全 文 ：果 树 学 报 2008,25(4):521～525
JournalofFruitScience
利用苹果SSR引物分析山楂属植物遗传关系
张 叶 1,代红艳 1,2,张琪静 2,李 贺 1,2,张志宏 1,2*
(1沈阳农业大学果树生物技术与遗传改良创新团队,2沈阳农业大学园艺学院,沈阳110161)
摘 要:SSR引物在不同物种间具有通用性,从 141对苹果属 (Malusspp.)SSR引物中筛选出 10对适合于山楂属
(Crataegusspp.)植物的SSR引物,并对8个种37份山楂种质资源的遗传关系进行了分析。10对 SSR引物共检测到
91个多态性谱带,每个位点的等位基因数为3～13个,平均为9.1个。位点杂合度为0.432～0.790,平均为0.688。10对
SSR引物可以将20份山楂资源区分开,17份不能区分的资源分为 3组,第 1组为 3个伏山楂品种,第 2组和第 3组
分别包括大果山楂的2个和12个品种。基于SSR标记构建的聚类树状图将供试37份山楂资源分成2个类群,第1
类群包括6个山楂野生种,第 2类群包括供试的所有伏山楂、山楂和大果山楂资源。该聚类结果与传统形态学分类
一致。
关键词:山楂;苹果SSR引物;遗传关系
中图分类号:S661.5 文献标识码:A 文章编号:1009-9980(2008)04-521-05
AssessmentofgeneticrelationshipinCrataegusgenusbytheappleSSR
primers
ZHANGYe1,DAIHong-yan1,2,ZHANGQi-jing2,LIHe1,2,ZHANGZhi-hong1,2*
(1TeamofBiotechnologyandGeneticImprovementofFruitTrees,ShenyangAgriculturalUniversity,2ColegeofHorticulture,ShenyangA-
griculturalUniversity,Shenyang,Liaoning110161China)
Abstract:ThetransferabilityofSSRsinformationfromonespeciestoanotherspecieshasbeenproven.Inthisstudy,weat-
temptedtotransfer141SSRprimersderivedfromappletohawthorn,andstudythegeneticrelationshipamong37hawthorn
germplasms,belongingto8species.Only10primerpairswhichsuccessfulyamplifiedclearandpolymorphicbandpaterns
indicatingsinglelocuswereselectedforhawthorngeneticanalysis.Atotalof91alelesweredetectedfrom10SSRloci,with
anaverageof9.1alelesfrom3to13.Heterozygosityforindividuallocusrangedfrom0.432to0.790,withanaveragehet-
erozygosityfor10lociequaling0.688.Twentyaccessionscouldbediferentiatedfromeachother.seventeenaccessionsthat
couldnotbedistinguishedweredividedinto3groups:thefirstgroupincluded3genotypesofCrataegusbretschneideri;the
secondandthethirdgroupincluded2and12cultivarsofC.pinnatifidavar.majorrespectively.UPGMAclusteranalysisof
the37hawthornaccessionsbasedonSSRmarkersresultedin2clusterswhichappearedtoberelatedtotraditionalmorpholo-
gyclassification.ClusterIcontains6wildspeciesofhawthorn,andtheaccessionsofC.bretschneideri,C.pinnatifidaand
C.pinnatifidavar.majorgroupedinclusterI.
