全 文 ：西北农业学报　2010 , 19(3):154-158
Acta A griculturae Boreali-occidentalis Sinica
葡萄属植物种质资源遗传多样性的 RAPD分析＊
侯鸿敏 ,李慧娥 ,肖　欢 ,王西平＊
(西北农林科技大学 园艺学院 ,农业部西北园艺植物种质资源与应用重点开放实验室 ,陕西杨凌　712100)
摘　要:以起源于中国的野葡萄 12 个种 23 个株系 、欧美杂种 6个品种 、河岸葡萄 3 份 、15 个欧洲葡萄品种共
47 份材料为试材 ,采用 RAPD技术对葡萄属植物种质资源遗传多样性进行研究。从 520 个随机引物中获得
16 个多态性好的引物用于 RAPD分析 ,共获得 DNA 条带 258 个 , 其中多态性条带 186 个 , DNA 条带大小介
于 100～ 3 500 bp 之间。应用 STA TIS T ICA 获得了 47 份葡萄材料树谱图 ,供试材料可分为6 类。欧洲葡萄 、
欧美葡萄杂种 、河岸葡萄与中国野葡萄亲缘关系较远。在中国野葡萄中 ,山葡萄与其他种亲缘关系较远 , 刺葡
萄次之。
关键词:葡萄;RAPD;种质资源;遗传多样性
中图分类号:Q946-33　　　　文献标识码:A　　　　　文章编号:1004-1389(2010)03-0154-05
Genetic Diversity Based on Random Amplified
Polymorphic DNA(RAPD)in Vitis
HOU Hongmin , LI Huie ,XIAO Huan and WANG Xiping＊
(College of H orticulture , Key Labo ratory of Northwest Hort icu lture Plant Germplasm and Application
of Agricu ltu re Minist ry , Northwest A&F University , Yangling S haanxi　712100 , China)
Abstract:Genetic diversi ty among 47 geno types of grape , including a set of 23 genotypes of 12 wi ld Vi-
ti s species native to China , six inter-speci fic hybrids (V.v ini fera ×V .labrusca), three clones o f V.
riparia , and fif teen V .v ini fera L .cultivars ,was invest igated based on RA PD analysis.Six teen poly-
morphic random primers were selected for the further analy sis f rom the screening of 520 o ligonucleot i-
de primers.A to tal of 186 polymorphic RA PD marker s among 258 bands , size ranging f rom 100 bp to
3500 bp , we re produced from the 16 selected primers.Relationships among the 47 clones or accessions
based on thei r g enetic distances w ere clustered using unw eighted pai r-g roup method arithmet ic average
(UPGMA)analysis in a dendrog ram.For ty-seven g rape species we re clustered to six g roups.The lar-
gest distance w as found betw een V .v ini fera ,V.riparia , inter-specific hybrid(V.vini f era ×V.la-
brusca)and the w ild g rapes native to China.Among the w ild Vitis species nat ive to China , the larg est
distance w as found betw een V.amurensis and the o ther w ild species.
