全 文 ：文章编号:1000-1573(2009)04-0043-03
李属植物叶片红色性状 RAPD分子标记研究①
温　亮 , 　王中华 , 　霍雪梅 , 　李彦慧 ,
张晓曼 , 　杨建民
(河北农业大学 园林与旅游学院 , 河北 保定 071001)
摘要:以李属(Prunus)植物`红叶李 (P.salicina ×P .atropurupurea)和`安哥诺李 (Prunus salicina cv.
`angenuo )正反交的56 株F1代群体为试材 ,结合分离群体分组分析法(Bulked Seg regate Analy sis , BSA)构建“红
叶”和“绿叶”近等基因池 , 应用 RAPD标记技术 ,进行了李属植物叶片红色性状相连锁的分子标记研究。通过对
350 个随机引物的筛选 ,获得一个在红叶基因池中能稳定扩增的 RAPD 标记 ,该片段大小约为 2 300 bp。经过重
复性验证和群体单株验证 , 该标记片段仅在红叶个体(重组型除去)中出现 , 表明与李属植物叶片红色性状相
连锁。
关　键　词:李属;叶色;红叶性状;RAPD
中图分类号:S 718.46 文献标识码:A
RAPD markers linked to the red leaf traits of Prunus
WEN Liang , WANG Zhong-hua , HUO Xue-mei , LI Yan-hui ,
ZHANG Xiao-man , YANG Jian-min
(College of Landscape Architecture and Tourism , Agricultural University of Hebei , Baoding 071001 , China)
Abstract:In this study , a RAPD marker linked to red leaf t raits was screened from 350 RAPD
arbit rary primers in 56 F1 individuals f rom the cross P.salicina×P.atropurupurea and Prunus
salicina cv .` angenuo , leaf red /green pool w as constructed respectively using RAPD technique
and BSA method.After repeating tests and checking up individuals of populat ion , this marker could
only be amplified in the red leaf individuals(except recombinants).The size of this marker w as
about 2 300 bp.
Key words:Prunus;leaf color;red leaf t raits;RAPD
　　李属彩叶植物包括紫叶李(Prunus cerasi fera
var.at ropurpurea)、红 叶 李 (P.salicina × P .
atropurupurea)、黑 杆 樱 李 (Prunus wrasi fers
` Nigra )、 紫 叶 矮 樱 (Prunus × cistenena
` Pissardii )、 美 人 梅 (Prunus × bliriana
`Meirenmei )等 ,其鲜艳的叶色 、较长的观赏期 、易
于形成大色块景观以及可以弥补城市淡花季节单调
的色彩等诸多优点 ,在园林绿化中被广泛应用。彩
叶植物呈现彩色的直接原因就是叶片中的色素种类
和比例发生了变化[ 1] 。前人主要从叶片组织结构 、
生理生化变化 、环境因素(包括光照 、温度及土壤条件
等)、遗传稳定性[ 1-2]和叶色突变体[ 3]等引起的色素
变化方面 ,来研究彩叶植物的呈色机理 ,而关于彩叶
植物叶色的分子标记研究较少。本研究结合 BSA
① 收稿日期:2008-11-10
基金项目:河北省自然科学基金资助项目(C2007000508).
作者简介:温　亮(1983-), 男 ,河北省邯郸人 , 在读硕士生 ,主要从事果树分子生物学方面研究.
通讯作者:杨建民(1962-), 男 ,河北省清苑人 , 教授 ,博士生导师 , 主要从事李杏育种 、栽培生理及果树分子生物学方面
研究.
