全 文 ：杨属转基因植物 PCR 检测内标准基因的建立
刘海涛1，2，3， 张川红1，2， 马 淼3， 郑勇奇1，2
（1. 中国林业科学研究院林业研究所/国家林业局林木培育重点实验室， 北京 100091；
2. 国家林业局植物新品种分子测试实验室， 北京 100091；3. 石河子大学生命科学学院，新疆 石河子 832003）
摘 要：为了建立适用于杨属植物转基因成分 PCR 检测的内对照系统，利用目前 genebank 中已公布的杨属植物的叶
绿体 DNA rbcL 基因的保守区域，设计了两对 PCR 引物：rbcL-1 引物和 rbcL-2 引物，分别成功地对五大派 10 种杨属植物
进行了 rbcL 基因片段的扩增， 第一次建立了适用于杨属植物转基因成分 PCR 检测的内标准基因对照系统。 其中 rbcL-1
引物适用的退火范围很广，在 52.0～68.0℃之间均能得到特异性很强的扩增产物，这有利于其他检测项目（如 35S 启动子、
NOS 终止子、标记基因及目标基因）的引物随意搭配进行多重 PCR 检测，从而提高检测效率、缩短检测周期。
关键词：杨属； rbcl 基因； 转基因检测； 内标准基因； PCR
中图分类号： Q343.2+2 文献标识码：A 文章编号：1004-874X（2010）03-0208-04
Establishment of a universal endogenous reference Gene for PCR
detection of genetically modified ingredient in Populus taxa
LIU Hai-tao1，2，3, ZHANG Chuan-hong1，2, MA Miao3, ZHENG Yong-qi1，2
(1.Research Institute of Forestry, Chinese Academy of Forestry/ Key Lab of Tree Breeding and Cultivation of State Forestry
Administration, Beijing 100091,China; 2.Lab of Molecular Testing for New Plant Varieties of State Forestry Administration,
Beijing 100091,China; 3.Life Science College of Shihezi University, Shihezi 832003，China)
Abstract：In order to establish a Universal endogenous reference Gene for PCR Detection of Genetically Modified
Ingredient in Populus taxa, the research designed primers rbcl-1 and rbcl-2 from conservative region of rbcl gene by inquired
the published sequences of Populus chloroplasts in NCBI. Fragments of rbcl gene in ten species Populus classified as five
sections of the genus was amplified successfully using the two primer -pairs. The endogenous reference gene control system
applicabled to the transgenic Populus PCR detected was established at the first time. At the same time, the annealing
temperature of primer rbcl-1 was very wide: between 52.0℃ and 68.0℃ it worked well, which will be helpfully paired up other
detections stochastic, as well as improvement of detection accuracy, and reduction of detection period.
Key words：Populus; rbcl gene; transgenic detection; endogenous reference gene; PCR
近年来，转基因生物技术已在林木遗传育种领域
得到了广泛的应用，大大推动了林木遗传改良和新品
