全 文 ：植物病理学报
AC T A PH YT O P AT H O L O G IC A SIN IC A 3 5 ( 6 )
: 5 5 2
一
554 ( 20() 5 )
北京怀柔地区樱桃上发现李属坏死环斑病毒
李明福 ` , 张永江 , , 黄 冲 2 ` , 相 宁` , 张秀琴` ,
李桂芬 ` , 魏梅生 , , 陈燕芳`
( ’ 中国检验检疫科学研究院动植物检疫研究所 ,北京 l 咤洲洲j29 ; 2 中国农业大学植物病理学系 ,北京 l以洲刃 4 ;
3北京市怀柔 区种植业服务中心 ,北京 1 01 4以〕)
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文章编号 : 04 1 2切 1 4 ( 2 0 5 ) 06 刁 55 2刃 3
李属坏死环斑病毒 ( 尸。 nu : ne c or ict inr g sP ot
v i o s
,
NP
R SV )属雀麦花叶病毒科 ( B or 。 , o v iir da e )
等轴不稳环斑病毒属 ( alI vr iur , ) , 是我国二类检疫
性有害生物 。 PN RSV 主要危害李属和蔷薇属植
物 。 如 , 樱桃 、 桃 、 李 、 月季等 。 春季感染 NP R S V
的樱桃早期幼叶会出现深棕色坏死斑和线纹 ,叶片
展开期坏死斑脱落造成穿孔症状 。 受 NP R S V 危
害后 ,果树树势减弱 ,产量降低 ,甚至死树 。 我国学
者调查陕西 、辽宁和山东等省的果树病害时发现并
报道了该病毒 L’ 一 3 〕 。
2 0 04 年 4 月 , 对北京地区部分核果类果 园进
行疫情调查 ,共采集樱桃 、 桃 、 杏 、李等 45 份样品 ,
经生物学 、 双抗体夹心酶联免疫吸附法和反转录
CP R 检测 ,在樱桃上检出李属坏死环斑病毒。
材料与方法
供试材料
樱桃 、 桃 、李和杏树叶片 。
1
.
2 双抗体夹心酶联法 ( OA S 一 EU S A )检测李属
坏死环斑病毒
双抗体夹心酶联法检测按魏梅生等 : 4 飞的方法
操作 。 P N R SV 抗体来 自美国 A D I 公 司 。 检测 中
采用 b u fe r A ( 0 . 0 1 m o F L PB S )和 b u fe r B ( 0 . 0 1
m o F L PB S + 0
.
0 2
mo F
L N a Z S o
3
) 2 种缓冲液 。 按
样品与缓冲液 l : 5 ( g : m L ) 的比例研磨制备样品 ,
5 o o r/ 而 n 离心 10 m in 。 阳性对照由 A D I 公司提
供 , 阴性对照为隔离温室种植的黄瓜苗 。
1
.
3 反转录 P C R ( RT 一 RC R ) 检测 李属 坏 死环
斑病毒
1
.
3
.
1 引物设计合成 参照 G en B a n k 上登录的
NP
R S v 外壳蛋白序列设计引物 , 引物由北京赛百
盛公司合成 。 正向引物为 5 气 g et c ac ct ag g gc et a c -
3
`
:反 向引物为 5 ’ 一e g e a a g tg te g a et at a et
一
3
` 。
1
.
: ,
.
2 核酸提取和反转录 用 I n v i tr o g e n 的 irT z o l
试剂盒提取样品叶片总 NR A
。 反转录体系 20 汕 ,
D E PC
一
H Z 0 10 林L 、 10
m
o F L dN T P I 林L 、 2 0
林m o F L 反向引物 2 林L 、 R N A 模板 l 林L , 70 ℃反
收稿 日期 : 2 0 5刁 2 一 1;6 修回日期 : 2 0 5一5召 5
墓金项目 : 国家自然科学基金资助项目 ( 3 0 27 08 9 2 )
通讯作者 : 黄 冲 ,在读博士生 , 研究方向为植物病理学 ; eT l : 6 2 7 3 3月洲)8 , E 一m a 一I : h邸3 @ 16 3 . e o m
DOI : 10. 13926 /j . cnki . apps . 2005. 06. 012
6期 李明福 ,等 :北京怀柔地区樱桃上发现李属坏死环斑病毒
应 5 而 n ,冰上放置 5 而 n ,加人 A M v 酶 5 倍 b u fe r
4 卜L 、 Zo U/ 林L A M v
一
R T (反转录酶 ) i 卜L 、 4 0 U/
泌 NR A 酶抑制剂 1 泌 , 42 ℃反应 l h 。
1
.
3
.
