全 文 ：第 2卷 第 2期 热 带 作 物 学 报
C H IN E S E JO U RN A L O F T RO P IC A L C RO P S
.
2椒 2
1 98 1年 9月 19 8 1
海南胡椒属植物细菌性叶斑病病原菌的鉴定
文衍堂 弓也修
( 华南热带作物学院植保 系 )
摘 要
通过对海南岛胡椒及其同属植物细菌性叶斑病病原菌 5个菌株的常规鉴定 , 发现为害胡椒属
植物的 5个菌株在形态 、 染色反应 、 培养性状 、 生理生化特性及致病性等方面都相同 。 它们同属
于一个 “种 ” . 这个 “种 ” , 与 X a n t h o m o n a s b e t l i e o l a 比较 , 除了不使蔗糖发酵产酸和稍利
用天门冬酞胺作唯一碳源和氮源外 , 所测定的其它性状均相似 。 因此 , 认为这个 “ 种 ” 就是 X 。
be t h co la
, 上述的差异可能是不同菌系的差异 。
通过菌株对噬菌体敏感性测定 , 发现 5 个菌株中存在不同的噬菌体型 。
目前已知为害胡椒 ( PI eP r in g lrt m ) 及其同属植物的细 菌 性叶 斑 病 有 3 种 。 ( 1 )
R a g u n a t h a n ( 19 2 6 ) 报道锡兰 ( 斯里兰卡 ) 发生篓叶 ( P i p e r b e t l e ) 细菌性叶斑病 〔 1 2 〕。
1 9 2 5年 R a g u n a t h a n 将该病原细菌鉴定为 B a e t e r i u m b e t l e R a g u n a t h a n 〔 1 3 〕。 之后 B 。 : k h -
o
l d
e r
( 1 9 4 5 ) 将该病原细菌重新鉴定 为 P s e u d o m o n a 、 b e t l e ( R a g t n a t h a n ) B u r k h o l d e r
〔7 〕。 ( 2 ) A s t h a n a , R . P 。 等人 ( 1 9 4 5 ) 报道 印度发生萎叶细菌性叶斑病〔。 〕 。 P a t e l ,
M
.
R
. 等人 ( 1 9 5 1 ) 将该病 原 细菌鉴定为 X a n t h o : n o n a s b e t l i e o l a P a t e l e t a l . r l l 〕。
M at he w
,
J
。 等人 ( 1 9 7 8 ) 发现印度的胡椒也发生细菌性叶斑病 , 经过研究鉴定 , 认 为该
病原菌也是X a n t h o m o 公 a s b e t l i e o l a 〔` “ 〕。 ( 3 ) R o b b s , C . F 。 ( 1 9 5 9 ) 报 道巴西发生
胡椒细菌性叶斑病 ,经过鉴定后认为该病原细菌是 sP e u d o m o n as s yr 她 g ae v a n H al l 〔“ 〕。
在我国海南岛 , 胡椒 、 假药 ( PI eP r s ar m e nt o s u m ) 、 萎叶等胡椒属植物也发生细菌性
叶斑病 。 华南热带作物学院等单位 ( 1 9 7 6 ) 对胡椒细菌性叶斑病的症状 、 病原 、 流行规律 、
化学防治和综合防治等做了研究 。 他们把该病原细菌初步鉴定 为荧光杆 菌 ( P s e u d o m o n as
S p
.
) ( i 〕。
然而 , 该文没有阐述测定产生荧光色素的方法 。 文衍堂等人 ( 1 9 7 7 ) 发现该病原细菌可
以侵染假菊〔 2 〕。 然而为害胡椒属其它植物的病原细菌尚未鉴定 。为了摸清为害海南岛胡椒及
同属植物的叶斑病原细菌的种类和分类地位 , 以及为其它研究提供依据 , 我们对本病原菌试
作进一步鉴定 。
本文于 19 8 1年 3 月 14 日收到 .
