟1，2，黄琼林2，马新业2，张晓丽2，詹若挺2，徐鸿华1* (1．广州中医药大学中药学院，广东广州 510006;2．广州中医
药大学中药资源科学与工程研究中心，教育部(省部共建)中药资源科学重点实验室，广东广州 510006)
摘要 ［目的］建立 ITS2区段的秤星树及其同属几种药用植物的分子鉴别方法。［方法］以秤星树等几种药用植物为材料，采用离心柱
型试剂盒提取总 DNA，采用一对通用引物对 ITS2区段进行 PCR扩增和测序;HMMer法对测序结果进行注释得到 ITS2序列;MEGA软件
分析，寻找差异位点，构建系统发生树。［结果］测序后注释得到的秤星树等 8种冬青属药用植物 ITS2 比对序列为 254 bp，种间存在 85
个差异位点。［结论］ITS2区可用于鉴别秤星树与同属几种药用植物。
关键词 秤星树(Ilex asprella (Hook． et Arn．)Champ． ex Benth．);冬青属;ITS2;序列分析
中图分类号 R284． 1 文献标识码 A 文章编号 0517 －6611(2012)05 －02684 －03
Molecular Identification of Ilex asprella with Other Species in the genus Ilex L． Based on ITS2 Sequence Analysis
TONG Jia-yun et al (College of Traditional Chinese Medicine，Guangzhou University of Chinese Medicine，High Education Megacentre，
Guangzhou，Guangdong 510006)
Abstract ［Objective］To establish molecular identification method for Ilex asprella and relative medicinal plants in the genus Ilex base on
ITS2 sequence．［Method］After DNA was extracted by reagent kit (centrifugal columnar)，a pair of universal primers were used for PCR am-
plification and sequencing of ITS2 region． Then，the sequences of different samples were annotated by HMMer method to acquire ITS2 se-
quences． Based upon the multiple sequence alignment of the amplified ITS2 sequences，a phylogenetic tree was constructed using the software
MEGA．［Result］254 bp ITS2 fragment of each species were obtained，and there were 85 different base sites between species．［Conclusion］
ITS2 region can be used to identify Ilex asprella from relative medicinal plants in the genus Ilex L． ．
Key words Ilex asprella;Ilex L．;ITS2;Sequence analysis
基金项目 广东省科技计划项目(2008A030101009;2010B031900007;
2011B090400191)。
作者简介 童家赟(1979 － ) ，男，福建龙岩人，讲师，在读博士，从事中
药鉴定学教学及相关科研工作，E-mail:tongjy@ gzhtcm． edu．
cn。* 通讯作者，教授，博士生导师，从事中药资源开发利用
与保护的研究和教学工作，E-mail:tong － jiayun@ hotmail．
com。
收稿日期 2011-11-03
秤星树(Ilex asprella (Hook． et Arn．)Champ． ex Benth．)
