全 文 ：果 树 科 学 1 98 6第 4期 4 2一 4 5
李属植物幼叶染色体观察方法初报
晃无疾 苏玉萍
(西北农业大学园艺系 )
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一 、 引 言
目前 , 国内外从事果树染色体研究者日
益增多。 以往观察果树染色体多用常规压片
— 铁矾苏木精染色法和 G ie m s a染色法。 虽然铁矾苏木精染色法染色效果好 , 但取材须
用根尖 , 局限性较大 。 同时由于细 胞 壁 存
在 , 原生质不易充分铺开 , 染色体易重叠 ,
观察记数困难 , 去壁低渗 G i e m sa 染色 法 的
优点在于通过酶解和后低渗 , 使细胞壁完全
解离 , 从而使细胞膨胀不受壁的约束 , 细胞
充分吸水膨大 , 染色体分散性好 , 易观察记
数 , 而且可以进一步进 行 分 带 研 究 , 但
取材局限性也较大 ,且不同树种酶解时间 ,酶
液组成比例及 p H值范围等都不易掌握 。 为
此 , 探讨一种简单易行 , 且能弥补上述两种
方法的不足 , 兼顾双方优点的新方法 , 将对
果树遗传育种的研究有重大意义 。 本试验目
的在于探讨以李属植物幼叶为材料 , 观察染
色体的新方法— 去壁低渗苏木精染色法 。
6 , 0 0一 1 2 , 0 0时 ( 夏 令时 ) 每隔 z 小时采
样一次 , 共七次 。 幼叶长度分 别为 o . sc m 以
内、 1 。 0 、 1 。 4 、 1 . 6 、 1 . 8、 2 . 0 、 2 。 s e m 几
种 。
2
。 方法
用两种方法作对 比 , 即常规苏木精染色
法和去壁低渗苏木精染色法 , 其步骤如下 :
常舰铁矾苏木粉染色
( IN H C I离析 )
取 材 . 报尖
去盆低诊铁矶苏未柑染色
( 泥合醉醉娜 )
幼叶 、 茎央 、 很央
同左 专
固 定 ,
二 、 材料和方法
1
。 材料
采用西北农业大学栽培的 P r u n u s 属 内
的桃 〔P r u n o s P e r s i e a ( L 。 ) B a t s e h 〕 , 巴
旦杏 〔P r u n u s A m y g d a l u s B a t s e h 〕 , 碧
桃 〔P r u n u s P e r s i e a V a r 。 d u p l e x R e n d〕 ,
山桃〔P r u n u s D a v i d i a n a ( e a r r 。 ) F r a n e h〕
的幼叶 、 茎尖 、 根尖为材料 , 采样时间上午
将所取材料放入饱
和对二 抓苯溶液 中
2 一 8 小时后水洗
数 次。
将材料转入固定液
( 甲醉 : 冰困成 二
2 : 1 ) 中固定 2 0
一 24 小时 。
将材料水洗数次后
转入 I N H C I溶滚
中 6 0℃保持 15一 2 0
分钟 。
同左
将材料放入 O . O7S M
K C I溶 液中 处 理
3 0一 6 0分钟 , 水瑰
数 次。
将材料转入 2 . ` %
泥合醉 ( 2 . 5 %果
胶醉 和 2 . ` % 纤维
素醉按 i : 1 . 1~
1
.
2沮合 ) 中 , 室
沮下 ( 2 5℃ 士 2℃ )
醉解 4 一 15 小时 。
材料用燕该水洗盆
次后 , 在其中停 留
8 一 3 0分钟 。
DOI : 10. 13925 /j . cnki . gsxb. 1986. 04. 008
第 4 期 兔无疾等: 李属植物幼叶染色体观察方法初报
件 集 . 将材料转入 毛% 长
l
l砚中裸染 1 一 6 小
!
! 时 , 水洗 肠次 , 每
!
! 次 6 分钟 -寺染 色 . 将材料放入 0 . 5%
l
}
苏木抽中一2’ 小
! 时 , 水洗致次 。十
软化压片 . 切取~ 小袂材料
!
1 1 吸玻片上 , 演一
!
! 演` S%幽咬 , 片刘
l
{
后压片 ·
俄植观 寮寺封 片 。 . 检有好的分裂相
l
! 时 , 冰冻后在二 甲
!
l 苯 中通明 一` 一 20分
!
! 钟 , 用中性树胶封
!
! 片 。十
姚 维 。 周左
!
