全 文 ：第 40卷第 1期第 71页
2011年 2月 　　　　
华中科技大学学报(医学版)
A cta Med Univ Sci Technol H uazhong
　　　　 Vol.40　No.1　P.71
Feb.　2011
实验研究
张　悦 ,女 , 1980 年生 ,博士研究生, E-mail:px pxzyzy@gmail.com
■通讯作者 , C orresp onding author , E-mai l:yw jz@mails.tjmu.edu.
cn
冬青属两种植物的抗炎作用及自由基
清除能力研究
张　悦 , 　李陆军 , 　张　鹏 , 　皮慧芳 , 　阮汉利 , 　吴继洲■
华中科技大学同济医学院药学院 ,武汉　430030
摘要:目的　研究猫儿刺[ I le x perny i F ranch.(I.P.)]和龙里冬青[ I lex d unniana Lev l.(I.D.)] 2 种植物干燥枝叶
的乙醇提取物的急性毒性和抗炎 、清除自由基的作用。方法　以小鼠为实验动物 , 考察 2 种提取物的急性毒性;用经典
的小鼠耳肿胀和大鼠肉芽肿方法考察了 2种植物提取物的抗炎作用;并以 DPPH(2 , 2-dipheny l-1-picry lhydr azy l , 二苯代
苦味肼基自由基)和羟自由基实验评价 2 种提取物的自由基清除功效。结果　急性毒性实验显示 , 当给予提取物剂量高
达5 000 mg/ kg时 , 仍没有小鼠出现死亡或中毒反应。在小鼠耳肿胀实验中 , 2 种提取物高(1 200 mg/kg)、中(600 mg/
kg)、低(300 mg/kg)剂量组均显示了一定的抗炎作用 , 且抗炎活性呈剂量依赖性;在慢性炎症实验中 ,大鼠肉芽肿模型的
高(960 mg/ kg)、中(480 mg/kg)、低(240 mg/ kg)剂量组也显示了相似的结果。在自由基清除实验中 , 猫儿刺(I.P.)和龙
里冬青(I.D.)都显示了较好的自由基清除功效 ,对 DPPH 自由基的半数清除率 IC50分别为 13.66μg/ mL(I.P.)和 13.48
μg/ mL(I.D.),阳性对照维生素 C(Vc)的 IC50为 6.10 μg/m L;对羟自由基的半数清除率 IC50分别为 0.51 mg/m L(I.P.)
和 0.78 mg/m L(I.D.), Vc的 IC50为 0.03 mg/ mL 。结论　I.P.和 I.D.的乙醇提取物具有一定的抗炎作用和较好的自
由基清除能力。
关键词:冬青属;　猫儿刺;　龙里冬青;　急性毒性实验;　抗炎;　自由基清除
中图分类号:R284　　DOI:10.3870/ j.issn.1672-0741.2011.01.016
Anti-inflammatory and Free Radical Scavenging Activities of Ethanol
Extracts of Two Plants of Ilex
Zhang Yue ,Li Lujun ,Zhang Peng et al
School o f Pharmacy , Tongj i Medical College , H uazhong University of S cience and
Technology ,Wuhan 430030 , China
Abstract　Objective　To study the anti-inflammator y and radical scaveng ing activities of I lex perny i F ranch.(I.P.)and I-
lex dunniana Levl.(I.D.).Methods　Acute tox icity tests of ethanol ex tracts of the two plants leaves w ere car ried out.Anti-
inflammato ry ac tivities o f the leaves of tw o Ilex plants w ere eva luated using mice ear oedama and co tton-pellet g r anuloma
tests.DPPH and hydroxyl radical assay s were adopted to evaluate the free radical scavenging activity.Results　Even given as
high as 5 000 mg/ kg do se , the re w as still no dea th or o the r toxic symptoms emerg ing among tested animals.Oral administration
of e thanol ex tr ac ts of I.P.and I.D.in a high do se(1 200 mg/ kg)significantly suppressed xy lene-induced ear oedema in mice(P<
0.05).I n the chronic test , bo th the e thanol ext racts o f I.P.and I.D leaves(960 mg/ kg)show ed significant reduction in g ranulo-
ma w eight of ra ts(P<0.05).Bo th of ex tracts o f I.P.and I.D.leaves show ed a mode rate f ree r adical scavenging effect on DPPH
(IC50 , 13.66μg/ mL for I.P., and 13.48μg/ mL fo r I.D.)w hen compared w ith the positive cont rol , ascorbic acid(Vc , IC50 , 6.10μg/ mL).In hydro xy l radical assay , IC50 o f I.P.and I.D.was 0.51 and 0.78 mg/ mL respectively , while IC50 o f Vc w as 0.03 mg/
mL.Conclusion　I.P.and I.D.have the po tential to be anti-inflammato ry and f ree radical scavenging agent.
