全 文 ：农业生物技术学报 Jou ma lo fA gi re u l tu a ri l Bo te e ho n loy g 20 00, 8 (4 ): 3 6 1一 364
· 研究报告 ·
葡萄属植物抗黑痘病基因的 R A P D 分析*
王西平 ’ 王跃进 ’ 周 鹏 ’ 郑学勤 ’
( 1西北农林科技大学园艺系 , 陕西杨陵 71 2 10 0 ; 2 中国热带农业科学院热带作物生物技术国家重点实验室 , 海南 5 71 10 1)
摘要 : 采用田间自然鉴定的方法 , 研究了中国野生葡萄部分种和株系 、 欧洲葡萄及其杂种、 葡萄种间杂交组合毛葡萄
商一24 ` 欧洲葡萄龙眼的 F : 群体对黑痘病的抗性 。 结果表明 , 中国野生葡萄的部分种和株系对黑痘病表现了高度的抗性 。 种间
杂交后代对黑痘病的抗性存在很大的差异 。 欧亚种葡萄品种间对黑痘病的抗性存在抗病和感病两种类型 。 欧美杂种葡萄品种
间对黑痘病的抗性只存在抗病程度的差异 。 运用 R A P D 技术 , 采用集群分离分析 (b ul ke d se g er g an t an al ys is , B S A ) 的方法进
行葡萄抗黑痘病基因连锁的分子标记的研究 , 获得了与抗病基因相连锁的 RA P D 标记: O P V 02 一60 0 和 O PJ 13一 30 0 , 并在杂种
后代 、 葡萄野生种 、 河岸葡萄和欧洲葡萄中进行了验证 。
关键词 : 葡萄; 抗黑痘病; R A PD
R A PD A n a ly s i s o f 巧1t’S t o A n thr a c n o s e R e s i s t a n t G e n e
认值n g x ip i n g , 认值n g uY ej i n , Z h o u p e n g , Z h e n g X u e q i n ,
( I D e Part m e n t o f H o rt ie u ltU er
,
N o rt hw e s et m S e ie n e e a n d eT e h n o l o g y U n iv e r s it y o f A g r i e u lot er an d Fo er s t yr, Y a l l g li n g s h an x i 7 12 100 ;
2 N at i o n a 1 K e y B i o et e h n o lo g y L ab
o art o yr fo r T『o Pi e a l C or Ps
,
S o u th C h in a A e a d e m y o f T r o P i e a l C r o Ps
,
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A b s t r a e t : hT
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e v i n e s ot a n th r a e n o s e (SP h a c e lo m a a 刀p 己j I’ Jum d e B卿 ) w a s s t u d ie d by n atU r a l i n fe e t io n in if e ld
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T h e er s u lt s in d ie at e d th e w i ld g r a Pe s o f C h in a w e er h ig h ly er s is tan t ot an th ar
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T h e er w e er s u b s t an ti
a l d i fe er n e e s in er s i s t an e e t o an ht r a e n o s e am
o n g t h e e or s s F
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b i li ty in V v 介J I’fe ar an d d i fe re n e e s o f r e s i s t an t d e g re e in th e h y b r i d s . Ran d o m ly am P li if e d op ly m o rp h i e D N A (RA P D ) w a s em P lo y e d
ot d e te ct m o le e u la r m ar k e r s lin ke d ot an t h r a e n o s e re s i s tan t g e n e i
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一
3 e or s s F
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K e y w o r d : g r a Pe ; a n th r ac n o s e er s i s tan
e e ; R A P D
葡萄黑痘病 (印加“ 匆切 : a 刀护`刀” uln de b a yr ) 的就是首先对中国野生葡萄的部分种和株系 、 杂种
是危害葡萄的主要真菌病害之一 。 目前 , 对于黑痘 后代和部分葡萄品种进行抗黑痘病的田间自然鉴定 。
病的防治 , 主要以化学防治为主 。 但是 , 化学防治 然后 , 利用 R A P D l`] 技术对抗葡萄黑痘病基因进行
不仅增加生产成本 , 造成环境污染 , 还会降低葡萄 分子标记 , 从分子水平研究抗病遗传趋势 , 为抗病