Keywords:Hawthorn;AppleSSRprimer;Geneticrelationships
山楂属于蔷薇科山楂属(Crataegusspp.),广泛
分布于亚洲、欧洲、中北美和南美北部。山楂不仅
是一种重要的果树,也是重要的观赏植物和药用植
物[1-2]。全世界的山楂属植物约有 140～200个种,其
中原产于我国的有18个种6个变种[3]。山楂资源丰
富,亲缘关系复杂,目前主要根据植物学性状对山楂
种质资源进行评价鉴定。这种方法容易受环境的影
响,而且能区分山楂资源的性状十分有限,所以生产
上同物异名和同名异物现象十分普遍。因此,开发出
一种快速有效鉴定山楂资源的方法十分必要。
SSR(simplesequencerepeats)也称微卫星DNA,
是指以少数几个核苷酸(一般为2～4个)为单位多次
串联重复的DNA序列。与其它DNA分子标记技术
相比,SSR标记具有呈共显性遗传、多态性高、分布于
整个基因组中的优点。另外,SSR标记是基于常规
PCR的一种分子标记技术,因此操作比较简单,对
DNA质量要求较低。这些优点使SSR标记越来越广
泛地应用于植物遗传分析领域。目前,SSR技术也广
收稿日期:2008-03-20 接受日期:2008-04-28
基金项目:辽宁省高等学校创新团队支持计划(2007T161)
作者简介:张叶,女,在读硕士生,从事遗传学研究。E-mail:zhangyesyau@163.com
?通讯作者。Authorforcorespondence.Tel:024-88487143,E-mail:zhangz@syau.edu.cn
DOI:10.13925/j.cnki.gsxb.2008.04.037
果 树 学 报 25卷
编号
Code
山楂资源名称
Nameofaccession
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
30
31
32
33
34
35
36
37
准葛尔山楂Zhunge’ershanzha
甘肃山楂Gansushanzha
光叶山楂Guangyeshanzha
阿尔泰山楂A’ertaishanzha
左伏2Zuofu2
吉伏1Jifu1
吉伏2Jifu2
辽宁山楂Liaoningshanzha
毛山楂Maoshanzha
开原软籽Kaiyuanruanzi
新宾软籽Xinbinruanzi
垂枝山里红Chuizhishanlihong
秋红Qiuhong
秋丰Qiufeng
雾灵红Wulinghong
抚顺上砖白Fushunshangzhuanbai
秋金星Qiujinxing
大金星Dajinxing
山东大金星Shandongdajinxing
银冶岭1号Yinyeling1
聂家峪2号Niejiayu2
溪红Xihong
辽红Liaohong
甜水山楂Tianshuishanzha
西丰红Xifenghong
益都大黄面Yidudahuangmian
子母红Zimuhong
益都敞口Yiduchangkou
益都红口Yiduhongkou
徐州大货Xuzhoudahuo
黄宝峪1号Huangbaoyu1
滦红Luanhong
隆化粉肉Longhuafenrou
紫珍珠Zizhenzhu
叶赫山楂Yeheshanzha
吉林大旺Jilindawang
河南豫北红Henanyubeihong
表1试验用山楂资源
Table1Hawthornaccessionsusedinthisstudy
泛地应用在果树上,如苹果[4-6]、桃[7-9]、葡萄[10-11]和梨[12]
等。
虽然 SSR标记是一种十分有效的分子标记方
法,但是由于开发 SSR引物费用高昂,SSR的应用
受到一定的限制。近些年来,人们越来越关心SSR
引物在不同物种间的通用性(Transferability)问题,
一般认为 SSR引物在同科不同属或者更近的物种
间具有适用性,这方面已有一些研究报道[7,11-16]。至
今尚未有SSR标记技术在山楂上的研究报道,作者
旨在从蔷薇科苹果属的 SSR引物中筛选出适合于
进行山楂属遗传分析的SSR引物,从分子水平上研
究山楂属植物的遗传关系,为山楂分类和核心种质
构建奠定基础。
1 材料和方法
1.1 植物材料
以国家果树种质沈阳山楂圃种植保存的 37份
山楂(Crataegusspp.)资源为试材,包括准葛尔山楂
(C.songarica)(1)、甘肃山楂 (C.kansuensis)(2)、光
叶山楂 (C.dahurica)(3)、阿尔泰山楂 (C.altaica)
(4)、伏山楂(C.bretschneideri)(5~7)、辽宁山楂(C.
sanguinea)(8)、毛山楂(C.maximowiczi)(9)和山楂
(C.pinnatifida)(10~12)等 8个种及大果山楂(C.