Key words　I le x;　I lex perny i;　I lex dunniana;　acute tox icity experiment;　anti-inflamma tion;　f ree radica l scaven-
ging
　　冬青科冬青属是一类具有广泛药理作用的重要 的药用植物来源 ,如:产于南美洲的巴拉圭茶(I lex
paraquariensis)是南美洲最受欢迎的饮品之一 ,被
誉为“仙草” 。在我国 ,冬青属植物也分布广泛 ,其中
许多品种在民间也被作为药用 ,如:苦丁茶(I lex
kudincha C.J.Tseng)在民间用作利尿药 、减肥药和
咽喉痛及高血压的治疗[ 1] ;另一种冬青属药用植物
毛冬青(I lex pubescens Hook.Et Arn)的干燥根 ,在
我国南方被用于心血管疾病和高胆固醇症的治
疗[ 2] ;而铁冬青(I lex rotunda)具有清热解毒的功
效 ,用作普通感冒 、扁桃体炎症 、胃肠溃疡的治疗[ 3] 。
在我国传统中药中不同植物有相同俗名的情况
非常普遍 ,特别是那些亲缘关系相近的植物 ,它们的
化学成分及药理活性常常具有相似性。研究开发与
传统中药亲缘关系相近的品种 ,可以部分解决名贵
或稀缺中药材资源问题。猫儿刺 [ Ile x perny i
Franch.(I.P.)] 和龙里冬青[ I lex dunniana Levl.
(I.D.)]是冬青科冬青属植物 ,广泛分布于湖北 、四
川 、贵州 、云南[ 4] ,且在湖北恩施地区资源非常丰富 ,
而对它们的生物活性和药理作用的研究却较少。 I-
lex perny i Franch.(I.P.)的中文名为“猫儿刺” ,与
枸骨(I le x cornuta ,在民间用作清热解毒 、祛风湿及
抗炎药)的俗名相同 。在湖北 、四川部分地区 ,龙里
冬青[ I lex dunniana Levl.(I.D.)] 作为苦丁茶饮
用 ,而苦丁茶的植物来源还有冬青属 I lex lati f ol ia
Thunb., I lex cornuta Lindl.ex Paxt.和 I lex kud-
ingcha C.J.T seng[ 5] 。苦丁茶是我国家喻户晓的保
健茶饮 ,具有清热解毒 、抗炎 、降血压 、降血脂的功
效[ 6] 。此次 ,我们选择了在湖北恩施地区资源非常
丰富的这两种植物 I.P.和 I.D.作为研究对象 ,考
察了冬青属中这两种植物的急性毒性 、抗炎和清除
自由基的作用 ,为进一步开发利用这两种新的药用
植物资源奠定基础。
1　材料与方法
1.1　植物
猫儿刺和龙里冬青于 2007年 10月采集于湖北
恩施 ,经中科院武汉植物园王映明教授鉴定为 I lex
perny i Franch.(I.P.)和 I lex dunniana Levl.