2期 文衍堂等 : 海南胡椒属植物细菌性叶斑病病原菌的鉴定
一 、 材 料 与 方 法
从华 南热带作物学院附近胡椒园里分离胡椒叶片的一个菌株 ; 从远离胡椒园的橡胶园里
分离野生植物— 假菊叶片的一个菌株 ; 从兴隆华侨农场分离胡椒叶片的一个菌株 , 从华南热带作物科学研究院兴隆试验站的胡椒园里分离萎叶叶片一个菌株 ; 分离未知种名的胡椒属
植物 ( IP eP r sP . ) 叶片的一个菌株。 上述 5个菌株经纯化后按照柯赫法则分别在胡椒 、 假
菊和姜叶上作致病性测定 。 上述 5个菌株分别编 号为 : P n 一 1 , sP 一 1 , P n 一 2 , P b一 1 ,
sP p
一
l
, 作为供试菌株 。 搜集水稻白叶枯病菌 ( X an ht o m o n as or yz ae ) , 水稻细菌 性条 斑
病菌 ( X 。 o r y z i e o l a ) , 柑桔溃疡病菌 ( X 。 e i t r i ) , 花生青枯病 菌 ( P s e u d o m o n a s 0 0 1-
a n a e e a r u m )
, 蔬菜软腐病菌 ( E r w i o i a a r o i d e a e ) , 大肠杆菌 ( E s e h e r i e h i a e o l i ) ,
枯草杆菌 ( B a e i l l u s s u b t i l i s ) , 绿脓杆 菌 ( P s e o d o m o n a s a e r u g i n o s a ) , 褐 圆 固 氮 菌
( A
z o t o b a c t e r c h r o o e o e e u m )
, 作为相应的对照菌株 。
取用常规鉴定方法 。 参照西北农学院植保系编的 《植物病理学研究技术 》 r 3 、 , 中国科
学院微生物研究所细菌组编的 《 一般细菌常用鉴定方法 》 一 “ , 采 用 lC ar a , F . M . 厂. 、 和
tS ar
r , M
.
P
.
r ` 6 〕等人取用的合成的天门冬既胺培养液 , 测定细菌利 用天门 冬酞 胺 作唯
一碳源和氮源的能力 , 采用 L ys e n k 。 , O 。 〔。 〕引用的 K os e r / s培养基和方法 , 测定 细 菌 利
用有机酸盐作唯一碳源的能力 。 采用俞大级译的 《 世界植物细菌学第一次座谈会文 集 》 〔` )
介绍的方法 , 分离噬菌体和测定菌株对噬菌体的敏感性 。 采用针刺法和喷雾法 , 进一步测定
病原菌的寄主范围 。 供试寄主有胡椒 、 假菊 、 萎叶 、 海南菊 ( iP p er h ia n a en sn e ) 、 莱豆
( P h
a s e o l u s v u l g a r i s )
、 马铃薯 ( S o l a n u m t u b e r o s u m ) 和离首 ( L a e t u e a s a t i v a ) 。
供接种用的培养物均用营养琼脂在 28 ~ 30 ℃下培养 24 一 36 小时 。 用无菌蒸馏水稀释成细
菌悬浮液 , 浓度约为 3 亿 /毫升 。 液体培养均用 。 . 5毫升滴管接种 , 每管接种一滴 。 接种后除
有说明者外均置于2 .8 一 30 ℃培养箱中培养 , 按测定项 目的要求决定培养日期 。 每项测定的数
目为三管 ( 皿 ) 。 以无菌蒸馏水为对照接种 。 在测定对碳源的发酵或利用的项 目时 , 设无碳
源培养基作为对照 。
二 、 结 果
1
. 菌体形态和染色反应 5 个菌株的菌体均为短杆状 , 末端圆形 , 大小。 . 4~ 0 . 7 x
1
.
0~ 2
.
4协 , 单个或成双排列 , 也有 3 ~ 5 个的短链 。 革兰氏染色阴性反应 , 无芽袍 , 无荚
膜 , 有运动性 , 鞭毛单根极生 ( 图版卜 1 ) 。
2
. 培养性状 牛肉膏陈培养液和酵母膏陈培养液振荡培养 24 小时和静止培养 7 天 , 培
养液均为轻度浑浊 , 无液面生长 , 沉淀物不明显 。 牛肉膏脉酵母葡萄糖培养液振荡培养 24 小
时和静止培养 7 天 , 培养液均为中度浑浊 , 液面生长环状 , 沉淀物少量 。 牛肉膏陈琼脂斜面
培养和酵母膏脉琼脂斜面培养 7 天 , 菌苔均为线状 , 中度生长 , 乳酪状 , 不粘稠 , 乳白带浅
黄色 , 培养基不变色 。 牛肉膏陈琼脂平面培养 7 天 , 菌落圆形 , 直径 1 ~ 2 毫米 , 表 面光
T6 热 带 作 物 学 报 2 卷 .