Key words:Grape;RAPD;Germplasm resource ;Gene tic diversi ty
　　葡萄属于葡萄科葡萄属 ,共有 70余种。关于
葡萄属植物种质资源的遗传多样性 ,前人曾用形
态学 、细胞学和同功酶技术作过一些研究和探讨 ,
但由于该属内种间易杂交 ,中间型 、过渡型性状普
遍 ,加之易受环境和生长发育时期的影响 ,给葡萄
属植物分类和种质资源多样性研究带来许多困
＊收稿日期:2009-08-12　　修回日期:2009-10-15
基金项目:国家自然科学基金(30871701和 30671446);教育部新世纪优秀人才支持计划及陕西省自然科学研究计划(2005C106)项
目资助。
作者简介:侯鸿敏(1985 -),女,在读博士研究生 ,研究方向为果树生物技术与育种。 E-mail:h ouhongmin@163.com
＊通讯作者:王西平 ,教授 ,博导 ,主要从事果树生物技术与育种及园艺植物种质资源与生物技术研究。 E-m ail:wangxip-
ing@nw su af.edu.cn
难[ 1-3] 。近年来 ,随着现代生物技术的快速发展 ,
DNA 分子标记技术将种质资源的研究提高到了
一个崭新水平[ 4] ,为果树品种鉴定和亲缘关系研
究提供了有效的手段。随机扩增多态性 DNA
(Random ly amplified polymorphic DNA , RAPD)
技术作为近年来发展最快的一种分子标记技术 ,
由于它具有样品用量少(通常 15 ～ 25 ng )、灵敏
度高 、特异性强和检测容易的特点 ,且此技术简单
易行 、分析自动化 ,实验成本低 ,因而已被广泛应
用于果树的亲缘关系 、品种鉴定和遗传多样性研
究中 。近年对葡萄属植物的研究也有一些报道。
Gogo rcena等[ 5] 先后对 31 个栽培葡萄品种进行
RAPD分析 ,从中选出可重复带型 ,可正确区分所
有品种的无性系等 。王跃进等[ 6] 用 RAPD 技术
在幼苗期鉴定了圆叶葡萄和真葡萄亚属的杂交
种 ,获得了多态性片段。张立平等[ 7] 用 RA PD技
术对葡萄属的 20个种 、4个变种 、5个品种及 4个
不同类型进行分析 ,供试材料可分为 9类和 1个
特殊型 ,起源于中国的东亚类群分属于 8个类型 ,
圆叶葡萄单独为 1 个类型。本研究采用 RAPD
技术和类平均法[ 8] 对起源于中国的野生葡萄 、欧
美杂种 、河岸葡萄 、欧洲葡萄等 47份葡萄材料进
行分类和遗传多样性研究 ,探讨种间及种内的遗
传关系 ,为葡萄育种研究提供分子系统学资料。
1　材料与方法
1.1　葡萄材料
供试葡萄材料取自西北农林科技大学葡萄种
质资源圃 ,包括起源中国的野葡萄 12个种 23个
株系 ,欧美种间杂种 6个品种 ,河岸葡萄 3份 ,15
个欧洲葡萄品种共 47份材料(表 1)。
1.2　葡萄基因组 DNA的提取
葡萄基因组 DNA 的提取采用改良 CTAB
法[ 9] 。
1.3　DNA扩增和琼脂糖凝胶电泳
从 Operon 公司购置的 OPA01 ～ OPZ20 共
26个系列的 520个随机引物用于 RAPD扩增 ,筛
选出条带清晰 ,多态性好的引物用于进一步分析。
RAPD反应体系和反应程序参照文献[ 12]的方法
进行 。扩增产物跑 1.2%琼脂糖凝胶电泳约 40
min ,在紫外透射仪下照相 ,分析统计结果。
1.4　葡萄材料分类和遗传多样性分析
用筛选出多态性好的随机引物分别扩增 47
份葡萄材料 DNA ,记录每份 DNA 的 RAPD 带
型 ,有带时赋 1 ,无带时赋 0 ,建立(0 , 1)矩阵 ,用
STA TIS TICA 软件进行聚类分析 。
表 1　试验用葡萄材料
Table 1　Grape materials used in this expriment
种
Species
编号
No. 株系Clone 种Species 编号No. 品种Cult ivar
毛葡萄 V .qu inquangular is Read 1 商-24 Shang-24 25 雪峰Xuefeng
2 83-4-96 ♂ 蘡薁葡萄 V.adstricta
H ance
26 泰山-1Taishan-1
3 83-4-94 ♂ 欧美杂种
Interspecifi c h ybrid
27 京超 Jingch ao
4 泰山-12 Taish an-12 (V .vini fera ×V .la-brusca) 31 巨峰Kyoh o
Berlandier-riparia 5 SO4 Select ion
Oppenheim
41 先峰Pioneer