(I.D.)。植物标本保存于华中科技大学同济医学
院药学院天然药物化学教研室 。
1.2　植物提取物的制备
采集 I.D.和 I.P.的新鲜枝叶在阴凉通风处放
干后粉碎 。取干燥粉末各约 10 kg ,用 95%的乙醇
冷浸提取 5次。减压蒸馏回收溶剂 ,得到乙醇提取
物总干膏分别为 390 g(3.9%, I.D.)和 460 g
(4.6%, I.P.),保存于 4 ℃。
1.3　急性毒性实验
参照文献[ 7]的方法 。昆明种小鼠雌 、雄各 10
只 ,体重(20±2)g ,购自同济医学院实验动物学部 。
雌 、雄小鼠分笼喂养 ,自由进食进水。一次灌胃给药
5 000 mg/kg 。给药后连续观察 2周 ,每日早晚记录
动物体重变化 ,进食情况 ,毛色 ,行为变化及有无动
物死亡 。
1.4　二甲苯诱导的小鼠耳肿胀实验
实验方法参照文献[ 8] 。昆明种小鼠 80 只 ,雌
雄各半 ,体重(20±2)g ,由同济医学院实验动物学部
提供。在室温(22±2)℃,相对湿度 60%～ 70%条
件下喂养 1 周 。随机分为:空白对照组;I.D.高
(1 200 mg/kg)、中(600 mg/kg)、低(300 mg/kg)剂
量组;I.P.高(1 200 mg/kg)、中(600 mg/kg)、低
(300 mg/kg)剂量组;吲哚美辛(0.5 mg/kg)阳性对
照组。各组溶液均以含 10% tw een-80的生理盐水
配置。灌胃给药 ,每天给药 1次 ,连续 5 d 。第 5天 ,
给药 30 min后以二甲苯涂布小鼠右耳正反两面各
10 μL ,以诱导小鼠炎性肿胀 。40 min 后 ,脱颈处死
小鼠 ,用 9 mm 打孔器于左耳和右耳同一部位冲下
圆形组织片 ,于分析天平上分别称重 ,以两侧重量的
差值[右耳(mg)-左耳(mg)]表示肿胀程度。
1.5　大鼠肉芽肿实验
实验方法参照文献[ 9] 。雄性 SD 大鼠 64 只 ,
体重200 ～ 220 g ,由同济医学院实验动物学部提供 ,
在室温(22±2)℃,相对湿度 60%～ 70%条件下喂
养 1周 。随机分为:空白对照组;I.D.高(960 mg/
kg)、中(480 mg/kg)、低(240 mg/kg)剂量组;I.P.
高(960 mg/kg)、中(480 mg/kg)、低(240 mg/kg)剂
量组;吲哚美辛(0.25 mg/kg)阳性对照组 。各组溶
液均以含 10% tw een-80的生理盐水配置 。
手术前禁食 12 h ,自由饮水。所有手术均在上
午 9:00 ～ 12:00之间进行 ,以避免实验动物的昼夜
节律误差。手术当天 ,各组首次灌胃给药 , 30 min
后实施手术 。将大鼠于乙醚浅麻醉下行无菌操作 ,
将 2个(30.0±1.0)mg 灭菌棉球分别植入大鼠左
右两侧蹊部皮下 ,缝合 。接下来连续给药 7 d。第 8
天 ,脱颈处死大鼠 ,取出棉球 ,置 60 ℃过夜干燥后称
重 ,减去棉球本来的重量 ,即得肉芽肿的重量。
计算肿胀抑制率(IR , %)=[(T c -T T)/T c ] ×
100%, T c =空白对照组肉芽肿重量 , T T =给药组肉
芽肿重量
1.6　自由基清除功效测试
1.6.1　DPPH 清除　DPPH 全称为二苯代苦味肼
基自由基(2 , 2-dipheny l-1-picrylhydrazyl), DPPH
有单电子 ,在 517 nm 处有强吸收 ,甲醇溶液呈深紫
色 。当有自由基清除剂存在时 ,由于与 DPPH 单电
子配对而使溶液吸收逐渐消失 ,褪色程度与 DPPH
·72· 华中科技大学学报(医学版)　　2011年 2月第 40卷第 1期
接受的电子数呈定量关系 ,通过测定吸光度的减少
量可确定自由基清除剂的清除能力[ 10] 。
取各浓度提取物 1 mL 以甲醇溶解 ,终浓度 0.4
～ 50.0 μg/mL ,加入 DPPH 甲醇溶液 1 mL , 30 ℃
温浴 30 min(恒温水浴箱),以分光光度计于 517 nm
处测吸光度值(AA);取各浓度提取物 1 mL 与1 mL
纯甲醇混合后 ,在 517 nm 处测吸光度值(AB);再测
1 mL DPPH 与1 mL 纯甲醇混合后在 517 nm 处的
吸光度值(AC)。清除能力 Inhibition(%)=[ 1 -
(AA -AB)/ AC] ×100%。以维生素 C(V c)作阳性
对照 ,实验重复 3次 。
1.6.2　羟自由基清除　取各浓度提取物 1 mL 以
甲醇溶解 ,终浓度 0.05 ～ 1.00 mg/mL。用羟自由
基测定试剂盒(南京建成生物工程研究所)测定。以
Vc作阳性对照 ,实验重复 3次。
1.7　数据处理
实验结果以均数±标准差表示 。采用 ANO-
