全 文 ：·生物技术· 北方园艺 2008(8):172～ 175
第一作者简介:陈蕾(1982-),女 ,在读硕士, 研究方向为园艺植物
组织培养与生物技术。 E-mail:chenleisofia@yahoo.com.cn。
通讯作者:曹后男。 E-mail:hncao@ybu.edu.cn。
基金项目:国家自然科学基金资助项目(30560091);延边大学教育
基金会及延边大学农学院研究生创新基金资助项目。
收稿日期:2008-02-23
李属植物DNA提取及 RAPD反应体系的优化
陈 　蕾 , 曹 后男 , 宗成 文 , 朴 日子 , 肖佳 丽
(延边大学农学院园艺系 ,吉林龙井 133400)
　　摘　要:以 1号李 ,6 号李和公主红为试材 ,对李属植物 DNA 提取方法进行改良并进行
RAPD反应体系的优化。结果表明:改良CTAB(3%)法提取的DNA产量高 ,可满足 RAPD扩增
的需要。25μL反应体系中 ,DNA聚合酶 、Mg2+ 、引物 、模板 DNA和dNTPs 5种主要成分的适宜
浓度或用量分别是:1.0 U 、2.0 mmol/L 、10 pmol/ L、20 ng和 1.0 mmol/ L。
关键词:李;DNA提取;RAPD;优化
中图分类号:S 662.3;Q 523　文献标识码:A　文章编号:1001-0009(2008)08-0172-04
　　李 ,蔷薇科李属(Prunus L.)植物 ,是一类具有重要
经济价值的果木 ,在全世界都有广泛的栽培。该属大约
有30余种 ,分布于北半球气候温和的地带 ,其中我国有
8种和4个变种 ,中国是李属植物的起源中心和分布中
心之一。
分子标记技术以其简单 、快捷、实用等优势而成为
植物遗传育种领域研究的有力工具之一 ,提取到适用于
扩增的 DNA样品是该技术成功运用的前提。不同植物
或同种植物的不同组织 ,DNA的提取存在差异 ,从富含
多糖 、多酚和其他次生物质的果树叶片中提取 DNA 的
难度大于大多数的禾谷类及蔬菜作物 ,原因是在提取
DNA 过程中这些次生物质与 DNA共沉淀 ,形成黏稠的
胶状物而难以溶解或产生褐变 ,而且次生物质会严重抑
制 Taq DNA聚合酶的活性而影响扩增的效果[ 1] 。李属
植物叶片基因组DNA 的提取已有一些研究[ 2-3] ,最初参
照这些方法提取李属植物叶片基因组DNA ,但提取的效
果均不甚理想。后通过改良乔玉山[ 4] 等人的方法 ,筛选
出获取高质量 DNA ,可用于 RAPD反映的DNA提取方
法 ,并建立李属植物 RAPD反应体系。
1　材料与方法
1.1　试验材料
供试材料为 1号李 、6号李和公主红均取自珲春特
产局 ,于 6月上旬采集完全展开的幼嫩叶片 ,装入保鲜
袋 ,封口 ,置于样品贮藏箱(由超低温冰袋维持冷藏条
件)中带回实验室 , -70℃保存待用。
1.2　试验方法
1.2.1　基因组 DNA 的提取　DNA的提取采用 CTAB
法[ 5] 、改良CTAB 法和SDS法。①称取0.2 ～ 0.3 g叶片
放在预冷的研钵中加液氮研成粉末 ,研磨过程中取 1 g
迅速装入 1.5 mL 的离心管中 ,放入提取缓冲液(0.4
mmol/ L葡萄糖),充分混匀后在 4 ℃下 10 000 r/min离
心 10 min移去上清液 ,在叶片中加入700μL ,65 ℃预热
的裂解缓冲液。A:CTAB(2%), B:SDS ,C:改良 CTAB
