全 文 ：收稿日期:2009-10-07
基金项目:内蒙古自然科学基金(200607010504);内蒙古师范大学自然科学基金(QN005021)
作者简介:高　静(1984-),女 ,内蒙古包头人 ,硕士 ,主要从事植物分子系统学研究。
通讯作者:卢　萍(1964-),女 ,内蒙古海拉尔人 ,副教授 ,博士 ,硕士生导师 ,主要从事遗传与分子生物学 、分子生态学等领域的研究。
基于 5.8SrDNA/ITS序列的几种内蒙古棘豆属
植物分子系统学研究
高　静 ,卢　萍 ,王金妞 ,金　凤 ,恩和巴雅尔
(内蒙古师范大学 生命科学与技术学院 ,内蒙古 呼和浩特　010022)
　　摘要:提取小花棘豆(Oxytropis.glabra DC.)、小叶小花棘豆(O.glabra var.tenuis)、刺叶柄棘豆(O.aciphylla
Ledeb.)、砂珍棘豆(O.racemusa Turcz.)、多叶棘豆(O.verticillaris(L.)J.N)、黄毛棘豆(O.ochrantha Turcz.)基因组 DNA ,
扩增其 5.8SrDNA/ ITS 序列并测序 ,将所测序列与 GenBank中疏毛棘豆(O.pilosa)和长白棘豆(O.anertii)5.8SrDNA/ ITS
序列进行同源性比对 ,利用MEGA4.0 软件采用 Neighbor-joining 法构建系统发育树 ,旨在为棘豆属下种间及种下分类
研究提供分子依据。结果表明:多叶棘豆 、砂珍棘豆和黄毛棘豆构成姐妹群 , 并在部分地理种群上混杂 , 认为将三者
归入真棘豆亚属 Subgen.Euoxytropis 轮叶棘豆组 Sect.Baicalia Stell.ex Bunge更合理。小叶小花棘豆与小花棘豆亲缘关
系很近 , 支持将其视为变种的观点。刺叶柄棘豆的不同地理种群形成两大分支 , 对其在亚属水平上的分类还需进一
步商榷。研究赞同棘豆属植物为单系起源 ,认为种内不同地理种群间的亲缘关系在一定程度上受到了植被类型和生
境的影响。
关键词:棘豆属;5.8SrDNA/ ITS;系统发生
中图分类号:Q949.751.9　　文献标识码:A　　文章编号:1000-7091(2009)06-0168-06
Molecular Phylogeny of Several Species of Oxytropis DC.
Based on 5.8SrDNA/ITS Sequence
GAO Jing , LU Ping ,WANG Jin-niu , JIN Feng , ENHE Bayaer
(College of Life Science and Technology , Inner Mongolia Normal University ,Huhhot　010022 ,China)
Abstract:Genomic DNAs of Oxytropis glabra , O .glabra var.tenuis , O.aciphylla , O.racemosa , O.verticillaris
and O.ochrantha were extracted , then the 5.8SrDNA/ ITS sequences were amplified and sequenced.Homologous of the
sequences were compared with that of O.pilosa and O.anertii submitted to GenBank.The phylogenetic tree was con-
structed by NJ methods inMEGA 4.0 software , the purpose of the research was to provide molecular evidences for taxono-
my of interspecies and intraspecies of Oxytropis DC.The results showed that O.verticillaris ,O.ochrantha and O.race-
mosa were sister groups and some geographical populations of them were mixed.Therefore , it was reasonable to put the
three species into Subgen.Euoxytropis Sect.Baicalia Stell.ex Bunge.O.glabra var.tenuis had a close relationship with
O.glabra ,which supported the opinion of treating O.glabra var.tenuis as a variant of O.glabra.Different populations
of O.aciphylla were divided into two major branches , and the subject position of O.aciphylla at subgenus level needs
further investigation.The results also supported that Oxytropis DC.was a monophyletic group.It was indicated that the re-
lationship among different geographic populations within species were influenced by vegetation type and habitat to some
extent.