pinnatifidavar.major)变种(13~37)(表1)。
1.2 总DNA提取
取1a生枝条上健康嫩叶,液氮速冻后-70℃冰
箱中保存备用。采用改进的CTAB法从山楂幼叶中
提取总DNA,具体操作参见肖敏等[17]的报道,提取缓
冲液中CTAB的浓度由2%提高至3%。DNA质量和
浓度用琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计 (UV-
Visible,BeckmanDU800)检测合格后,样品稀释到
50mg/L置-20℃保存。
1.3 PCR扩增
选择141对苹果属植物上开发出的 SSR引物。
PCR反应体积为 20μL,内含 1×PCR反应缓冲液
(10mmol/LTris-HCl,40mmol/LKCI,2mmol/LMgCl2,
pH9.0),50ng总 DNA,0.5μmol/L引物,0.2mmol/L
dNTPs,1UTaq聚合酶。扩增程序为 94℃预变性 5
min;94℃变性30s,50～60℃退火45s,72℃延伸45
s,30个循环;最后72℃延伸8min。扩增产物用6%
聚丙烯酰胺凝胶电泳,银染检测。
1.4 数据分析
根据条带的有无统计所有的二元数据:有带记
作1,无带记作 0,根据二元数据计算位点杂和度,
计算公式:H=1-∑Pi2,Pi代表第i个等位基因出现
的频率。利用NTSYS-pcver2.10e统计分析软件对
数据进行分析,品种间的相似系数按Jaccard公式计
算,以非加权类平均法(unweightedpair-groupmethod
witharithmeticaverages,UPGMA)进行聚类分析和构
建树状图。
2 结果与分析
2.1 引物筛选
在选择的 141对苹果属 SSR引物中,112对从
山楂基因组DNA中扩增出特异谱带,但是大部分扩
增出的谱带带型复杂,无法进行遗传分析。根据谱带
数目、多态性及分辨率,从中筛选出 10对适合山楂
SSR分析的引物,它们是04f3、17e6、28f4、CH02b10、
CH02g04、CH02h11a、CH03b10、CH05d03、CH05d11、
CH05e06(表2)。这10对引物扩增出的等位基因片
522
4期 张 叶等:利用苹果SSR引物分析山楂属植物遗传关系
Coeficient
图1 引物CH03b10在37份山楂资源上的扩增结果
泳道1～37为山楂样品,名称见表1;M.50bpDNAladder
Fig.1TheprofileofSSRamplificationin37hawthorngermplasmsusingtheprimerpairCH03b10
Lanes1～37HawthorngermplasmsthesameasinTable1;M.50bpDNAladder
表2 SSR引物对37份山楂资源的扩增结果
Table2Amplifiedresultsof37hawthorngermplasmswithSSRprimers
引物对名称
NameofPrimerpair
参考文献
Reference
苹果中谱带长度
FragmentsizeinMalus
(bp)
04f3
17e6
28f4
CH02b10
CH02g04
CH02h11a
CH03b10
CH05d03
CH05d11
CH05e06
Guifordetal.(1997)
Guifordetal.(1997)
Guifordetal.(1997)
Liebhardetal.(2002)
Liebhardetal.(2002)
Liebhardetal.(2002)
Liebhardetal.(2002)
Liebhardetal.(2002)
Liebhardetal.(2002)
Liebhardetal.(2002)
111
109
112
121～159
132～197
104～132
99～121
152～187
171～211
125～222
山楂中谱带长度
FragmentsizeinCrataegus
(bp)
90-130
80-110
100-170
80-140
160-210
110-140
90-120
150-190
170-210
100-150
等位基因数
No.ofaleles
5
9
3
12
8
10
13
8
10
13
位点杂合度
H
0.633
0.583
0.432
0.729
0.694
0.711
0.790
0.739
0.780
0.784
段长度与相应引物在苹果上扩出的等位基因的片段
长度范围基本一致。图1为引物对CH03b10扩增产
物的电泳图谱。
2.2 遗传多样性及亲缘关系分析
以表2中的10对引物对37份山楂资源进行遗
传多样性分析,结果表明10对引物共检测到91个
多态性条带,每个位点的等位基因数为3～13个,平
均为 9.1个。位点杂合度为 0.432～0.790,平均为
0.688(表2)。这10对引物可以将20份山楂资源相