种的选育。 据不完全统计，全球范围内现已对近百个树
种进行了遗传转化，其中杨树、番木瓜（Caricaceae）、松树
（Pinus spp.）、柳 （Salix spp.）、核桃 （Juglus regia）、苹果
（Malus）、 樱桃 （Prunus）、 香樟 （Camphora）、 悬铃木
（Plantnus）、桉树（Eucalyptus spp.）、云杉（Picea spp.）等转
基因植株已经进入田间试验阶段或已经批准商品化[1-3]。
由于林木具有树体巨大、生活周期长、天然群体分布广
等特点，相对于农作物来说转基因林木可能存在的生
态安全性问题更加复杂和难以预料，也引起人们更多
的担忧与关注[4]。 针对公众的担心与疑虑，目前全球已
有 30 多个国家制定了法律法规对转基因植物及其衍
生品进行标识。 当前国际上转基因产品的检测方法主
要是基于插入的外源基因和表达产物的基础上，包括
DNA 检测方法和蛋白质检测方法。 聚合酶链式反应
（Polymerase chian reaction，PCR）作为一种快速，灵敏
的的核酸检测方法，在转基因产品的检测上已经得到
广泛的认可和应用[5-7]。但 PCR检测灵敏，易受 DNA污
收稿日期：2009-10-01
基金项目：国家林业局项目(J-J-07-05)；国家林业局“948”技
术引进项目(2002-55)
作者简介：刘海涛（1983-），男，在读博士生， E-mail：lht1983
125@yahoo.cn
通讯作者：郑勇奇（1964-），男，博士，研究员， E-mail：zhengy
q@caf.ac.cn
中国林业科学研究院林业所胡建军副研究员， 曾燕飞博士
为本实验提供了宝贵材料，谨此致谢。
广东农业科学 2010 年第 3 期208
DOI:10.16768/j.issn.1004-874x.2010.03.061
染色体数目(2n)
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样品编号
1
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10
采集地
中国林业科学研究院
北京植物园
中国林业科学研究院
中国林业科学研究院
中国林业科学研究院
中国林业科学研究院
北京植物园
中国林业科学研究院
四川省凉山州市
新疆阿勒泰布尔津
种 名
黑杨派（sect.Aigeiros）
欧洲黑杨（P.nigra L.）
钻天杨〔P.nigra var italica(Moench.)Koehne〕
欧美杨 107
加杨（ P.×canadensis Moench）
美洲黑杨（P.deltoides）
白杨派（sect.Populus）
毛白杨（P.tomentosa Carr.）
河北杨（P.hopeiensis Hu&Chow）
青杨派（sect.Tacamahaca）
小叶杨（P.simonni Carr.）
大叶杨派（sect.Leucoides）
大叶杨（P.lasiocarpa Olive.）
胡杨派（sect.Turanga）
胡杨（P.euphratica Olive.）
表 1 材料及其来源
染，容易出现假阳性，假阴性结果。在检测时，通常需要
设立一系列对照（内标准基因对照、阳性 PCR 对照、阴
性 PCR对照、PCR 空白对照、阴性提取对照等）以排除
假阳性与假阴性。其中，内对照的设立可用于对基因组
中某一目的基因定量分析和验证 PCR 反应体系中是
否存在抑制物质，衡量模板 DNA质量及确定外源基因
的拷贝数。 目前，有关内标准基因的研究主要集中在农
作物上：如转基因大豆的检测一般选 lectin（凝集素）基
因作为内标，转基因玉米检测一般以 invertase（转化酶）
基因或 zein（玉米醇溶蛋白）基因为内标；而转基因水稻
的检测则选择 sps（蔗糖磷酸合酶）或 gos（一个水稻根部
表达的基因）基因作为内标准基因[8-9]，其它植物转基因
成分检测的内标准基因的研究尚未见报道。
目前， 国内外对转基因林木的研究主要集中在杨
属（Populus）植物。 杨属植物是全球范围内普遍分布的
森林树种，也是木本植物生理学、分子生物学和基因工
程研究的模式植物。 笔者统计了中国近年来木本植物
所做的遗传转化研究后发现，近 50 种树种中有超过一
半是针对杨属植物的[10]。 因此，建立针对杨属植物的通
用内标准基因对照系统是十分必要和有意义的。一般而
言，比较保守的功能基因的保守区域是设立内标基因的
最佳选择[11]。 核酮糖 1，5-二磷酸羧化酶/加氧酶大亚基
基 因 （Ribulose bisphosphate carboxylase /oxygenase
large subunit，简称 rbcL），是由叶绿体 DNA 编码，属于
比较保守的功能基因。 国内也已有学者将 rbcL作为内