Key words:Oxytropis DC.;5.8SrDNA/ITS;Phylogenetic
　　棘豆属 Oxytropis DC.隶属于豆科 Fam.legumi-
nosae Juss.蝶形花亚科 Subfam.Papilionoideae Giseke
山羊豆族 Trib.Galegeae(Br.)Torry et Gray 黄芪亚族
Subtrib.Astragalinae(Adans.)Benth.et Hook.f[ 1 , 2] 。迄
今为止 ,内蒙古已记载有棘豆属植物 30种 、6变种 、
4变型[ 3] 。对于棘豆属下阶元的研究 ,不同的学者
华北农学报·2009 , 24(6):168-173
支持不同的观点 ,存在较大分歧。
在分亚属的研究中 , 《中国植物志》中将我国分
布的棘豆属植物分为 6亚属 ,即柔毛棘豆亚属 Sub-
gen.Ptiloxytropis Bunge 、硬毛棘豆亚属 Subgen.Triti-
caria Vass 、囊 萼棘 豆 亚属 Subgen.Physoxytropis
Bunge、猬刺棘豆亚属 Subgen.Tragacanthoxytropis
Vass、棘豆亚属 Subgen.Oxytropis 和大花棘豆亚属
Subgen.Orobia(Bunge)C.W.Chang[ 1] ,据此 ,内蒙古分
布的棘豆属植物隶属于除柔毛棘豆亚属的其余 5个
亚属中。而富象乾在《内蒙古植物志》中采用了 5亚
属 ,即胀萼棘豆亚属 Subgen.Physoxytropis Bunge、单
室棘豆亚属Subgen.Phacoxytropis Bunge 、真棘豆亚属
Subgen.Euoxytropis(Boiss.)、垫刺棘豆亚属 Subgen.
Traganthoxytropis Vass和硬毛棘豆亚属 Subgen.Pha-
coxytropis Bunge[ 2 ,3] 。刘丽 , 赵一之[ 4] 依据子房结构
把以上 5个亚属合并为 2个亚属 ,即保留单室棘豆
亚属 ,其余 4亚属归并为棘豆亚属 ,认为荚果是否包
藏于花萼内是一个不稳定的性状。王金妞[ 3]通过对
本属植物大量标本的鉴定 ,支持内蒙古植物志中的
分法 。另有部分种的隶属问题 ,至今观点不一 。
许多棘豆属植物具有重要的经济价值 、生态价
值及观赏价值[ 5-11] 。目前的研究主要集中于传统
分类学 、生态学 、细胞学 、化学及药用成分和药理作
用等领域[ 4 , 10-20] ,应用分子生物学手段对棘豆属植
物进行的研究尚属少数 ,而对于内蒙古分布的棘豆
属植物的分子系统学研究未见报道。由于核糖体
rDNA存在中度保守的重复序列 ITS及高度保守的
编码区序列(18S , 5.8S , 26S)[ 21] ,因此被认为是原核
生物 、高等植物及真菌分子系统学研究的理想部
位[ 22-27] 。本研究通过测定内蒙古 5种棘豆属植物
21个地理种群单株的 5.8SrDNA/ ITS 序列 , 检索
GenBank中已收录的分布于我国东北地区的长白棘
豆 O.anertii(EF685971)和新疆地区的疏毛棘豆 O.