第 32卷第 4期
2 0 0 9年 7月
河 北 农 业 大 学 学 报
JOURNAL OF AGRICU LT URAL UNIVERSI TY OF HEBEI
　 　 Vol.32 No.4
Jul .2 0 0 9
(Bulked Segregant Analysis)法 ,利用 RAPD标记技术
筛选与李属植物叶片红色性状相连锁的分子标记 ,以
期在分子水平上了解叶色遗传机制 ,为李遗传图谱的
构建及利用该标记进行品种改良提供理论依据。
1　材料与方法
1.1　材料
试材为李属植物`红叶李 (红叶)和`安哥诺李
(Prunus sal icina cv .` angenuo )(绿叶)。杂交分离
群体:2007年 4月以`红叶李 和`安哥诺李 互为父
母本进行杂交 ,共获得 F1代杂交种子 56粒。2008
年3月播种 F1代杂交种子 ,并放入光照培养箱中培
养。2008年 6月按叶片颜色划分成红叶和绿叶两
个杂交分离群体 ,其中红叶个体 25株 ,绿叶个体 31
株。取幼嫩叶片放于-80℃保存备用。
1.2　方法
1.2.1　基因组 DNA 的提取　参考冯晨静[ 4] 的方
法提取 DNA并略做改进。取 0.5 g 左右叶片于研
钵中 , 加液氮研磨至粉状 , 加提取缓冲液(2%
CTAB , 1.4 mol/L NaCl , 100 mmol/L Tris -HCl ,
20 mmol/L EDTA , 2%βME , 1% PVP)3 mL 并转
移到 10 mL离心管中 ,混匀后 65℃水浴 40 min ,中
间轻晃几次;取出后 12 000 r/min 下 4℃离心 15
min ,弃上清(即第 1次提取缓冲液)后再加 3 mL 提
取缓冲液 ,混匀后 65℃水浴 60 min;然后 12 000 r/
min下 4℃离心15 min;取上清液转移到 1.5 mL 离
心管中(每管 600 μL),加等体积氯仿∶异戊醇(24∶
1),混匀后静置 10 min ,然后 12 000 r/min下 4℃离
心 15 min;取上清转移至新的 1.5 mL 离心管 ,加等
体积氯仿∶异戊醇(24∶1),重复抽提 2次;取上清加
2倍体积冰乙醇 ,置于-20℃冰箱 20 min 使 DNA
絮状沉淀生成 ,然后 10 000 r/min 下 4℃离心 10
min;弃上清 ,用 70%乙醇洗涤 3次;凉干后按沉淀
大小加 100 ～ 150 μL 无菌水 ,充分溶解后加 2 μL 的
10 mg/mL的 RNase A ,混匀后 37℃水浴 30 min;-
20℃保存备用。
DNA的质量和浓度用 1%琼脂糖凝胶电泳和
紫外分光光度计检测 ,然后将模板 DNA 浓度稀释
成 20 ng/μL 备用。
1.2.2　PCR 扩增及电泳检测　PCR扩增反应在
MyCycler
TM扩增仪(美国 BIO -RAD公司)上进行 。
反应体积 20 μL , 其中 10 ×PCR buf fer 2.0 μL ,
MgCl2 3.0 mmol/ L , dNTP 0.2 mmol/L ,随机引物
0.2 μmol/L , Taq DNA 聚合酶 2 U , 模板 DNA
20 ng ,余下用 ddH2O 补充 。反应程序为:94℃预变
性 5 min;94℃变性 1 min , 36℃退火 1 min , 72℃延
伸 2 min ,45个循环;最后 72℃延伸 5 min。扩增后
的产物在 1.0%琼脂糖凝胶(含 1 ～ 2 μL GoldView
Ⅰ型核酸染色剂)中电泳 ,制胶和电泳缓冲液为 1×
TAE(pH 约 8.5),在 50 V 恒压下电泳 1 h ,用 UV
凝胶成像紫外分析仪观察照相。
1.2.3 　引物的筛选与标记的验证 　采用
Michelmore[ 5]等的 BSA 方法 ,随机从红叶和绿叶
2个杂交分离群体中各取 5株 F1代杂交种的 DNA
样品等量混合 ,构成 1对“红叶”和“绿叶”近等基因
池 。用随机引物(购于上海生工)对这 2个近等基因
池及父母本 DNA进行 PCR扩增 ,对扩增产生多态
性的引物 ,再在其余 F1代单株 DNA 上进行验证 ,
以确定是否为与李属植物叶片红色性状相连锁的
RAPD标记。
2　结果与分析
2.1　DNA的纯度及完整性检测
用上述改良CTAB 法提取的叶片基因组 DNA均
呈无色 , 1%琼脂糖凝胶电泳检测其完整性较好 ,在
DNA条带附近及点样孔周围干净 ,主带清晰且没有
弥散现象 ,经检测 OD260/OD280比值介于 1.819 ～
1.954之间 ,产量为 580.52 ～ 823.15 μg/(g·FW),
说明所获得 DNA的纯度较高 ,产率也较高(图 1)。
1.DNA Marker 2000;2～ 11.DNA样品
图 1　基因组 DNA 的电泳图
Fig.1　The picture of electrophoresis for genomic DNA