互区分开,17份不能区分的资源分为3组:第1组
为3个伏山楂品种,分别为左伏2、吉伏1和吉伏2;
第2组为2个大果山楂品种秋金星和大金星;第3
100bp
M 12 34567 8910111213141516171819202122232425262728293031323334353637
图2 供试37份山楂资源的系统树状图
编号1-37见表1
Fig.2Dendrogramofthe37hawthorngermplasmsinthisstudy
No.1-37HawthorngermplasmsaslistedinTable1
0.53
1
2
3
4
8
9
5
6
7
10
11
12
13
17
18
16
19
20
21
22
23
24
25
26
31
33
35
37
36
30
28
32
34
29
15
14
26
27
0.30 1.000.770.07
C.songarica
C.kansuensis
C.dahurica
C.altaica
C.sanguinea
C.maximowiczi
C.bretschneideri
C.pinnatifida
C.pinnatifidavar.major
523
果 树 学 报 25卷
组为12个大果山楂品种,分别为抚顺上砖白、山东
大金星、银冶岭1号、聂家峪 2号、溪红、辽红、甜水
山楂、西丰红、黄宝裕1号、隆化粉肉、叶赫山楂和河
南豫北红。这3组之间可以相互区分,而组内各品种
在这10个位点表现均相同。以上结果说明山楂资源
种间遗传多样性较丰富,但种内遗传基础可能比较
狭窄。
应用 NTSYS-pcver2.10e软件、根据 UPGMA
进行聚类分析(图2),结果表明37份山楂资源聚为
两大类群:第1类群包括6个山楂野生种,它们是准
葛尔山楂、甘肃山楂、光叶山楂、阿尔泰山楂、辽宁山
楂和毛山楂;第 2类群包括 31份山楂资源,这一类
群可以分成3个亚类,第1亚类包括3份伏山楂资
源,第2亚类包括山楂的3份野生资源,第3亚类包
括25份大果山楂资源,该聚类结果与传统的形态学
分类结果一致[3]。
3 讨 论
山楂是一种重要果树,中国山楂资源研究工作
开展较早,但至今主要还是通过植物学特征和生物
学性状调查对山楂资源进行评价鉴定。虽然分子标
记技术已广泛应用于很多果树上,但至今在山楂上
应用的很少。近2a来,本实验室系统地开展了分子
标记在山楂上应用的研究,建立并优化了山楂
RAPD和 ISSR分析体系[18],评价了山楂的遗传多样
性[19],这些研究工作为山楂分类、种质资源鉴定和核
心种质构建奠定了基础。
物种之间 DNA序列的同源性使得不同物种间
转移使用SSR引物成为可能,现在已有一些实验证
明果树同科不同属或更近物种间可以共用某些SSR
引物。例如,Cipriani等[7]从桃基因组文库中获得17
对SSR引物,其中88%的引物能在桃属的栽培桃、
油桃和罐藏桃中扩出多态性片段,59%的引物能在
近缘种如日本李、欧洲李、杏、酸樱桃和甜樱桃中扩
增出多态性片段;Claire等[20]用葡萄的9对引物对同
科的5个不同属进行扩增,成功率高达51.1%;Ya-
mamoto等[12]的研究结果表明所有测试苹果 SSR引
物在36份梨种质中均产生可区分的扩增片段。这些
实验结果显示果树同科不同属或更近物种间转移使
用SSR引物的成功率比较高。本论文结果显示将苹
果SSR引物应用于山楂的成功率较低,这可能是山
楂与苹果的亲缘关系稍远,DNA序列间同源性较低
的缘故,也可能是我们对适宜引物的选择标准比较
严格导致的。尽管苹果SSR引物在山楂上转移的成
功率较低,但是随着越来越多的苹果SSR引物被开
发出来,特别是 EST-SSR引物的开发,相信适用于
山楂的引物也会逐渐增加。
本研究中 10个位点平均杂合度为 0.688,从
0.432～0.790。该结果与在苹果上的研究结果[4-5]较为
一致,而高于一些李属植物的位点杂合度,如桃平均
位点杂合度为 0.47[21];甜樱桃平均位点杂合度为
0.49[13];杏平均位点杂合度为0.51[22]。尽管每个位点
的等位基因数和杂合度相对较高,但是只有20份山
楂资源可以相互区分开,这些数据表明将苹果SSR
引物应用于山楂进行遗传分析并不是一个非常好的
办法,所以根据山楂本身基因组开发山楂 SSR引物
十分必要。因为SSR标记是一种特异引物标记,所
以必须知道山楂 DNA序列才能设计引物进行 PCR
扩增,但是目前山楂基因组还没有测序,因此我们计
划在山楂 ISSR(inter-simplesequencerepeat)序列
的基础上开发SSR引物。本实验室已经得到了一些
山楂ISSR序列[19],下一步我们计划利用染色体步移
方法得到相应的山楂 SSR序列及其侧翼序列,然后
根据 SSR侧翼序列设计开发出山楂自身 SSR引
物。
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