(CTAB 的浓度增至 3%)之后再加入 20μL的 β-巯基乙
醇 ,轻轻颠倒混匀。②放在 65 ℃的水浴锅中温浴0.5～
1 h。每10min轻轻颠倒 1次 ,使叶片充分和缓冲液反
应。③取出待其冷却至室温后 10 000 r/min 离心
10 min。④将上清液移入新的离心管中 ,加入等体积的
氯仿∶异戊醇(24∶1),轻轻将其混匀。⑤8 000 r/min
离心 15 min后 ,抽取上清液。⑥重复④、⑤的步骤 1次。
⑦在上清液中加入0.7倍体积-20℃下预冷的异丙醇 ,
放入-20℃的冰箱中 30min。⑧从冰箱中取出离心管 ,
用移液枪挑出 DNA ,转入 1.5 mL的离心管中 ,用 70%
的乙醇漂洗3次 ,自然晾干DNA 。⑨根据所提 DNA的
多少 ,分别在小离心管中加入不同体积的 TE ,置于 37℃
水浴锅中溶解DNA 。⑩取DNA溶液4μL ,在0.7%的琼
脂糖上电泳 ,检测DNA浓度及纯度。检测后的 DNA 置
于-20℃长期保存。此外 ,还对比较珍惜的材料进行
DNA残留叶片进行第二次提取 ,即在步骤②之后 ,在残余
的叶片样品中再次加入裂解缓冲液。重复步骤②～ ⑩。
1.2.2　DNA浓度和纯度的检测　采用紫外吸收检测和
凝胶电泳检测。在 752型紫外分光光度计上测定在波
长为 260 nm 和 280 nm 处吸光光度值 ,根据 OD260/
OD280光吸收比值和通过 0.7%琼脂糖凝胶电泳 ,以
HindⅢ为 maker ,推算DNA分子的大小。
1.2.3　RAPD反应成分用量　首先确立基本反应条件 ,
即PCR反应总体积为25μL ,其中含模板DNA 20 ng ,引
172
北方园艺 2008(8):172 ～ 175 ·生物技术 ·
物20 pmol ,dNTP 1.50mmol/L ,MgCl2 1.5mmol/L ,Taq
DNA聚合酶 1 unit , 10×反应缓冲液2.5μL ,其余以重
蒸馏水补充至 25μL。以此为基本反应条件 , S118 、S17 、
S125为引物对反应体系中的模板 DNA 、引物 、dNTPs 、
MgCl2 、TaqDNA 聚合酶分别设置不同浓度梯度进行优
化并确定最适用量。
　　表 1 RAPD反应体系中5种成分的用量
浓度
梯度
MgCl2
/mmol·L-1
Taq DNA
聚合酶/ U
引物
/pmol
模板 DNA
/ng
dNTPs
/ mmol·L-1
1 0.5 0.5 5 10 0.5
2 1.0 1.0 10 20 1.0
3 1.5 1.5 20 30 1.5
4 2.0 2.0 30 40 2.0
5 2.5 2.5 40 50 2.5
1.3　PCR程序与参数
PCR反应在Eppendorf PCR仪上进行 ,反应程序为
94℃预变性5min ,94℃变性45 s ,36℃退火1min ,72℃延
伸2min共循环40次 ,最后72℃延伸 7min。
1.4　PCR产物检测
PCR扩增反应结束后 ,采用 0.5×TBE(pH=8.2)
电泳缓冲液 , 1.4%的琼脂糖凝胶 (含 0.5%EB)电泳。
取10 μL 扩增产物与 2 μL 电泳载体缓冲液混匀 ,
5 V/cm 恒压下电泳 2 h ,电泳产物在 GDS-8000型凝胶
成像仪下观察 ,拍照。
2　结果与分析
2.1　不同提取方法的DNA检测结果
DNA样液琼脂糖凝胶电泳分析图谱见图 1 ,从中可