滑 , 闪光 , 边缘完整 , 乳酪状 , 低度凸起 , 半透明或不透明 , 乳白带浅黄色 。 牛肉膏脉酵母
葡萄糖琼脂斜面培养和平面培养的性状除了表现生长较丰盛 , 菌落较大 ( 直径 3一 5毫米 ) ,
不透明 , 淡黄色外 , 其余性状均与前两种培养基的培养性状相同 。
马铃薯斜面培养 7 ~ 14 天 , 菌苔均为线状 , 中度生长 , 乳酪状 , 不粘稠 , 浅黄 色 至 黄
色 , 基物稍变色 。 马铃薯葡萄糖琼脂斜面培养 14 天 , 菌苔呈现黄色 。
3
。 荧光色素测定 5个菌株分别在 K in g B培养液 、 C la r a , C . F . 培养液 、 tS ar r ,
M
.
P
. 培养液和牛肉汁脉培养液中培养 1 ~ 21 天 , 均无荧光色素 ( 在 2 5 7 3人紫外 光 灯 下 观
察 ) 。
4
。 生理生化特性 5 个菌株的生理生化反应测定结果均为 : 耐盐度 2 % , 初 始 生 长
p H值为 5 。 6~ 8 . 5。 可以在 5 ℃和 37 士 1 ℃生长 , 不能在 41 士 1 ℃生长 。 触酶阳性 , 氧 化酶
阴性。 产氨 , 产硫化氢 , 不产引味 , 水解淀粉 , 明胶液化 , 硝酸盐不还原 , M . R 。 和 V 。 P 。反
应阴性 , 石蕊牛奶产碱和陈化 。 能利用唬拍酸盐 、 苹果酸 、 乳酸盐 、 柠檬酸盐作唯一碳源 ,
并呈碱性反应 。 不能利用草酸盐 , 酒石酸盐 , 日一经基丁酸盐和精氨酸作唯一碳源 。 稍能利用
天门冬酞胺作唯一碳源和氮源 。 对甲酸和醋酸盐的利用能力如何 , 反应不明显 ( 详见表 1 ,
表 2 ) 。
扮一项 目 初始生长 鉴别性生长温度 耐 触 氧 氨 硫 日引 淀 明胶液化 硝 M . R . V 。 P 。 石蕊气 \ 扩 P H 盐 酶 化 化 噪 粉 酸 牛奶弘 果 度 酶 氢 森 盐最低最高 5 ℃ 37 士 1 ℃ 4 1士 1 ℃ (多 ) 平板 还原牙刺
Pn 一 1 5 . 6· 8 . 6. W + 2 十 十 + + W + b
.
p
.
P
s一 1 5 . 6 . 8 ` 6. W + 2 + + + + W 十 b
.
p
,
P n 一 2 5 . 6 . 8 . 5 . W + 2 + + + + W + b
.
p
.
Pb一 1 5 . 6. 8 . 6 . W + 2 十 + + + W + b
.
p
.
P
s p 一 1 5 6 8 . 6 W 十 2 + + + + W + b
.
p
.
. b表示产碱 . p 表示陈化 . w表示弱反应 , + 表示正反应 , 一表示负反应 。
表 2 对有机酸和氨基酸作为唯一碳源的利用泣…:p n 一 1 1
P , 一 1 }
p n 一 2
}
p b一 1
{
F s p一 立 1
p一经基
醋酸钠 草酸钠 唬拍酸钠 苹果酸 乳酸钠
丁酸钠
} }
D L一精
}
天门冬
柠檬酸钠 }酒石酸钠 { }一}一 }垦竺{二竺十 } 一 } 一 } W
+ } 一 } 一 { W
+ }
一
} 一 1 丝
+ !