系冬青科(Aquifoliaceae)冬青属(Ilex L．)落叶灌木［1］，其以
根入药，常用于治疗流感和扁桃体炎等疾病［2］，研究表明，其
含有抗肿瘤活性成分［3］。秤星树大多为野生，而破坏性的采
挖使得药材资源日渐减少，市场有以茎枝代替根入药的趋
势。为了保证药材质量，广州中医药大学与企业合作开展秤
星树 GAP种植研究。然而，冬青属近缘植物形态非常相似，
甚至有部分品种在分类学上依然存在争议［4 －5］。前人研究
及作者调查发现秤星树与同属植物满树星(Ilex aculeolata
Nakai)的植物形态及药材都非常相似;有些地区甚至在用药
过程中把他们等同称为“岗梅”［6］;二者组织显微特征亦甚相
似，也没有可供鉴别化学成分的方法［6］。另外，毛冬青(Ilex
pubescens Hook． et Arn．)与秤星树的根及茎表面具有点状皮
孔，也甚为相似，容易混淆［7］。为了保证种质和药材质量，需
要建立一种明确的鉴别方法。
核糖体 DNA第 2转录间隔区(internal transcribed spac-
er 2 region of nuclear ribosomal DNA，ITS2)序列较短，有利于
进行 PCR 扩增及测序;并具有足够的变异位点，对于鉴别
近缘物种成功率较高;其两端的核糖体 DNA的 5． 8S及 28S
端序列较为保守，有利于设计通用引物，可作为通用的植物
DNA条形码(DNA barcode)鉴别序列［8 － 9］。另外，ITS2序列
已被用于冬青属植物某些类群的系统学分析［10 －11］。试验对
秤星树及其同属近缘药用植物的 ITS2 序列进行比较分析，
以期在分子水平上为秤星树的种质来源及药材鉴定提供一
定的依据。
1 材料与方法
1． 1 材料
1． 1． 1 研究对象。样品，由广州中医药大学徐鸿华教授鉴
定植物学名，凭证标本保存于广州中医药大学药用植物标本
室(见表 1)。其中登录号 GQ434387、AJ492682、AJ492691、
DQ200798为 GenBank下载的序列。
表 1 秤星树及同属几种植物样品信息
中文名 学名 采集地 登录号
秤星树 Ilex asprella var． asprella 广东梅州 JN974467
秤星树 Ilex asprella var． asprella 华南植物园 JN974468
秤星树 Ilex asprella var． asprella 广州中医药大学 JN974470
秤星树 Ilex asprella var． asprella － GQ434387
满树星 I． aculeolata 广东梅州 JN974471
满树星 I． aculeolata 广东梅州 JN974472
落霜红 I． serrata － AJ492682
毛冬青 I． pubescens 广州中医药大学 JN974481
毛冬青 I． pubescens 广州中医药大学 JN974482
秃毛冬青 I． pubescens f． glabra 广州中医药大学 JN974480
铁冬青 I． rotunda 广州中医药大学 JN974473
铁冬青 I． rotunda 广州中医药大学 JN974474
三花冬青 I． triflora var． triflora 广州帽峰山 JN974478
三花冬青 I． triflora var． triflora 广州帽峰山 JN974479
枸骨 I． cornuta 广州中医药大学 JN974475
枸骨 I． cornuta 广州中医药大学 JN974476
大叶冬青 I． latifolia － AJ492691
大叶冬青 I． latifolia － DQ200798
1． 1． 2 主要仪器。MJ Mini Personal Thermal Cycler PCR仪，
责任编辑 石金友 责任校对 况玲玲安徽农业科学，Journal of Anhui Agri． Sci． 2012，40(5):2684 － 2686，2689
DOI:10.13989/j.cnki.0517-6611.2012.05.108
购自美国 BIO － RAD 公司;凝胶成像及分析系统，购自法国
Vilber Lourmat 公司。
1． 1． 3 主要试剂。β －巯基乙醇、Goldview 染料，购自广州