2.2　李属植物叶片红色性状相关的 RAPD标记
以“红叶/绿叶”近等基因池及`红叶李 和`安哥
诺李 的基因组 DNA 为模板 ,用随机引物进行 PCR
扩增 ,筛选出 100条随机引物能扩增出条带 ,共获得
扩增带 514条 ,平均每条引物扩增出 5.14条带 ,扩
出的 DNA条带大小在 250 ～ 2 500 bp 之间。经重
复性验证后 ,发现 S450(序列为 5 -TCAGAGCGCC
-3 )这一引物扩增出约2 300 bp的多态性片段 ,能
稳定地出现在“红叶”基因池中 ,而在“绿叶”基因池
中不出现(图 2-A)。
44　　　　　 河 北 农 业 大 学 学 报 第 32卷
A:1.安哥诺李;2.绿叶池;3.红叶池;4.红叶李;5 、7.绿叶个体;
6.DNA Marker 2000;8～ 11.红叶个体
B:1.DNA Marker 2000;2～ 6.红叶个体;7～ 11.绿叶个体
图 2　引物 S450在不同叶色植株基因池中 、
个体和亲本的 PCR 扩增结果
Fig.2　The result of PCR amplification with primer
S450 in parents , individuals and different
leaf color gene pools
F1代群体上的进一步分析表明 ,引物 S450在红
色类型上可扩增出约 2 300 bp左右的 1条特异带
(图 2-B),说明该标记片段(S450 ～ 2 300)与李属植物
叶片红色性状相连锁。对其余 46个F1代个体上的
扩增结果显示 ,只有 1个为标记与性状的重组类型 ,
重组率为 1.785%(表 1)。经 Mapmaker 3.0 软件
分析表明 ,S450 ～ 2 300与李属植物叶片红色/绿色基因
的连锁距离为 11.2 cM 。
表 1　特异片段 S450 ～ 2 300在 F1 杂交后代中的分离
Table 1　Segregation of S450 ～ 2 300 in F1 hybridization individuals
杂交组合
Cro ss
叶色性状
Leaf color
F1 代
杂种株数
Hybrid No.
S450 ～ 2 300
有
Yes
无
No
重组率/ %
Recombination
frequency
红叶李×安哥诺李 红叶 19 19 0绿叶 10 0 10
安哥诺李×红叶李 红叶 6 5 1绿叶 21 0 21
1.785
3　讨论
提取高质量的 DNA 是分子生物学研究的基
础 ,李属彩叶植物与其它多年生木本植物一样 ,提取
基因组 DNA 过程中常常会出现氧化褐化现象 ,一
些褐色非可溶性物质与 DNA结合在一起 ,使 DNA
沉淀难溶 ,严重影响 DNA 提取的质量。为解决这
一问题 ,通常采用提取缓冲液中加入 PVP 和 β -巯
基乙醇以去除材料中富含的酚类物质[ 6] ,或在春季
取刚刚萌发的嫩叶 ,这些材料中多糖和酚类等次生
物质积累较少 ,有利于提取高质量 DNA[ 7] ,也可采
用同一提取缓冲液 ,分次提取 DNA[ 8] 。本试验第 1
次提取缓冲液中提取的 DNA ,电泳检测中点样孔很
亮 ,DNA主带不清楚 ,说明蛋白质含量高 ,DNA产量
低 ,提取质量差 ,所以在试验中被舍弃。而用第 2次
提取缓冲液提取DNA ,电泳检测点样孔不亮 ,DNA主
带清晰 、明亮且没有弥散带 ,产量为 580.52 ～ 823.15
μg/(g·FW),说明获得了高质量的 DNA。
RAPD分子标记技术结合 BSA 法是筛选与目
的基因紧密连锁的 DNA分子标记的一个很有效的
方法 ,木本植物大多数农艺性状基因的分子标记就
是利用此法获得的[ 9] 。该法应用的前提是构建一
个适宜的分离群体 ,果树多为杂合体 , 杂合位点在
F1代即分离 ,因此果树上常用 F1代群体来构建近
等基因池。本研究以不同的`红叶李 和`绿叶李 种
质资源互为父母本构建杂交组合进行人工授粉杂
交 ,从中选择出种子发育正常 、数量多的杂交组合
`红叶李 和`安哥诺李 ,用来构建红叶和绿叶杂交
分离群体 ,共获得 F1代杂交种子 56粒 。本研究对
红叶和绿叶 2 个近等基因池及父母本 DNA 进行
PCR扩增来筛选随机引物 ,发现引物 S450在红色类
型中能稳定扩增出约 2 300 bp的多态性片段 ,而在
绿色类型中不出现 ,表明该 RAPD标记片段与李属
植物叶片红色性状相连锁 ,从而在分子水平上初步
研究了李属植物叶色的遗传机制 。
足够大的研究群体是研究结果可靠性的保证。为
了进一步验证该 RAPD标记的稳定性和可靠性 ,还应
该继续扩大研究群体 ,在更多李属植物中得到检验。
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(编辑:宗淑萍)
45　第 4期　　　 温　亮等:李属植物叶片红色性状 RAPD分子标记研究