一
}
一
} W
+ } 一 ! 一 ! W
++十 十++一十
酸一
十一土士
. 士表示反应不明显或 一可疑
2期 文衍堂等 :悔南胡椒属植物细菌性叶斑病病原菌的鉴定
6个菌株的碳水化合物发酵测定结果均为 :葡萄糖氧化产酸不产气 , 果糖 、 木糖 、 半乳
糖 、 乳糖 、 麦芽糖 、 甘露醇 、 海藻糖和甘油产酸不产气 。 水杨普不产酸不产气 , 但能生长 。
蔗糖 、 山梨糖 、 鼠李糖 、 棉子糖 、 肌醇不产酸不产气 ( 详见表 3 ) 。
酵 测
水杨,一+·人l州
we州训川 .醇肌一一棉子糖李鼠箱
定一…海枪藻山梨搪发一…|一露甘醇物一、.ù-后断一…! .G乃a一蔗稚一为A化一麦芽搪半乳木糖 搪果糖 GA人为A人A水一…人A碳一吐|.|刊l||l||.es引|,AAAAP n 一 1P s 一 卫P n 一 2P b一 1P SP 一 1E s . e o l i A G I A G A G
人
A G
A
.
A 表示产酸 , G表示产气 , 一表示不产酸不产气 , 十 表示生长
5
. 致病性测定 5 个菌株针刺接种胡椒 、 假药、 海南药、 萎叶均能产生水渍状角形病
斑 ( 在潮湿时更典型 ) , 针刺接种菜豆叶片只产生褐色小点 ( 伤 口边缘变褐 ) 。 针刺接种马
铃薯叶片和葛芭叶片均不发病 。 用喷雾法接种于胡椒和萎叶的叶片上 , 也能产生水渍状角形
病斑 ( 图版 I 一 2 、 3 、 4 ) , 用同法接种菜豆叶片不发病 。
6
. 噬菌体的分离和敏感性测定 用 P s一 1 菌株分离噬菌体 , 经纯化后暂定 为 P s一 1
一 P , 用 P n一 2 菌株分离噬菌体 , 经纯化后暂定为 P n 一 2 一P 。 用 P n一 1 菌株经过 不 同 季
节的三次分离 , 未分离到该菌株的噬菌体 。 菌株对噬菌体敏感性测定结果如下 : P s一 1一 P
只对 P s一 1 敏感 , 对其余 4 个菌株不敏感 。 P n一 2 一 P则 对 P n一 2 , P b一 1 和 sP p一 1 敏
感 , 对 P s一 1 和 P n一 1不敏感 。 上述两个噬菌体对水稻白叶枯病菌和水稻条斑病菌不 敏感
( 详见表 4 ) 。
表 4 噬 菌 体 敏 感 性 测 定
今:之之~ 望示 , { ! ! :! { ! { ”兰鱼兰三…!兰州兰…兰 {兰逻二口竺立{一竺竺兰P。一 卜 P l 一 I + { 一 t 一 { 一 1 一 l -
p n一 2 一 p } 一 ! 一 { + } + } + I 一 ! -
o p一 , ! 一 } 一 1 一 } 一 I 一 t + } -
xo 一 P } 一 I 一 ! 一 } 二 I 一 } 一 { . 十
一 O p一 1为X . o汀 z a e的噬菌休 ; X o一 P为X . o r yZ i e o l a的噬菌体
三 、 讨论和结论
上述鉴定结果表明 , 6 个菌株在形态 、 染色反应 、 培养性状 、 生理生化和致病性等方面
7 8热 带 作 物 学 报 2卷
均无差异。 据此可以认为 , 为害海南岛胡椒及其同属植物的细菌叶斑病的病原细菌同属于一
个 “ 种 ” 。
这个 “ 种 ” 在菌落形态 、 鞭毛数目、 荧光色素 、 耐盐度 、 产生硫化氢 、 淀粉水解 、 石蕊
牛奶 、 碳水化合物发酵和致病性等方面与 R o b b 、 , C 。 F . 鉴定过的 种 P s e u d o m o n as s y r i -
gn ae va n H al l有显著差异 , 在菌落颜色 、 荧光色素 、 运动性和碳水 化 合 物 发 酵 方 面 与
B
u r
k h
o l d e r鉴定的萎叶叶斑病菌 P s o u d o m o n a , b e t l e ( R a g u n a t h a n ) B u r k h o ld 。 r 也 有显
著差异 。 然而与 P at e l等人鉴定的又为 M at he 二 , J . 等人证实的萎叶叶斑病菌 X an ht 。二 on as
b献 l ic ol a P at el e t al . 比较 , 除不能使蔗糖发酵产酸和稍能利用天门冬酸胺作唯一碳源和
氮源外 , 其余所测定的性状均相似 。 可以认为 , 为害海南胡椒及其同属植物的叶斑病原细菌
也是X a nt h o m 。 。 as be lt i co l a ; 至于它们对蔗糖和天门冬酞胺利用的差异 , 可能是菌系间的
差异 。
根据菌株对噬菌体敏感性测定的结果 , 5 个菌株初步分为两个 不 同 的 噬 菌 体 型 , 即
P s一 1 一P噬菌体型和 P n一 2 一 P噬菌体型 , P n一 1是否属非噬菌体型有待研究 。
参 考 文 献
〔 1 ) 华南热带作物学院等 , 1叨 6 : 胡椒细菌性叶斑病 . 热作科技通讯 , 19钻 ( 3 ) . 1 3 e l乐
〔 2 〕 文衍堂等 , 19 7 : 发现胡椒细菌性叶斑病菌的第二寄主 。 热作科技通讯 , 1叨 , ( 6 ) , 38 .