pilosa (AF121759)的 5.8SrDNA/ ITS 序列 ,以变异黄
芪 Astragalus variabilis和A.austrosibiricus(AF359758)
作外类群 ,研究比对五种棘豆属植物的 5.8SrDNA/
ITS序列 ,结合形态及细胞学证据进行分析 ,深入探
讨其在属下种间及种下阶元的分类地位 ,并为棘豆
种质资源的研究 、开发与利用奠定理论基础 。
1　材料和方法
1.1　植物材料
随机采集健康棘豆植株的新鲜叶片 ,将其置变
色硅胶迅速干燥 ,带回实验室-80℃低温冰箱保存 ,
以备 DNA提取 。采样地概况见表 1。
表 1　棘豆属植物采样地
Tab.1　Sampling sites of Oxytropis.DC
物种
Species
种群
Population
种群号
PopID
采样数(N)
Sample size
纬度(N)
Latitude
经度(E)
Longitude
海拔/m
Altitude
生境
Condition
O.glabra 阿拉善左旗 AZ 29 40°09′ 104°40′ 1 335 盐碱低湿地
巴盟临河 BL 30 40°48′ 107°28′ 1 027 湖盆边盐碱低湿地
鄂托克前旗 OEQ 27 38°10′ 107°40′ 1 351 轻度盐碱低湿地
乌审旗 OW 25 38°58′ 109°07′ 1 311 沙丘间低湿地
伊金霍洛旗 OY 27 39°19′ 109°48′ 1 369 沙丘间低湿地
O.glabra var.tenuis 伊金霍洛旗 OY 30 39°19′ 109°48′ 1 369 沙丘间低湿地
O.aciphylla 乌拉特中旗 BW 30 41°17′ 107°57′ 1 044 荒漠草原
伊金霍洛旗 OY 30 39°20′ 109°48′ 1 369 荒漠草原
鄂托克旗 OET 30 38°59′ 107°59′ 1 326 荒漠草原
阿拉善左旗 AZ 30 36°07′ 105°36′ 1 398 荒漠
准格尔旗十二连城 ZS 10 40°08′ 110°02′ 1 095 沙地(流动沙丘)
O.racemosa 鄂托克旗 OET 30 38°60′ 107°59′ 1 326 沙地低洼处
乌审旗 OW 27 38°60′ 109°08′ 1 311 沙丘间下湿地
伊金霍洛旗 OY 30 39°20′ 109°48′ 1 369 固定沙地
和林县 SL 10 40°29′ 111°46′ 1 104 沙地干河床
O.verticillaris 武川县 W1 15 40°57′ 111°37′ 1 741 山地
武川县 W2 10 41°06′ 111°26′ 1 594 林下湿地
武川县 W3 10 41°03′ 111°28′ 1 686 沟底
武川县南天门 W4 10 40°25′ 112°00′ 1 626 山地
O.ochrantha 锡盟辉腾梁 HTL 8 41°07′ 112°31′ 2 036 山地(草甸草原)
卓资县上高台林场 SGT 8 41°05′ 110°02′ 1 605 山地(干河谷)
A.variabilis 阿拉善左旗 AZ 30 39°06′ 105°36′ 1 398 荒漠
1.2　研究方法
1.2.1 　植物总 DNA 的提取 　采用改进的
CTAB[ 28 ,29]法提取植物基因组总 DNA ,0.7%琼脂糖
凝胶电泳检测模板 DNA质量 ,调整各模板浓度 ,用
0.1×TE稀释至 10 ng/μL ,4℃贮存备用 。
1.2.2　5.8SrDNA/ ITS区段的 PCR扩增及序列测定
　采用White 等[ 30]设计的 ITS 通用引物 ITS4和 ITS5
对核糖体 DNA的 5.8SrDNA/ ITS进行扩增 。ITS5为
6期 高　静等:基于 5.8SrDNA/ ITS序列的几种内蒙古棘豆属植物分子系统学研究 169　
正向引物 , ITS4为反向引物。