及其加工产品 (葡萄干 、 葡萄酒等) 的品质 。 大量 分子标记辅助选择 (M A s) 、 基 因克隆及最终将抗
科学研究和生产实践证 明 , 利用植物自身的抗病性 , 病基因导入栽培品种提供分子依据 。
培育抗病 、 优质葡萄新品种是最经济有效的措施之 1 材料和方法
一 。 由于葡萄是多年生高度杂合的果树 , 利用常规 L l 材料 选择中国野生葡萄的部分种和株系 , 以
方法 , 对其杂种进行形态鉴定 , 至少要经历 3一4 年 , 及葡萄种间杂交组合 90 一 3 “商一24 、 龙眼” 的 F : 群体
如果进行抗病性鉴定 , 需要的时间会更长 。 如果采 及部分葡萄品种为试材 (表 1 ) 。 9 0一 3 组合杂交后代
用标记辅助育种 (M A B ) , 可 以迅速 、 方便 、 低成 的植株有 : 9一 2一2 , 9一2 一 5 , 9一3 一 1 , 9 一3一 4 , 9一3 一6 , 9一 3一8,
本地进行杂种后代的抗病性鉴定 。 本研究的研究目 9一 3一 9 , 9一 4一 3 , 9一 4一 5 , 9一4 一 8 , 9 一5 一 2 , 9一 5一 4 , 9 一6一 1 ,
本 国家自然科学基金资助项目 ( 397 05 2 5) 、 高校博士点基金资助项 目 (98 0 70 1) 和教育部资助年青优秀教师墓金项 目
王西平 : 男 , 31 岁, 在职博士生 , 讲师
收稿日期: 2 0 0 0 一 0 1 一 2 6
农 业 生 物 技 术 学 报
9
一
6
一
4
,
9
一
6
一
8
,
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7
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3
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5
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3
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7
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8
一
8
9
一
9
一
l
,
9
一
9
一
8
。
1.2 3 RA
PD 标记的鉴定
2 00 0 年
以 9 0一 3 组合所有 F : 代抗
表 1 葡萄试材
几 b le 1 G ar ep m aet r i a ls u s e d fo r st u dy
种 S p e c ie s
毛蔺萄 V q u ln q u a gn u la lkr R动d
品种或株系 Va r ie yt o r e一o n e
复叶荀萄 V P ia 狐幼方 M a x im
秋葡萄 V
~
己厉 R o m a m
秋复叶有萄 V i分护
刺有萄 V da v初盯 F O e x
麦黄复叶葡萄 V ba ib朗 S店 L . X . N iu
河岸葡萄 V 刊朗门旧 M i e k x
砧木品种 s e e d lin g v a r ie yt
欧洲葡萄 V 咖方七户刀
商一 24 S h an g一 2 4
8 3
一
4
一
9 6
泰山一 12 aT is h an 一 12
8 3
一
4
一
9 4
留一 8 L in 一 8
宁固一 1 N i n g g u 一 l
江西 一2 9 J ia n g x i一 29
江西一口 J ia n g x i一 l口
千布 j一 7 厂 in g一i一7
留一 11 L iu 一 1 1
留一7 L in . 7 1
略阳一 4 L u e y a n g · 4
白河 一4 0 B a ih e一 0
河岸 3 号 U lrJ 朗 n旧 B e a u m o n t
5 0 4
龙眼 L O ngy an
粉红玫瑰 M y e k aT op e o B b l益
乍娜 Z an “
佳丽酿 c a r ig n a n e
先索 C in s au t
雷司令 R ie s l in g
白玉宽 U g n i b la n c
白诗南 C h e n in b la n c
巨峰 K y o h o
高墨 aT k a s u m i
先锋 p io n e e r
爱格丽 A ig e l i
L Z 方法
L .2 1 抗病性田间自然鉴定 自然鉴定是在发病盛
期 ( 5一 7 月 ) 于葡萄种质资源圃进行的, 参考王跃
进等 2`1 抗黑痘病鉴定方法 。
1 .2 2 葡萄基因组 D N A 的提取及其 RA P D 反应体
系 葡萄基因组 D N A 的提取采用改良 c TA B 法 飞`
葡萄 RA P D 反应体系参照文献 【31 的方法进行 。
1.2 3 与葡萄抗黑痘病基因连锁的 RA P D 标记的筛
选 采用 M i e h e lm o er 阵, 的 B S A 法进行 。 从 9 0一 3 组
合的杂交 F : 代中, 各取抗 、 感病 4 个植株的 D N A
等量混合构成一对抗病与感病的 F , D N A 库。 首先 ,
以 9 0一 3 组合亲本商一2 4 、 龙眼为模板 , 通过不同引
物的 P C R 扩增初步筛选两者之间具有多态性 D N A
片段的引物 。 然后 , 以商一24 、 龙眼 、 F ,抗病 D N A
库、 F .感病 D N A 库为模板 , 对所选引物进行 P C R
扩增来筛选与抗病基因连锁的 RA P D 标记 , 重复
2一3 次 。
病 ( 18 株 ) 、 感病 ( 4 株 ) 植株及葡萄抗病种质 2
份 、 感病种质 5 份为模板 , 以获得多态性 D N A 片
段的引物进方 P C R 扩增 , 进一步验证多态性片段的
可靠性 。
2 结果和分析
2
.