以看出 ,3种提取方法均提出了较完整的基因组 DNA 。
从图1还可以看出 ,虽然加样量均为4μL ,但DNA 主带
的亮度明显不同 ,改良 CTAB 法(3%)和 CTAB 法较
SDS 法的条带的亮度明显亮 ,这也说明前 2种方法产率
较高。另外 ,以第1次提取后的残叶做为试验材料进行
DNA的 2次提取。结果表明 ,改良 CTAB 法(3%)和
CTAB 法残叶提取的DNA质量和第 1次的叶片提取的
DNA相比产率无明显差异或是更高 ,此方法可以用来
提取材料较少的样品的基因组总 DNA。从 DNA 纯度
和产率两方面综合考虑 ,改良 CTAB 法(3%)是该试验
筛选出的李叶片基因组 DNA 提取的适宜方法 ,用该法
提取其他李品种叶片基因组的 DNA ,经检测 OD260/
OD280值均在 1.7 ～ 1.9 之间 ,说明提取的 DNA 纯度
高、完整性好 ,完全满足扩增对DNA质量的要求。
2.2　模板浓度的筛选
试验所设定的模板 DNA 用量对 RAPD反应影响
不大(如图2),引物为 S17DNA用量在 10 ～ 50 ng范围内
均能扩增出比较清晰的条带 ,且效果没有太大的差别 ,
扩增条带基本一致 ,综合考虑 ,选用20 ng为试验筛选出
的适宜模板 DNA的用量。
图1 3种提取方法 DNA电泳图谱的表现
图 2　模板DNA 浓度对1 号李 RAPD
　扩增效果的影响(引物 S17)
　　
图 3　dNTP浓度对 1号李(引物S125)
　RAPD扩增效果的影响
2.3　dNTPs浓度筛选
以 1号李DNA 为模板 ,S125为引物 ,将 5个浓度梯
度的处理进行扩增。dNTPs作为 PCR反应的原料参与
新链 DNA的合成过程 ,对循环数、产物扩增的量均有较
大的影响。浓度过低 ,偶然性大 ,无扩增产物或扩增产
物不稳;浓度过高则会导致聚合酶错误掺入 ,影响扩增
的特异性和精确性。试验结果表明 , dNTPs 浓度为
0.5 mmol/L时扩增的条带不清晰 ,当浓度达到 1.0 ～
2.0 mmol/L时扩增条带清晰 ,2.5时缺失部分条带 ,为了
节约成本 ,选择 dNTPs 1.0 mmol/L为最适值。
173
·生物技术· 北方园艺 2008(8):172～ 175
2.4　TaqDNA 聚合酶浓度筛选
以1号李 DNA为模板 ,S118为引物进行 5个处理的
扩增。Taq DNA聚合酶浓度对 RAPD反应影响很大。
当 Taq DNA聚合酶用量为0.5 U时扩增的部分小片段
条带缺失 ,当用量为 1.0 U和1.5 U时扩增出的条带清
晰 ,且二者之间无明显差异。用量为 2.0 U和 2.5 U时
带型变得模糊 ,综合考虑扩增结果和成本 ,该试验选用
1.0 U为适宜的 Taq DNA聚合酶用量。
2.5　MgCl2浓度筛选
MgCl2是 PCR反应的一个重要影响因子 ,它不仅影
响扩增的真实性及产物的特异性 ,而且可能影响酶活
性 、酶准确性 、引物的退火温度 、引物二聚体的形成等诸
多方面 ,确定Mg2+最佳浓度至关重要。Mg2+浓度过低
时 ,Taq DNA聚合酶有所失活;过高时 ,则会使引物的错
配频率增加。以1号李 DNA为模板 ,S125为引物进行扩
增。由试验结果可以看出 ,Mg2+的浓度为 0.5 mmol/ L
到 1.5 mmol/ L时不产生扩增条带或缺失条带 ,随浓度的
增大 ,扩增条带明显增加 ,当 Mg2+的浓度为2.0 mmol/ L