桑叶葡萄 V .f i ci fol ia Bunge 6 桑叶葡萄 42 高墨 Takasumi
复叶葡萄 V .piasez kii Maxim 7 留坝-8 Liuba-8 43 早生高墨 Early-T ak asumi
18 宁固-1 Ninggu-1 44 富士 Fu jiminori
秋葡萄 V .romaneti i Roman 8 江西-2 Jiangxi-2 欧洲葡萄 28 雷司令 Riesling
19 江西-1 Jiangxi-1 V .vini fera L 29 先索Cinsaut
20 平利-7 Pingli-7 30 蜜红 Honny Red
21 留坝-11 Liuba-11 32 龙眼 Longy an
华北葡萄 V .bryoni i fol ia Bunge 11 安林-2 Anlin-2♂ 33 玫瑰香M uscat Rose
河岸葡萄 V .ripar ia Mich aux 9 Pu lliat 34 乍那Zana
10 Beaumont 35 佳利酿C arignane
秦岭葡萄 V .qinl ing ensis P.C.He 12 秦岭葡萄Qinling Putao 36 白玉霓 Ugli Blan c
山葡萄 V .amurensis Rupr. 13 通化-3 Tong hua-3 37 品丽珠C abernet Franc
华东葡萄 V .pseudoreticulata W.T.Wang 14 商南-1 Shangnan-1 38 红地球 Red Globe
15 广西-1 Guang xi-1 39 赤霞珠C abernet sauvignan
秋复叶葡萄 V .spp.(Qiufuyie) 16 留坝-7 Liuba-7 40 瑞必尔 Ribier
麦黄复叶葡萄 V .baih ensis L.X.Niu 17 白河-40 Baihe-40 45 爱格丽 Ecolly
刺葡萄 V .david ii Foex 22 略阳-4 Lueyang-4 46 梅鹿特M erlot
23 宁强-6 Ningqiang-6 47 凤凰-51Fenghuang-51
24 塘尾 Tangw ei
·155·3 期　　　　　　　　　　　　侯鸿敏等:葡萄属植物种质资源遗传多样性的 RAPD 分析
2　结果与分析
2.1　葡萄属植物基因组 DNA多态性
首先以毛葡萄商-24 的 DNA 为模板 , 从
OPA01 ～ OPZ20等 26个系列的 520个随机引物
中选出 16个条带清晰 ,多态性好的引物用于葡萄
种质资源遗传多样性分析(表 2)。结果表明 ,所
有 47份葡萄材料中 ,16个引物共获得 DNA 条带
258个 ,其中多态性条带 186 个 ,约占总条带数的
72.1%。不同引物产生的条带数不同(图 1),引
物 OPB06扩增的条带最多为 24 个 ,引物 OPU20
最少为 7条 ,平均每个引物获得 DNA 条带 16.1
个。扩增 DNA 条带大小介于 100 ～ 3 500 bp之
间 ,大多数介于 200 ～ 2 200 bp之间 。47份葡萄
材料中 ,每个引物扩增总的条带数也不同 ,毛葡萄
最多 138 条 ,龙眼 、红地球 、刺葡萄宁强-6 较少 ,
介于 89 ～ 102条之间 。
表 2　随机引物及 DNA扩增条带
Table 2　DNA bands amplified by random primers in grape materials
引物
Primer
序列
S equence
总条带
Total b ands of
am plifi cation
多态性条带数
Polymorphic
bands
每模板平均条带
Average amplif ied
b and s per template
多态性百分率/ %
Percent of
polym orphism
OPA15 5′T TCCGAACCC 15 10 6.5 66.7
OPB06 5′TGCTCTGCCC 24 20 10.0 83.3
OPB12 5′CCT TGACGCA 18 14 6.5 77.8
OPQ03 5′GG TCACCT CA 17 12 7.5 70.6
OPW02 5′ACCCCGCCAA 14 9 5.5 64.3
OPW01 5′CTCAG TGTCC 21 15 7.5 71.4
OPJ03 5′TCTCCGCT TG 15 11 7.0 73.3
OPO07 5′CAGCACTGAC 10 6 5.0 60.0
OPV02 5′AGTCACTCCC 21 13 9.0 61.9
OPV05 5′TCCGAGAGGG 11 7 4.5 63.6