1 不同葡萄材料抗黑痘病的田间自然鉴定结果
.2 L I 葡萄野生种和欧洲葡萄抗黑痘病表现 中国
野生葡萄 6 种 13 个株系对黑痘病表现出高度的抗
性 , 最抗病的是刺葡萄略阳一4 株系 , 其次为留一8 、
留一7 、 泰山一 12 、 江西 一 1口 (绿毛 ) 、 白河 一4 0 、 江西 一2 9
(红毛 ) 、 商一 2 4 、 8 3 一4一 9 6 、 平利 一7 、 宁固一 l 、 留一 1 1
和 83 一4 一9 4 。 河岸葡萄和 5 0 4 对黑痘病也表现出高
度的抗性 。 欧洲葡萄品种间对黑痘病的抗性存在抗
病和感病两种类型 , 感病的品种有龙眼 、 粉红玫瑰 、
乍娜 、 佳丽酿和先索等 5 个品种 , 抗病的有雷司令 、
白玉霓 、 白诗南和爱格丽等 4 个品种。 欧美杂种葡
萄品种间对黑痘病的抗性存在抗病程度的差异 , 其
中巨峰表现为高抗 , 高墨和先锋表现为抗病性强。
这为进一步利用 R A P D 技术寻找与抗葡萄黑痘病基
因连锁的分子标记莫定了良好的基础 。
.2 L 2 种间杂交 F , 代抗黑痘病表现 在田间自然条
件下 , 90 一 3 组合 “商一24 ` 龙眼” 杂交后代对黑痘病
的抗性存在很大的差异 , 在 2 2 个杂交后代中, 除
9
一
3
一
6
,
9
一
4
一
8
,
9
一
7
一
3 和 9 一8一 7 等 4 个后代表现为感病
外 , 其余 18 个杂交后代全部表现为抗病 。
.2 2 与葡萄抗黑痘病基因连锁的 R A P D 标记的筛选
以 9 0 一3 组合 “ 商一 24 ` 龙眼” 亲本商一24 、 龙眼为模
板 , 共筛选 O ep or n 公司生产的随机引物 2 6 0 个 , 分
别是 K i t A 、 B 、 G 、 H 、 J 、 0 、 Q 、 V 、 W (每 K i t
2 0 个 ) 及 K i t C 、 D 、 F 、 K 、 R 、 s 、 U 的部分引物 ,
其中 13 个 ( 占 5 % ) 引物没有扩增出 D N A 片段 ,
乘(余的 24 7 个引物扩增出 1 3 94 条谱带, 平均每引
物扩增出 5 . 6 4 2 条谱带, 最大的片段长约 .2 s kb , 最
小的约 .0 23 k b 。 P C R 扩增的谱带数最多的有 18 条 ,
最少的有 3 条 , 扩增出多态性片段的引物有 82 个
(占 3 3 . 2 % ) 。
随后 , 以 9 0 一 3 组合 2 个亲本和杂交后代抗病
D N A 库与感病 D N A 库为模板 , 对这 82 个引物进
一步筛选 , 最终筛选出大小一致 , 重复性好 , 扩增
条带清晰可辨的两个连锁分子标记 : O P V 02 (A G -
T C A C T C C C )
一
6 0 0 与 O P J 1 3 (C C A C A C I人 C C ) 一3 0 0
只在抗病亲本商一 24 及抗病杂种库中出现 , 而在感
病亲本龙眼及感病杂种库中没有出现 。 因此 , 初步