时条带清晰 ,故为该试验筛选出的适宜的用量。
　　　　　图 4　Taq DNA聚合酶浓度对 1号李(引物 图 5　MgCl2浓度对 1号李(引物 S125)
　　S118)RAPD扩增效果的影响 　RAPD扩增效果的影响
2.6　引物浓度筛选
引物的浓度主要影响 RAPD扩增条带的出现和
强度 ,当模板 DNA 浓度一定时 ,引物浓度决定着扩增
效率与扩增片段的大小。引物浓度过高 ,就会过量扩
增小片段(<500 bp);而浓度太低 ,大的片段很容易被
反复扩增。以 DNA 1号李为模板 , S125为引物进行扩
增 。引物浓度为 5 pmol时扩增条带少 ,10 pmol时扩
增的条带清晰 ,当浓度达到 20 pmol和 30 pmol时部分
大分子量的带缺失。因此 ,该试验以 10 pmol的引物
量为最适值。
　　　　　　　　图 6　引物浓度对 1号李(引物 S17) 图 7　优化后的反应体系对1 号李(a), 6 号李(b),
　RAPD扩增效果的影响 公主红(c)扩增效果的影响(引物OPE20)
2.7　优化后反应体系的扩增效果
采用优化后的反应体系 ,用引物OPE20对1号李 、6
号李和公主红进行扩增。可以看出 ,扩增谱带清晰 ,重
复性好 ,这说明优化后的反应体系适于李属植物的
RAPD反应。
3　讨论与结论
RAPD分析的稳定性和重复性一直是国内外研究
者关注的问题 ,建立相对稳定的 RAPD反应体系是该技
术应用的基础。关于 RAPD优化反应体系的建立在许
多物种上均有报道 ,但不同物种之间反应体系存在一定
差异。Taq DNA聚合酶用量是重要的因子 ,它直接影响
多态性的检出率和扩增结果的重复性及忠实性。该试
174
北方园艺 2008(8):172 ～ 175 ·生物技术 ·
验的结果同样呈现出上述特点。Mg2+度是影响 DNA
聚合酶活性的主要因子 ,不同物种对 Mg2+浓度的要求
不同 ,从已有的报道看 ,Mg2+浓度范围大多在 1.5 ～ 3.0
mmol/ L之间 ,也有高达 7.5 mmol/L 的报道 ,该试验结
果是 2.0 mmol/L 时扩增产物较清晰。一般认为模板
DNA 、引物和 dNTPs等 3种因素适宜用量的范围较宽 ,
该试验结果也印证了这一点。
综上所述 ,影响 RAPD反应的因素很多 ,每个环节
的操作不当均可影响扩增结果的不可重复。通过建立
优化的反应体系 ,可获得稳定的结果。改良 CTAB 法
(3%)DNA提取效果较好 ,残叶提取 DNA的产率较好
于第一次叶片或无明显差异 ,此方法可用于珍惜材料
DNA提取。
该试验所筛选出的李属植物 RAPD反应体系为模
板 DNA的用量 20 ng ,dNTPs 1.0 mmol/L ,Taq DNA聚
合酶用量 1.0 U ,Mg2+的浓度为 2.0 mmol/L ,引物量 10
pmol时条带清晰 ,扩增结果稳定。
参考文献
[ 1] 　邹喻苹,葛颂 ,王晓东.系统与进化植物学中的分子标记[ M] .北京:
科学出版社, 2001:68-107.
[ 2] 　张俊卫,包满珠 ,陈龙清.梅、桃、李 、杏、樱的 RAPD 分析[ J] .北京林
业大学学报, 1998 , 20(2):12-15.
[ 3] 　沈向 ,郑学勤 ,任小林,等.核果类基因组DNA提取和 RAPD条件的
优选[ J] .山东农业大学学报 ,1999 ,30(2):154-160.