ITS5:5′-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3′22mer
ITS4:5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′20mer
10μL PCR体系为:2×PCRmaster mix 3μL ,DNA
模板 10 ng ,引物为 3 μmol/L。扩增程序为:94℃预
变性 3 min;94℃变性 45 s ,48℃复性1 min ,72℃延伸
30 s ,30 个循环;72℃补平 5 min , 4℃保温。扩增产
物用 1.5%(含核酸染料)琼脂糖凝胶电泳检测 , 5
V/cm下稳压电泳 1.5 h ,用 Tanon GIS-2010 型凝胶成
像系统照相 。1 kb Plus DNA Marker 为标准分子量
标记 。
PCR产物纯化及 DNA序列测定委托上海生工
工程公司进行 ,所用测序仪器为 ABI PRISM 3730 ,测
序试剂为 BigDye terminator v3.1。每个种群至少选
取2株 ,并且进行重复测序 。
1.2.3　数据分析　将获得的 5.8SrDNA/ ITS 序列数
据 ,利用 BLASTN在NCBI 数据库中与已发表的棘豆
属植物5.8SrDNA/ ITS序列进行同源性比对 ,确定始
末端 ,删除属于 18S 和 26S 的部分 ,得到5.8SrDNA/
ITS全序列。运用 CLUSTAL X程序对不同植株的
5.8SrDNA/ ITS 序列进行对位排列。用系统发育分
析软件MEGA4对序列进行分析 ,应用邻接法构建系
统发育树 ,邻接树的构建使用 Kimura 2-parameter 距
离 ,用自展法(Bootstrap)对所构建的系统发育树进行
检测 ,自展重复次数设定为 1 000次。
2　结果与分析
2.1　5种棘豆属植物 5.8SrDNA/ITS区序列组成与
GC含量比较
棘豆属植物的 ITS1序列长度为 226 ～ 227 bp ,长
度变化是由少数种的碱基缺失所致 ,该区GC含量变
化范围为 58.59%～ 61.67%,变异位点 16个 ,信息位
点9个 ,变异位点中多数为颠换(10个),常发生在 G
与T 之间;ITS2序列长度为212 bp ,GC含量变化范围
为51.42%～ 52.83%,变异位点 10个 ,信息位点 7个 ,
变异位点中转换相对较多(6个),颠换发生在A 与T
和G与T 之间;ITS1区较 ITS2区有更多可变位点 ,在
进化上可能 ITS1区更快 ,且 ITS1区 GC 含量较 ITS2
区高。不同棘豆物种的 ITS 序列(ITS1+ITS2)长度为
438～ 439 bp , GC 含量为 56%左右。所有序列中
5.8SrDNA序列完全一致 ,长度为164 bp(表2),与黄芪
属植物 5.8SrDNA区有 3个碱基的差别(图 1)。
表 2　棘豆属各植物 5.8SrDNA/ ITS序列特征比较
Tab.2　Sequence characteristics of 5.8SrDNA/ ITS in Oxytropis DC.
物种
Species
小花棘豆
O.glabra 小叶小花棘豆O.glabra var.tenuis 砂珍棘豆O.racemosa 黄毛棘豆O.ochrantha 多叶棘豆O.verticillaris 刺叶柄棘豆O.aciphylla
ITS1/bp 227 227 227 227 227 226～ 227
ITS2/bp 212 212 212 212 212 212
ITS/bp 439 439 439 439 439 438～ 439
平均Mean 439 439 439 439 439 438.5
5.8SrDNA/ bp 164 164 164 164 164 164