3 cP R 扩增 反应体系 20 泌 ,上述反转录
产物 2 林L 、 10 倍 CP R 缓冲液 ( 含 M g Z 十 ) 2 林L 、
10 ~ 哪 L dN T P o
.
6 汕 、下游引物 0 . 5 汕 、 上游
引物 。 . 5 林L 、 Z U/ 泌 aT q 酶 1 林L 和 D ECP 水
13
.
4 林L 。 反应 程序为 : 9 4℃ 10 姗 ; 9 4 ℃ 3 0 5 、
5 8℃ 3 0 5 、 72℃ l 而 n ,加 个循环 : 7 2℃ 8 而 n I S ] 。
PC R 产物在 l % 琼脂糖平板 _上电泳 ,紫外灯下观察 。
,
.
4 生物学检测
将 D A S一 EL IS A 检测呈 阳性的樱桃叶片用接
种缓冲液研磨 , 摩擦接种真叶期黄瓜叶片上 ,观察
症状 。
2 结果与分析
2
.
1 寄主症状及接种黄瓜表现的症状
取 D A S 一ELI SA 检测阳性样品 (图 l) 接种该病
毒的鉴别寄主黄瓜 , 14 d 后接种叶出现局部褪绿
斑 ,而后抽出的新叶均有十分明显的系统褪绿症状
(图 2 ) , 表现症状的黄瓜叶片均得到 D A s 一E LI SA
和 R T 一CP R 检测验证 。
2
.
2 DA S
一
E L IS A 检测
采用 2 种不同抽提缓冲液检测的樱桃样品和
阳性对照 , 加人底物 10 而 n 显色 , 表 l 为 1 0 m i n
o D s40 值 。 结果表明 , 2 种不同缓冲液研磨样品反
应 良好 ,酶联仪读数显示 阳性和阴性对照工作正
常 , 而且阳性对照与阴性对照 O D 、 值比值大于 5 ,
樱桃样品和阴性对照 比值均超过 15 倍 , 可以判定
检测的樱桃叶片样品含有 PN R s v 。
2
.
3 RT
一
P C R 检测
双抗体夹心酶联法检测呈阳性的樱桃叶片样
品经 RT 一CP R 检测 和电泳后 , 在预期 4 52 bP 处 出
现 NP R SV 特异条带 (图 3 ) 。
3 讨论
李属坏死环斑病毒最早在陕西省有过发生的
报道 【’ 1 , 近年来在山东 、 辽宁两省也相继检测发
现 〔’ , , ] 。 为查明该病毒是否在北京地区分布 , 对北
京的主要果树种植区平谷和怀柔进行了疫情调查 ,
翻 . . 曰 .目 . 曰 . 曰. 口
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1 Lit le h o l e s s h o w n i n e h e r yr l e a f
i n f e ct e d b y P N RS V
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2 L e a f s y s t e m a t ie e h lo r o s is o f
b e r i n o e u ! a t e d a ft e r 2 0 d a y s
C U C U I们 -
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P le s i n C o lu m n 3 an d 4 w e er rP e Paer d
w i ht b u fe
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·
植物病理学报 35 卷
调查研究 , 以便针对该病毒的经济影响和分布状况
开展风险评估 ,为采取相应的防治措施奠定基础 。
关于核果类果树病毒的检测 , 由于经常发现病
样研磨时病毒易被氧化而且粘稠变色 ,本实验采用
常规样品抽提液加 N屯 5 0 3研磨样品 ,并与常规样
品抽提液研磨相比较 。 结果表明 ,采用 2 种不同抽
提缓冲液研磨样品的酶联检测结果读数良好 ,说明
试用的不同抽提缓冲液不影响该病毒的血清学检
测特性 ,是否影响接种效果还有待进一步验证 。
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3 RT
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P C R d e t e c t io n o f P N RS V
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忱 d c h er yr s田叭 Ple .
调查采用普查与重点调查相结合 , 并对怀柔一个表
现疑似症状的果园进行逐棵排查 ,共采集桃 、樱桃 、
李和杏 45 个样品 ,经生物学 、 双抗体夹心酶联法和
反转录 P C R 检测 , 在怀柔地区某果园的一棵樱桃树
上发现李属坏死环斑病毒。 在检测李属坏死环斑病
毒的同时 ,还检测了常与其复合侵染的李矮化病毒
(尸川ne d 体` 了 ial vir 、 : ) ,结果未发现该病毒 。
李属坏死环斑病毒为我国进境检疫性病毒 ,其
检疫地位到底如何 , 目前尚有争议 。 本次检测发
现的 PN R S V究竟源 自何处 , 有必要进行系统的
参考文献
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责任编裤 : 于金枝