[ 4] 　乔玉山,章镇.中国李基因组 DNA 提取方法的优化[ J] .上海交通大
学学报(农业科学版), 2004 , 22(2):138-142.
[ 5] 　姜玲 ,蔡礼鸿.一种提取银杏中 DNA 的方法[ J] .植物生理学通讯,
2000 ,36(4):340-342.
DNA Extraction on Prunus and Optimal Reaction System of RAPD
CHEN Lei , CAO Hou-nan , ZONG Chen-wen , PIAO Ri-zi , XIAO Jia-li
(Agricultural College of Yanbian University , Horticulture Department , Longjing , Jilin 133400 , China)
Abstract:Used Number 1 plum , Number 6 plum and Gongzhuhong as the materials , improved DNA extraction on
Prunus plant and optimal reaction system of RAPD.The results showed that:modified CTAB(3%)method was the bet-
ter way based on quantity of genomic , could be used for RAPD analysis.The optimum concentration of five important
components i.e.Taq DNA polymerase ,Mg2+ ,primer , template DNA and dNTPs in 25 μL RAPD reaction system were
1.0U 、2.0 mmol/ L、10 pmol/L 、20 ng and 1.0mmol/L。
Keywords:Plum;DNA extraction;RAPD;Optimal
转基因食品安全吗 ?
基因是控制生物性状的最基本单位 ,记录着生物生
殖繁衍的遗传信息。通过修改基因能改变一个有机体
的部分或全部特征。转基因食品就是移动动植物的基
因并加以改变 ,制造出具备新特征的食品种类。譬如利
用生物技术将某些动物的基因转移到其它物种上去 ,通
过改造生物的遗传组织 ,使其出现原物种原来并不具备
的特征 ,这些转变可以按照人类所需要的目标来完成。
转基因食品是从实验室中走出来的 ,是人工制造出
来的。在讲究自然 、生态 、健康消费热潮的今天 ,转基因
食品被不少人视为“异类” ,把它打入“冷宫” ,可以说 ,转
基因食品的安全性倍受人们的质疑。
目前美国 60%以上的加工食品都是以转基因农作
物为原料。美国公众接受转基因食品的程度也最高 ,民
意测验显示 ,大多数美国人接受并采用利用生物技术生
产的粮食和食品。66%的法国人认为转基因食品对人
体健康有害 ,在英国也只有 14%的人接受转基因食品 ,
大多数消费者对转基因食品的安全性持怀疑态度。从
目前的情况看 ,转基因产品确实有些方面还说不清楚。
比如 ,食品安全方面有一些让人怀疑的地方。虽然自从
美国第一批转基因西红柿上市以来 ,全球约有 2亿多人
食用过数千种转基因食品 ,5年多来尚未报道过一例食
品安全事件;我国进口转基因大豆较多 ,据估计约有一
半的大豆色拉油中含有转基因成分 ,没有出现任何问
题 ,但国外的有些报道仍然值得关注。据英国媒体报
道 ,英国一位研究人员在电视节目中公布了他的实验成
果:用转基因马铃薯饲养大鼠 ,引起了大鼠器官的生长
异常 ,体重减轻 ,免疫系统遭到破坏。这件事情 ,虽然后
来被英国皇家学会组织的专门评审中定调为共有 6项
缺陷 ,但仍然引起了人们对转基因食品的怀疑。其实 ,
根据国际通行的生物安全评价办法 ,按照转基因生物对
人类 、动植物 、微生态和生态环境的危害程度 ,农业转基
因生物可分为4个等级。即安全等级Ⅰ(尚不存在危险);
安全等级Ⅱ(具有低度危险);安全等级Ⅲ(具有中度危
险);安全等级Ⅳ(具有高度危险)。可见 ,对转基因食品
的安全措施是有的 ,只要坚持“预先防范”的原则 ,是完
全可以确保转基因食品安全的。
175