鼎国生物技术公司;聚合酶链反应(PCR)试剂、DNA mark-
ers，购自大连宝生物技术公司;多功能 DNA纯化试剂盒，购
自北京百泰克生物技术公司;引物，由上海生工生物工程技
术公司合成;DNA 提取试剂盒，购自 Tiangen 生物技术
公司。
1． 2 方法
1． 2． 1 样品的处理。取采集的各样品植物的叶片，保存于
－70 ℃超低温冰箱备用。
1． 2． 2 DNA提取及检测。采用植物基因组 DNA 提取试剂
盒提取DNA。取5 μl DNA溶液与1 μl 10 × Loading Buffer混
匀后上样，电泳条件为:1 × TAE电泳缓冲液，浓度 1%琼脂糖
凝胶，恒压 120 V，电泳时间 15 min，然后用 Goldview染色，用
凝胶成像系统拍照记录，进行琼脂糖凝胶电泳检测。
1． 2． 3 PCR扩增及测序。以 F(GCGATACTTGGTGTGAAT)
和 R(GACGCTTCTCCAGACTACAAT)为扩增 ITS2的引物［8］。
PCR反应体系总体积为 60 μl，其中含 6 μl 10 × Ex Taq Buff-
er、4． 5 μl 浓度 10 μmol /L的 dNTPs、上下游引物各 1． 5 μl、
0． 6 μl Ex Taq，模板 DNA 适量，并用灭菌蒸馏水补足体积。
扩增程序为 94 ℃预变性 2 min，94 ℃变性 30 sec，55 ℃退火
30 sec，72 ℃延伸60 sec，32个循环后72 ℃延伸5 min，4 ℃保
存。PCR扩增产物用 PCR 产物纯化试剂盒回收后，送北京
六合华大基因科技股份有限公司广州分公司采用上下游引
物进行双向测序。
1． 2． 4 序列分析。采用 CodonCode Aligner 3． 7l 软件分别
对秤星树及其同属药用植物的上下游引物测序结果进行比
对和拼接，对于获得的 ITS序列，使用基于隐马尔可夫模型
的 HMMer注释方法去除两端 5． 8S和 28S区段获得 ITS2序
列［12］，然后进行 BLASTN (Nucleotide BLAST)比对，确定所
获序列。用 MEGA5． 0 软件将不同样品的 ITS2 序列进行多
重序列比对，寻找碱基差异位点;用邻接法(neighbour-2-
joining method，NJ)构建基于 ITS2 区的不同物种系统发生
树;利用 bootstrap (1 000次重复)检验各分支的支持率。计
算基于 Kimura-2-Parameter(K2P)双参数模型。
2 结果与分析
2． 1 DNA提取 由图 1可知，DNA样品在凝胶电泳上都得
到了清晰、迁移率低的条带，没有太大程度的降解，符合后续
试验的要求。
注:1．秤星树;2．满树星;3． 枸骨;4．秃毛冬青;5． 毛冬青;6．铁冬
青;7．三花冬青;M．(λDNA 10 μg /ml)。
图 1 秤星树与同属几种药用植物总 DNA电泳图
2． 2 ITS区 PCR扩增与序列注释 由图 2 可知，对 ITS区
的 PCR扩增获得了500 bp的片段。对各样品的 PCR产物测
序结果进行序列拼接，向 GenBank提交了序列，获得相应的
序列登记号(见表 1)。HMMer注释法分别得到秤星树等冬
青属 8种药用植物以“CGCATC”为始端和以“CGACCG”为
末端 235 ～246 bp的 ITS2区序列全长。
注:1．秤星树;2． 满树星;3．枸骨;4．秃毛冬青;5．毛冬青;6． 铁冬
青;7．三花冬青;M．(DL2000 Marker)。
图 2 PCR扩增结果电泳图
2． 3 多重比对与系统发生树 由图 3 可知，冬青属 8 种药
用植物的 ITS2 序列多重比对后序列长度为 254 bp，其中差
异位点 85个。秤星树种内最大遗传距离为 0． 009;与其他
几种药用植物的 ITS2 序列相似度达到 87． 53%。种间最小
遗传距离存在于枸骨与大叶冬青之间，为 0． 022;各物种可
以相互区别。满树星与秤星树相比较存在 23 个差异位点。
毛冬青与其变型秃毛冬青在 ITS2区段未见碱基差异。
根据 ITS2序列，构建系统发生邻接(NJ)树，各物种分支
支持率大于 96%(图 4)。结果显示，秤星树与同一亚属(落
叶冬青亚属，Subgen． Prinos (L．)Loes．)似落叶冬青组(Sect．