}
!令染 色。 同左
!
l
l
l寺软化压片 。 同左
l
!
!
!
}
. 检观察
寺封 片 . 同左
仅有植株而无种子的材料 , 或者虽有种子 ,
但数量较少且较珍贵的植物 , 应用此法观察
染色体 , 意义更大 。
2
。 对长度在 2 . s c m 以内的幼叶分别制
片观察 , 发现长 1 . c6 m 以内的幼叶容易 成功 ,
大于 1。 c7 m 的幼叶 , 叶绿体分化较多 , 分生
细胞相对较少 , 难以取得 良好的观察效果 。
所以采样叶片以 1 。 c6 m 以内为佳 。
3
。 试验从上午 6 : 0 0至 12 : 0 0时每隔 1
小时采样一次 , 分别制片观察 , 统计不同采
样时间中期分裂相细胞数量 ( 表 1 ) 。 从表
表 1 不同采样时间中期分裂相细自傲 -
( 单位 : 个 )
三 、 结果与讨论
1
。 应用去壁低渗苏木精染色法成功地
对李属 内儿个种进行染色体计数及细胞分裂
周期的观察 , 均获得良好的结果 ( 照 片 附
后 ) 。
与常规压片法相比 , 该方法主 要 优 点
是 : 以酶解代替酸解 , 使具纤 维素 的 细胞
壁完全解离 , 细胞间果胶质溶解 , 细胞彼此
分开 。 再加上后低渗 , 细胞充分吸水膨大 ,
染色体分散 , 原生质平铺 , 易观察计数 。
与 G ie m s a染色法相比 , 主要优点 是 :
以铁矾苏木精代替 G ie m s a 染色 , 避 免了因
G ie m s a染色 p H值难以掌握所导致的困难 ,
从而提高了成功率 。
更为突出的优点是 , 无论根尖 、 茎尖 、
幼叶均可作观察材料 。特别是用幼叶 , 取样方
便 , 时间长 , 冬季 也可在温室扦插枝条促使
萌发 , 供试验观察 。 对于某些难以发根的植
物 , 如李属 ( P r u n u s ) 中某些种类 , 或者
采样时间 6 : 0 0 7 : 0 0 8 : 00 9 : 0 0 10 : 0 0 1 1 : 00 1 2 : 00
统计片于 5 6 l 4 12 8 了 6
欲
处于中期 0 1 6 4 6 0 1 0 0
分裂相细
饱致
每视野中 0 0 。 0 6 l 。 5 2 1 . 6 7 G。 0 4 0 0
中期分裂
相细饱数
〔注 〕 每个片于取 8 个视好 , 统计 中期 分裂相细血欲
1 看出 , 8 : 。O时和 9 : 0 时采样最好 , 获得的
中期分裂相最多 , 平均每个视野中 , 中期分
裂相细胞为 1 . 52 和 1 . 67 个。
若采样早于 7 : 0 时 ,分裂细胞很少 。 晚
于 10 : 。 O时 , 后期分裂相细胞较多 , 中期分
裂相细胞较少 , 因而很难得到理想的制片 。
4
。 李属植物幼叶含纤维和胶质较多 ,
酶的浓度和比例对处理效果影响较大 。
( 1 ) 醉的浓度及比例 : 材料不同 , 醉
解时间及混合酶液的比例浓度也不同。 试脸
中对果胶酶 : 纤维素酶的比例 , 分别设 i :
1
,
1 : 1
.
1
,
1 : 1
.
2三个处理 , 酶液浓度
均为 2 。 5% 。 结果表明 , 以 l : l 。 1 比 例 最
好 。 该处理材料易分散 , 制得的片子清晰 。
而对某些果树 ( 如葡萄 、 苹果 ) 幼 叶 茸 毛
长 , 纤维组织发达 , 则应适当提高纤维素醉
果 树 科 学 1 0 8 6
比例 , 或先用纤维素酶处理 , 再用混合酶处
理 。
( 2 ) 酶解时间 : 酶解时间伸 缩 性 较
强 , 以往报道幼根 , 叶芽酶解 2 一15 小时 。
本试验在室温条件下 ( 25 土 2 ℃ ) , 以 1 ,
1
.
1 ( 2
.