G+C(ITS1)/% 58.59～ 59.03 59.03 60.79 60.79 60.35 ～ 60.79 60.18～ 61.67
G+C(ITS2)/% 52.83 53.83 51.42～ 51.89 51.42 51.42 ～ 51.89 51.42-52.83
G+C(ITS)/% 55.81～ 56.04 56.04 56.26～ 52.49 56.26 56.26 ～ 56.49 56.26～ 56.95
Mean(ITS)/% 56.0 56.04 56.4 56.3 56.4 56.6
2.2　分子系统发育树及其分析
以两种黄芪 A.variabilis 和 A.austrosibiricus 为
外类群 ,使用邻接法分别对 5.8SrDNA/ ITS 、ITS1和
ITS2构建 NJ树 ,结果见图 1 ～ 3。
3个系统发育树中 ,所有的棘豆属和黄芪属植
物各自分成一组 ,黄芪属植物位于系统发育树的最
外侧 ,自展支持率达 99%以上 。拓扑结构各不相
同 , ITS1在不同种之间差异位点较多 ,与全序列构
建的系统发育树差异较大 ,物种间亲缘关系的自展
支持率多数为 0 ,结果不可信 ,但各棘豆物种内部均
可获得 65%以上的自展支持率;ITS2在不同棘豆种
间差异位点少 ,与由全序列构建的系统发育树除刺
叶柄棘豆在亚属水平上的归属略有差异外 ,各棘豆
物种地理种群内部基本可获得 65%以上的自展支
持率 ,而种间亲缘关系的自展支持率在 29%～ 74%
之间 。5.8SrDNA/ ITS系统发育树显示 ,不同地理种
群的多叶棘豆 、砂珍棘豆 、黄毛棘豆和长白棘豆先聚
为一支 ,后与刺叶柄棘豆乌拉特中旗(BW)和鄂托克
旗(OET)的 2个种群汇合为一大分支;疏毛棘豆自
成一支 ,相对独立进化;小花棘豆的 5个地理种群与
小叶小花棘豆聚为一支 ,又与刺叶柄棘豆伊金霍洛
旗(OY)和准格尔旗十二连城(ZS)相互靠近 ,后与阿
拉善左旗(AZ)种群聚为一大分支 。来自不同地理
种群的每个棘豆物种各成一支 ,均基本获得 60%以
上的自展支持率。
170　 华　北　农　学　报 24卷
数字表示各分支自展数据支持率 , ＊.表示外类群。图 2 , 3同。
Numbers at the branch nodes indicated the confidence values for the
presence of the branch obtained from bootstrap analysis using 1000
replicates.＊.Represents the out group.The same as Fig.2 and Fig.3.
图 1　用邻接法构建的5.8SrDNA/ ITS系统发育树
Fig.1　5.8SrDNA/ITS phylogenetic tree using the
neighbor-joining method
3　讨论
国内对棘豆属植物的分类学研究主要以传统形
态学特征为依据 ,由于部分形态特征受环境影响较
大 ,这些依据有时并不可靠 。核型分析提出了棘豆
属部分植物可能的演化趋势 ,也是在传统分类学框
架下进行的 ,因而在亚属的研究以及部分种的隶属
等问题上也不能提供有力的证据 。本研究依据5.8
SrDNA/ ITS序列构建了 5种棘豆属植物的系统发育
树 ,结果显示棘豆属和黄芪属被分为两大类群 ,支持
Janet L.Jorgensen[ 22] 提出的棘豆属植物为单系起源
的观点。
图 2　用邻接法构建的 ITS1系统发育树
Fig.2　ITS1 phylogenetic tree using the neighbor-joining method
小花棘豆鄂托克前旗(OEQ)、巴彦淖尔市(BL)
和阿拉善左旗(AZ)种群聚为一支 , 3个种群生境类
型均为盐碱低湿地 ,植被类型为荒漠草原和荒漠;乌
审旗(OW)和伊金霍洛旗(OY)2个种群的生境均为
沙丘间低湿地 ,植被类型为隐域性草甸 ,二者聚为一