标准基因应用到转基因植物的检测报道[12-13]。 本研究拟
以在 genebank中查找到的杨属植物的rbcL 基因的保守
区域为目标设计引物，以杨属植物中五大派（白杨派、
青杨派、大叶杨派、黑杨派、胡杨派）中比较常见的树种
为试验材料，进行 PCR 扩增，以优化出对所有样品都
具有稳定一致的扩增结果的通用引物， 从而建立适用
于多种杨属植物转基因成分 PCR 检测的内标准基因
对照系统。
1 材料与方法
1.1 试验材料
本选用杨属五大派（白杨派、青杨派、大叶杨派、黑
杨派、胡杨派）中比较常见的树种为实验材料，其中白
杨派 2 种，黑杨派 5 种，青杨派、大叶杨派、胡杨派各 2
种。 树种具体信息见表 1。
试验使用的主要试剂有 2×Taq PCR MasterMix
〔0.1 U Taq Polymerase/μL，500 μmol/L dNTP each，
20 mmol/L Tris -HCl （pH 8.3），100 mmol/L KCl，3
mmol/L MgCl2，其他稳定剂和增强剂〕购自 TIANGEN
公司；D2000 ladder DNA Maker 购自 TIANGEN公司；
其余试剂为国产分析纯。 引物由北京奥科生物技术有
限责任公司合成。
试验使用的主要仪器有台式冷冻离心机（Microfuge
22R Centrifuge），普通 PCR 扩增仪（ABI9700），温度梯
度 PCR 扩增仪（BIO-RAD DNA Engine），PS 2A200 电
泳仪（基因有限公司），全自动凝胶成像分析仪（GBOX-
HR），紫外分光光度计（UV-2800）。
1.2 试验方法
1.2.1 引物设计 在 genebank中查找已报道的杨属植
物 rbcL基因的序列，其中包括黑杨派 2种：欧洲黑杨、美洲
黑杨；白杨派 4种：银白杨（Populus alba）、毛白杨、欧洲山
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杨（Populus tremula）、美洲山杨（Populus tremuloides）；青
杨派 3种： 香脂杨 （Populus balsamifera）、 辽杨（Populus
maximowiczii）、毛果杨（Populus trichocarpa）；大叶杨派 1
种：椅杨（Populus wilsonii）；胡杨派 1种：胡杨。以上各种杨
属植物在 gene bank 中的登录号依次为 ：AJ418828、
AJ418829、AP008956、AF527489、AJ418827、M58392、
AJ418826、AJ418836、EF481041、AJ418830、AJ402993。
利用 DNA Star中的MegAlign模块进行序列的同源性比
产物大小（bp）
425
294
引物序列（5＇-3＇）
ACGGGCTTACCAGTCTTGAT
ACGCATAAATGGTTGGGAGTT
AAGCCGCGGTATTTATTTC
GCTAGTTCAGGGCTCCAT
引物名称
rbcL-1 Forward
rbcL-1 Reverse
rbcL-2 Forward
rbcL-2 Reverse
扩增基因（序列）
rbcL-1
杨树叶绿体内源基因
rbcL-2
杨树叶绿体内源基因
表 2 引物序列及扩增产物大小
较后，再利用 Primer Select模块设计了两对通用引物（表
2），均由北京奥科生物技术有限责任公司合成。
1.2.2 总 DNA 的提取与浓度测定 本研究采用改良
的 CTAB法提取杨树叶片中的总 DNA。 其具体流程为：
将 2×CTAB 提取缓冲液 [2%(w/v) CTAB, 1.4 mmol/L
NaCl, 0.2% (v/v) β-巯基乙醇, 20 mmol/L EDTA, 100
mmol/L Tris-HCl (pH8.0) ]60~65℃水浴预热。 将 0.2 g
植物材料， 液氮中研磨成粉末， 转移至 1.5 mL离心管
中。 加入 700 μL 2×CTAB缓冲液，65℃水浴 30 min，加
等体积的氯仿∶异戊醇(24∶1)，轻柔混匀。 12 000 min 离
心 10 min，将上清液移至干净的离心管中。 加入 0.8倍
体积冷异丙醇（或 2倍体积预冷的无水乙醇）和 0.1倍体
积的 3 mol/L NaAc(pH5.2)沉淀 DNA。 -20℃下静置 30
min以上。 12 000 min离心 10~30 min，用 70%预冷乙
醇洗涤沉淀 1~2次。适量 TE或去离子灭菌水 50 μL溶
解，采用紫外分光光度法检测 DNA浓度。
1.2.3 PCR 扩增及产物的电泳检测 以欧洲黑杨 DNA
为模版，进行退火温度的优化。 25 μL PCR反应体系成分