5%果胶酶 : 2 . 5%纤维素酶 ) 的混
合醉处理幼叶 , 酶解时间分别采用 4 、 5 、
6 … … 15 小时 12 个处理 。 通过试验得出 : 幼
叶酶解时间以 9 一 13 小时为宜。 酶解短于 8
小时 , 材料软化不够 , 细胞壁不能 完 全 去
掉 , 细胞分散性差 , 给制片 带 来 困难 。 反
之 , 酶解超过 14 小时 , 后低渗结束时 , 细胞
破裂严重 , 很难找到一个完整良好 的 分 裂
相 。
5
. 在一般的苏木精染色中无后低渗这
个环节 。 后低渗的主要目的是为了使细胞在
低渗液中充分吸水膨大 , 从而使原生质得以
扩散 , 染色体平铺 , 分散均匀。 后低渗时间
长短对观察染色体也有一定影响。 本试验采
用 8 、 1 0 、 1 5 、 2 0 、 3 0分钟 5 个处理 , 结果
表明 : 15 一 20 分钟为宜 。 若后低渗 时 间 太
短 , 细胞膨胀不足 , 染色体分散不均匀 , 易
出现重叠 。 反之 , 细胞过度吸水膨胀 , 易引
起细胞严重破裂及染色体散失 。 充分酶解和
合适的后低渗 , 细胞既能充分膨胀 , 又不致
于过分破裂 。 统计表明 , 采用该处理 , 分生
细胞比常规压片法显著增大 ( 表 2 ) 。 随着
细胞体积的增大 , 染色体分散随之 更 加 均
匀 、 平铺 , 便于观察计数 。
6
。 染色处理对观察染色体的影响 ( l )
媒染 : 铁矾媒染的关键在于一定要 媒 染 充
分 。 时间宁长勿短 , 但并非越长越好 。 在室
温条件下 , 用新配制的 4 %铁矾分别媒染 l ,
2
,
s
,
4
,
5
,
6 小时 , 结果表明 : 媒染
2 一 4 小时效果好 。 少于 2 小时 , 效果不理
想 , 超过 4 小时 , 材料新鲜度下降 , 影响分
辨效果 。 ( 2 ) 苏木精染色 : 苏木精染色的
原则与铁矾媒染相同 。 若染色时间过长 , 原
衰 2 两种处理中分生细脸大小变化
( 单位 : 个 )
洲定结果 常规压片法 去盆低沙苏木抽维色法
长 X 3 。 5 3 . 。 7 4
S 0
。
8 2 7 1
。
4 7 1
C
.
V
。
2 3
。
4 1 1 5
。
1 0
龙 X 2 。 6 2 8 。 7 8
S 0
。
5 0 B 1
。
2 0 9
C
.
V
。
19
。
3 0 13
。
7 7
〔注 〕 在 5 个片于中比机观察50 个细 .
生质着色浓 , 影响观察。 即使用醋酸脱色 ,
也不理想 。 通过染色 3 , 6 , 9 , 1 2 , 1 5 ,
1 5
,
2 1
,
2 4小时 s 种处理比较 , 结果表明 :
苏木精染色 6 一 12 小时较为理想 。
四 、 结 论 一奋
1
。 去壁低渗苏木精染色法是李属植物
染色体观察的好方法 。 尤其是试材用幼叶
采样方便 , 来源广泛 , 采样时间长 , 重复性
高 , 方 法 简 单 , 效果好 。 适用于 染 色 体
计数 、 核 型分析和染 色体 分 裂 周 期 的观
察 。
2
. 采样时间以夏令时上午 8 , 0 一 9 : 0
时最好 。 幼叶大小应控制在 1 . c6 m以内。 对
二氯苯预处理以 2 一 3 小时为好 。
3
. 酶液浓度及比例对酶解效果影响较
大 。 李属植物幼叶以 2 。 5%的果胶酶和 2 。 5%
纤维素酶比例为 1 : 1 . 1( 果胶酶 : 纤维素酶 )
组成的混合酶室温下处理 9 一 13 小时 , 后低 毒
渗 20 分钟最为合适 。
4
. 媒染和苏木精染色时间不宜过短或
过长 , 一般用新配制的 4 %铁矾媒染 2 一 4
小 时 , O。 5% 苏 木 精 染 色 6 一 12 小 时 为
好 。
晃无疾等 :李属植物染色体观察方法初报 · 4 5.
附图 1.桃细胞分裂周期图
沂
贾 - 2.碧桃 、 山桃 、 巴旦杏细胞分裂图
去 ①碧桃 中期
( Z
n = 1 6)
②山桃前期
③ 山桃 中期
( Zn = 1 6)
④ 巴旦 杏中期
( Zn = 1 6)