Prinoides (DC．)Gray)的满树星(I． aculeolata)及落叶冬青组
(Sect． Prinos)的落霜红(I． serrata)聚为一类，而与其他各种
差异较大;枸骨(I． cornuta)与同组(刺齿冬青组，Sect． Aquifo-
lium Gray)的大叶冬青(I． latifolia)聚为一类，与传统分类学
相符。
3 结论与讨论
试验结果表明，秤星树等冬青属 8 种药用植物 ITS2 序
列区段有较多的差异位点，形态上与秤星树甚为相似的满树
星也可以区别，说明该序列分析可以用于所述几种药用植物
的鉴定，亦可以为系统学分析提供参考。同时，该方法也为
来源于同属植物的药材鉴别提供依据。
秃毛冬青叶片长椭圆形或长卵状椭圆形，嫩枝无毛或微
具毛绒，曾被处理为毛冬青的变种［13］，而中国植物志将其合
并入毛冬青［1］，试验则以变型处理。序列分析未发现其与毛
冬青 ITS2序列存在碱基差异。毛冬青与变种广西毛冬青(I．
pubescens var． kwangsiensis)、秤星树与其变种大埔秤星树(I．
asprella var． tapuensis)、三花冬青与变种钝头冬青(I． triflora
var． kanehirae)等的 ITS2 序列是否有差异有待进一步分析。
因此，ITS2序列是否适合于冬青属植物种下阶元的系统学分
析，有待进一步研究。
586240 卷 5 期 童家赟等 基于 ITS2 序列的秤星树等冬青属 8 种药用植物的分子鉴别
图 3 秤星树等 8种冬青属药用植物 ITS2序列间差异位点
注:bootstrap 1000次重复，枝上数值仅显示自展支持率≥70%;A
刺齿冬青组，B 落叶冬青亚属。
图 4 基于 ITS2序列的秤星树与同属药用植物的邻接(NJ)树
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(下转第 2689页)
6862 安徽农业科学 2012年
性，可以应用于芹菜黄酮提取的理论预测。
表 6 响应面分析试验结果
试验编号 X2 X4 提取率 Y1∥%
1 －1 －1 4． 201
2 －1 1 4． 699
3 1 －1 5． 482
4 1 1 5． 581
5 －1． 414 0 4． 129
6 1． 414 0 4． 746
7 0 －1． 414 4． 038
8 0 1． 414 5． 708
9 0 0 5． 790
10 0 0 5． 801
11 0 0 5． 765
12 0 0 5． 854
13 0 0 5． 773
根据回归方程做出 X2 和 X4 的响应面分析图及等高线
图(图 2)。由响应面分析图可知，乙醇浓度和提取温度与
芹菜黄酮提取率存在显著的相关性，其中温度对芹菜黄酮
提取率的影响更为明显。同时，由相应的等高线图可知，乙
醇浓度与提取温度的等高线图接近圆形，两者的交互作用
不明显。
回归方程可应用于芹菜黄酮提取的理论预测，为获得最
佳提取条件，将回归拟和方程分别对各自的变量求一阶偏
导，并令其等于 0，得二元一次方程组，解此方程组即得出模
型的极值点:X2 = 0． 280 6，X4 = 0． 452 3，对应的实际值为乙
醇浓度 81． 40%，提取温度 57． 26 ℃;此时，芹菜黄酮最大提
取率 Y1 为 5． 93%。
考虑到实际操作的需要，将芹菜黄酮提取工艺条件修正
为乙醇浓度 81%，提取温度 57 ℃。为检验结果的可靠性，采
用修正条件进行 3 次提取试验，结果取平均值，得出芹菜黄
酮的实际提取率为 5． 81%，与理论预测值基本吻合。因此，
采用 RSM法优化得到的芹菜黄酮提取条件准确可靠，具有
一定的实用价值。
图 2 响应面分析立体图和对应等高线
3 结论
将析因试验、最陡爬坡试验和响应面分析法结合，应用
于芹菜黄酮提取工艺条件的优化，得出最佳提取工艺条件为
料液比 1∶15(g /ml) ，乙醇浓度 81%，提取时间 3． 0 h，提取温
度 57 ℃;在此条件下，黄酮提取率可达 5． 81%。试验优选出
了芹菜黄酮的最佳提取条件，为芹菜资源的深加工提供了理
论依据。
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13409 －13411．
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