及用量为：2×PCR Mixter12.50 μL，Primer1 (10 μmol/L)1.00
μL，Primer2(10 μmol/L) 1.00 μL，DNA (20 ng/μL) 1.00 μL，
无菌去离子水 9.50 μL。 其中，每次反应均以无菌去离子水
替代模板DNA 作为对照，检测反应成分中有无污染。
PCR 反应采用如下循环参数：95℃预变性 5 min，
95℃变性 30 s，52～68℃退火 30 s，72℃延伸 45 s，选定
35个循环，最后 72℃再延伸 7 min。
扩增产物用 1%琼脂糖凝胶在 1×TAE 电泳缓冲液
中电泳， 以凝胶成像系统检测并记录扩增产物在琼脂
糖凝胶上的条带，确定每对引物的最佳退火温度。染料
用量为 ：100 mL 琼脂糖凝胶＋5 μL GoldView，5 μL
电泳样品+1~2 μL SYBRGreen。
2 结果与分析
2.1 DNA提取质量分析
本试验所采用改良的 CTAB 法提取的杨树叶片基
因组 DNA，经紫外分光光度计测定并记录其在 260 nm
和 280 nm的紫外光吸收率，OD260值在 1.8左右， 说明
纯度很好。根据 OD260值计算 DNA浓度。依据测得的浓
度将 DNA溶液稀释到 20 ng/μL，-20℃保存备用。
2.2 PCR 退火温度的优化
本研究设置了 10 个不同的退火温度（52.0、52.4、
53.4、54.6、56.5、58.8、61.5、63.8、65.5、66.8、67.7、68.0℃ ）
进行不同检测基因退火温度筛选试验， 图 1 是以欧洲
黑杨 DNA 为模版对引物 rbcL-1 和引物 rbcL-2 进行
退火温度筛选试验的检测结果。
从图 1 中可以看出，rbcL-1 引物的 PCR 扩增产物
经电泳后，在 52.0～68.0℃之间均有明显、清晰、单一、
大小一致的目的条带出现，且扩增量无明显的差异；而
rbcL-2 引物的 PCR 扩增产物经电泳后， 只在 52.0～
61.5℃的温度范围内得到了扩增产物， 且扩增量有差
图 1 引物 rbcL-1 和 rbcL-2 在不同退火温度
筛选试验的检测结果
注：电泳支持物为 1%琼脂糖，1～12 代表的退火温度依次
为：52.0、52.4、53.4、54.6、56.5、58.8、61.5、63.8、65.5、66.8、67.7、68.0℃）
210
异，退火温度为 54.6℃时扩增量最高。
2.3 目的 DNA片段的扩增
综合引物 1、 引物 2 的退火温度范围及转基因检
测多重 PCR等因素的需求，选择 59℃为退火温度对五
大派 10种杨树进行 PCR扩增（图 2）。
从图 2中可以看出，rbcL-1引物和 rbcL-2 引物在
五大派 10 种杨树材料中均得到了稳定一致的扩增结
果， 条带整齐而清晰， 没有非特异性杂带出现。 其中
rbcL-1 引物的扩增产物片段大小约为 425 bp，rbcL-2
引物的扩增产物片段大小约为 294 bp，这与试验设计
的引物扩增片段大小相符，确实是所需的目的片段。
3 结论与讨论
对转基因产品检测时， 无论采用哪种检测策略以
及所检测的外源目的基因的情况如何， 首先必须对转
基因产品的来源进行检侧，即进行内标基因的检测，以
确定其样品的材料来源和所抽提的检测样品的 DNA
质量是否合格。因此，内标准基因对照的设立对于转基
因成分 PCR检测结果的准确性非常重要。
如果模版 DNA 中含有抑制 PCR 反应的杂质，使
原本存在的阳性物质无法得到扩增， 从而造成假阴性
结果的出现。 以植物体中肯定含有的基因成分为内标
对其进行扩增， 如果内标基因扩增成功， 则表明模版
DNA 质量、数量及 PCR 体系正常；如果内标基因扩增
失败，则表明扩增体系中存在抑制成分，需要对模版质
量、数量进行优化及消除抑制因子。
本文利用 rbcL-1引物及 rbcL-2 引物对五大派 10
种杨属植物进行了 rbcL 基因片段的扩增，均得到了稳
定一致的扩增结果， 表明本试验设计引物在杨属植物
的内源基因的检测中具有广泛的使用范围， 这在林木
类转基因产品的内标准基因的研究中尚属首次。同时，
rbcL-1 引物适用的退火范围很广，在 52.0～68.0℃之间
均能得到特异性很强的扩增产物， 这一点非常有利于
与其他检测项目（如 35S 启动子、NOS 终止子、标记基
因及目标基因）的引物搭配进行多重 PCR 检测，从而
提高检测效率、缩短检测周期。
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图 2 引物 rbcL-1 和引物 rbcL-2 对五大派 10 种杨树
PCR 扩增产物的电泳图谱
（电泳支持物为 1%琼脂糖，1～10 为样品编号，详见表 1）
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