〔 3 〕 西北农学院植保系植病教研组 , 197 5 : 植物病理学研究技术 .
〔 4 ) 中国科学院微生物研究所细菌分类组 , 19 龙 : 一般细菌常用鉴定方法 .
( 8 〕 俞大级泽 , 19 7 5: 世界植物细菌学第一次座谈会文集 . 国外农业科技资料 , 197 7 ( 6 ) .
〔 6 〕 A s t五a n a , R . P . & M a h功 u d , K . A . , 19 45 : B a e t e r i a l le a f s p o t o f P i p e r b e t l e . I n d i a n J . A g r i c .
S
e i
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P
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2 8 3 一 2 8 8 。
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c
o r n e
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E x p e r
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V
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b
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,
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〔1 1 〕 P a t e l , M . R . 。 t a l . , 1 951 : T h r e e b a e t o r i a l d i s e a s o s o f P l a n t s 。 C u r r . S e i . , 2 0 (4 ) . 1 0 6 -
( 1 2 〕 R a g“ n a t h a n , C . , 1 92 6 : B a e t e r ia l l e a f s p o t o f B e t e l 。 C o y l o n D e p t , o f A g r i e . l e a f l e t , N o ,
3 9
,
P
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1
.
( 1 3〕 R a g u n a t h a n , C . , 1 9 28 : B a e t e r i a l l e a f sp o t o f B e t e l . A n o . R o y B o t . G a r d . , P e r a d e n i y a , X l ( i ) .
6 1一 61
.
〔1 4〕 R o bb s , C . F . 1 9 59 : U 口 a d o e n o a d a o t e : i a n a d a P玉m e n t e i r a d o r 。 10 0 (P I P e r n i g r u口 ) n o v a p a r a o
B
r a s i l
。
R e v i s t a d e A g r i e o l t o r a
,
3 4 (4 )
:
26 3一 26 .
〔1 5 ) S t a r r , M . P . e t a l . , 1 9 3 4 : G r o w t h o f p h y t o p a t h o g e n i e B a e t e r i a i n A 、 y n t h e t i c A s p a r a g i n
M e d i u m
。
P五y t o P a t h o l o g y , V o l . 3 3 , 3 1 4一 3 1 8 .
2期 文衍堂等 :海南胡椒属植物细菌性叶斑病病原菌的鉴定 ? 0
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, a n d p a t h o g e n i e i t v
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e d “ e e p t t h a t t h e y d o n o t m a k e s u e r o s e f e r m e n t t o p r o d u e e a e i d a n d t h e y
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t h e r e f o r e e o n s i d e r e d t h a t t h i s s P e e i e s 15 e x a e t l y X
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b
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m e n t i o n e d d i f f e r呱 e e s m i g h t b e r e s u l t e d f r o m d i f f e r e n t s t r a i n s . D i f f e r e n t p h a 乌e
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o f t h e i s o l a t e s t o d i f f e r e n t P h a g e s
。
文衍堂等 : 胡椒属植物细菌性叶斑病病原菌初步鉴定 图版 I
1
. 病原菌形态
2 一 3胡淑叫一片一症 状
4
. 薯叶叶 片症状