小分支。推测种内不同地理种群的生境及植被类型
对于棘豆属植物的系统发育关系有一定影响。传统
分类学中是否将小叶小花棘豆作为小花棘豆的变种
处理一直存有争议 ,蒙古国的 N.Ulzijchutag 在《蒙古
国豆科植物》中将其定为正种 ,在《中国植物志》与
《内蒙古植物志》中以变种处理[ 3] 。王金妞对植株的
形态 、小叶和荚果的特征及地理分布进行了研究 ,认
为小叶小花棘豆作为小花棘豆的变种更合理。本研
6期 高　静等:基于 5.8SrDNA/ ITS序列的几种内蒙古棘豆属植物分子系统学研究 171　
究得到的小叶小花棘豆 5.8SrDNA/ ITS 序列与部分
小花棘豆的序列完全一致 ,赞同国内学者的观点 。
小叶小花棘豆与小花棘豆的一个种群均采自伊金霍
洛旗 ,生境为沙丘间下湿地 ,而二者却分聚在两个小
分支中 ,其原因还待以后扩大测序取样量做进一步
研究 。
图3　用邻接法构建的 ITS2 系统发育树
Fig.3　ITS2 phylogenetic tree using the neighbor-joining method
刺叶柄棘豆的伊金霍洛旗(OY)和准格尔旗十
二连城(ZS)2 个地理种群聚为一小分支 ,二者与小
花棘豆 、小叶小花棘豆亲缘关系较近 ,以上物种采样
地生境为固定沙地和流动沙丘;阿拉善左旗(AZ)种
群自成一小支 ,后聚到上述类群的外侧 ,其植被类型
为半灌木荒漠。乌拉特中旗(BW)和鄂托克旗
(OET)的2个种群相互靠近 ,其植被类型均为以刺
叶柄棘豆为建群种的荒漠草原 ,生境为固定沙地 ,然
而却与多叶棘豆 、砂珍棘豆 、黄毛棘豆聚为一支 ,其
原因还有待于进一步研究 。对于刺叶柄棘豆的归属
问题 ,在《中国植物志》和《内蒙古植物志》中都将其
列入到猬刺棘豆亚属中 ,刘丽 、赵一之则将其并入到
棘豆亚属猫头刺组中 。本研究可能由于样本数偏
少 ,对于这一分歧的探讨还需深入进行。初步推测
生境 、植被类型可能对种内分化产生一定的影响 。
系统发育树显示新疆的疏毛棘豆较为独立进
化 ,来自东北地区的长白棘豆与多叶棘豆和砂珍棘
豆聚为一个分支 ,亲缘关系较近。多叶棘豆 、黄毛棘
豆和砂珍棘豆的分类地位也值得商榷 ,在《中国植物
志》中将多叶棘豆和黄毛棘豆归入大花棘豆亚属
Subgen.Orobia(Bunge)C.W.Chang 轮叶棘豆组 Sect.
Baicalia Stell.ex Bunge ,砂珍棘豆被归入戈壁棘豆组
Sect.Gobicola Bunge , 《内蒙古植物志》将三者列入真
棘豆亚属轮叶棘豆组 ,刘丽 、赵一之的观点与《内蒙
古植物志》相同 ,王金妞据形态学特征认为将黄毛棘
豆归于单室棘豆亚属为宜。本研究的系统发育树显
示部分多叶棘豆和砂珍棘豆种群与黄毛棘豆相互混
杂 ,获得 61%的自展支持率 ,表明三者亲缘关系很
近 ,认为将这三种棘豆归为一组较合理 。支持《内蒙
古植物志》的观点 。而对于各亚属的界定 ,今后需要
收集更多的棘豆物种 ,深入对其系统发生关系进行
研究 。
本研究基于 5.8SrDNA/ITS 序列对棘豆属植物
的分子系统学进行分析 , 也有学者将该序列与
cpDNA ndhF 基因[ 31]或 cpDNA trnL 基因[ 32]结合进
行研究 ,欲通过比较 2种基因序列构建的系统发育
树得到更准确的分类学信息 。一般而言 ,在大的研
究样本中 2种基因结合构建的系统发育树对于大多
数种的界定相近 ,然而在个别种的隶属上有较大差
异 ,因此存在一定局限性。另外还有学者认为叶绿
体基因相对比较保守[ 33] ,不太适于进行种及种下分
类阶元的研究[ 34] ,再加上 cpDNA 是单亲遗传 ,并不
能解释所有的系统发育问题[ 35] 。
今后的研究需增加棘豆物种及种群的数量进行
深入探讨 ,以期更加明确棘豆属植物的系统发生关
系。
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