VA 检验 , S tudents-Newman-Keuls po st hoc test。
以 P<0.05为差异有统计学意义。
2　结果
2.1　急性毒性实验
一次性灌胃给予高达 5 000 mg/kg 的 I.P.或
I.D.后观察 ,14 d内小鼠的进食量 、行为均无异常 ,
没有动物死亡或其他中毒反应 , 平均体重增加
64.4%。
2.2　抗炎实验
如表 1所示 , I.P.和 I.D.的高 、中 、低剂量组
均显示了一定的抗炎作用 , 其中高剂量组(1 200
mg/kg)肿胀程度抑制率(inhibition rate , IR)分别为
58%和 51%,与空白对照组比较差异有统计学意义
(均 P<0.05)。而在大鼠肉芽肿实验中也显示了相
似的结果 , I.P.和 I.D.的高剂量组(960 mg/kg)显
示了明显的抑制作用。
表 1　I.P.和 I.D.提取物抗炎活性
Table 1　Ant i-inflamm atory activit ies of the ex t ract s
T reatmen ts
Dose Ear oedema(n=10)
(mg/ kg) Δ(mg , x±s) IR(%)
Dose Granuloma ti ssue w eight(n=8)
(m g/ kg) Δ(mg , x±s) IR(%)
C ont rol -　 19.4±4.8 - - 59.7±8.5 -
(10% Tw een 80)
I.P. 1 200 8.2±1.8＊ 58 960 45.8±4.7＊ 23
600 10.6±3.3 45 480 49.3±9.2 17
300 14.9±3.9 23 240 50.5±11.5 15
I.D. 1 200 9.5±4.1＊ 51 960 46.0±8.5＊ 23
600 13.4±3.5 31 480 47.8±10.4 20
300 16.5±3.9 15 240 51.7±10.2 13
Indomethacin 0.5 4.4±2.4 77 0.25 33.6±4.4 43
　　＊P<0.05 vs cont rol g rou p(the analy sis of variance)
2.3　自由基清除能力
在 DPPH 实验中 , DPPH 自由基能被 I.P.和
I.D.2种提取物明显清除 ,且清除能力呈浓度依赖
性 , IC50分别为 13.66 μg/mL 和 13.48 μg/mL(阳
性对照 Vc IC50 , 6.10 μg/mL)。在羟自由基实验
中 , I.P.和 I.D.清除自由基的 IC50分别为 0.51
mg/mL 和 0.78 mg/mL(阳性对照 Vc IC50 , 0.03
mg/mL)。见图 1 , 2。
3　讨论
冬青属植物具有广泛的药理活性 ,如:抗炎 、抗
图 1　I.P.和 I.D.对 DPPH 抑制率
Fig.1 Inhibiti on rate of I.P.and I.D.t o DPPH
·73·张　悦等.冬青属两种植物的抗炎作用及自由基清除能力研究
图 2　I.P.和 I.D.对羟自由基抑制率
Fig.2 In hibit ion rate of I.P.and I.D.to hydroxyl radical
氧化 、抗菌及作用于心脑血管系统的活性 ,还有降血
脂 、减肥 、提高免疫力等作用[ 11] 。自由基生物学提
示我们 ,炎症 、肿瘤及局部缺血再灌注损伤与活性氧
导致的脂质过氧化有着密切的联系[ 12] 。而炎症除
了是许多疾病 ,如风湿性关节炎的病理表现 ,更是不
少疾病如动脉粥样硬化等的元凶[ 13] 。近年来还发
现 ,炎症和免疫失调之间存在着内在联系。本研究
考察了猫儿刺和龙里冬青的体内抗炎药效学和体外
清除自由基的功效。
在实验中 ,猫儿刺和龙里冬青的抗炎效应通过
小鼠耳肿胀和大鼠肉芽肿两种经典模型得到了证
实。而 DPPH 和羟自由基实验又证明了两种植物
提取物的自由基清除功效 。这一结果为我们进一步
展开两种植物的药效学及其物质基础的研究提供了
切实的数据 。通过查阅文献 , 我们发现谢光波
等[ 14-17]已从猫儿刺中发现大量的三萜及其皂苷类 、
黄酮类成分。猫儿刺的药用功效很有可能就是源于
这些成分的作用 。而对龙里冬青的研究尚未见文献
报道 。因此我们认为 ,进一步对冬青属的这两种植
物的物质基础及作用机制加以研究很有意义 ,而且
可以进一步丰富对冬青属药用植物抗炎 、抗氧化作
用的认识 。
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(2010-06-22　收稿)
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