OPJ13 5′CCACACT ACC 19 13 7.5 68.4
OPJ19 5′GGACACCACT 16 13 8.0 81.2
OP U20 5′ACAGCCCCCA 7 4 3.5 57.1
OPQ04 5′AGTGCGCTGA 23 16 8.5 69.6
OPJ07 5′CCTCTCGACA 12 6 6.0 50.0
OPV07 5′GAAGCCAGCC 15 8 5.0 53.3
Total bands 258 186
品种名编号同表 1　No.of the 46 samples are th e same as Table 1
图 1　引物 OPB12 对 46 个葡萄基因型扩增产物的琼脂糖电泳
Fig.1　RAPD fingerprints amplified by primer OPB12 in 46 grape genotypes
·156· 西　北　农　业　学　报　　　　　　　　　　　　　　　　　　19 卷
2.2　聚类分析
将 RAPD 扩增条带按 1.4 方法处理 , 用
S TA TIS TICA 绘制 47 份葡萄材料树状图(图
2)。聚类分析结果表明 ,欧洲葡萄 、欧美葡萄杂
种 、河岸葡萄与中国野葡萄亲缘关系较远 。在中
国野葡萄中 ,山葡萄与其他种亲缘关系较远 ,刺葡
萄次之 。按图 2可把 47份材料聚为 6类 。Pulli-
a t和 Beaumont同属河岸葡萄 ,聚在第一类。匈
牙利选育的 Berlandie r-riparia 株系 SO4 与山葡
萄株系通化-3 分别聚在第二类和第三类。第四
类是 6类中最大的一类 ,包括京超 、蜜红 、巨峰 、先
索 、龙眼 、佳利酿 、赤霞珠 、梅鹿特 、凤凰-51 、品丽
珠 、爱格丽 、先峰 、高墨 、富士 、早生高墨 、玫瑰香 、
乍那 、红地球 、瑞必尔 、白玉霓和雷司令 。第五类
包括刺葡萄的株系略阳-4 、宁强-6 、塘尾 、雪峰和
蘡薁葡萄株系泰山-1。第六类包括毛葡萄商-24 、
83-4-94 、83-4-96 、泰山-12 以及复叶葡萄宁固-1 、
桑叶葡萄 、留坝-7 、白河-40 、江西-1 、平利-7 、留坝-
11 、留坝-8 、江西-2 、安林-2 、秦岭葡萄 、广西-1 和
商南-1。
品种名编号同表 1　No.of samples are the same as Table 1
图 2　47个葡萄品种的 RAPD 聚类分析树状图
Fig.2　Tree diagram of 47 cultivars based on RAPD marker
3　讨论
RAPD作为一种简便 、快速 、安全和高灵敏度
的分子标记 ,已广泛应用于葡萄种间以及种内品
种间的遗传多样性和亲缘关系分析 ,并得到较好
结果 。Lourei ro 等[ 10] 对来自 18 个不同地区的欧
洲葡萄 Albarino ,4 个与 Albarino 有亲缘关系的
品种 ,2 个错误命名的品种 ,用 20 个 RAPD引物
和 6个微卫星位点进行分析 ,结果证明了这些异
名的品种都是 Albarino 。Qu等[ 11]用 RA PD分析
·157·3 期　　　　　　　　　　　　侯鸿敏等:葡萄属植物种质资源遗传多样性的 RAPD 分析
了圆叶葡萄和美洲河岸葡萄的遗传多样性 ,结果
表明圆叶葡萄与河岸葡萄 、欧洲葡萄的亲缘关系
较远 。吴红等[ 12] 对部分葡萄品种进行 RAPD分
析 ,认为葡萄品种间遗传一致度与品种的遗传背
景有关。在本研究中 ,利用 RAPD技术对葡萄的
47个品种进行遗传多样性分析 ,检测到的葡萄种
质多态性百分率都在 50%以上 , 最高达到了
83.3%,说明葡萄种质具有较丰富的遗传多样性。
在聚类分析中 ,把两个样品聚为一类的依据
有两种 ,样品间的相似性系数和样品间的距离。
本研究利用 RAPD标记对 47份葡萄品种进行了
分析 ,并绘制了亲缘关系树形图 ,从图上可以清晰
看到各品种间的遗传差距和亲缘关系。聚类分析
结果表明 ,欧洲葡萄 、欧美葡萄杂种 、河岸葡萄与
中国野葡萄亲缘关系较远 ,这与牛立新 、贺普超[ 3]
用性状分类的研究结果相一致 。在中国野葡萄
中 ,晁无疾[ 1] 根据同工酶研究认为毛葡萄是中国
葡萄属植物中比较古老的类型 ,其他种分化形成
时间相对较晚 ,牛立新[ 3]的研究结果认为 ,菱叶葡
萄与其他种类关系最远 ,而本研究结果表明 ,山葡
萄与其他种亲缘关系较远。但是从牛立新[ 3] 、张
立平[ 7] 及本研究结果分析认为 ,毛葡萄为古老类
型的观点值得商榷 。关于中国野生葡萄进化 、起
源及其古老的类型拟需综合性状特征 、分子标记
等手段进一步研究 ,为葡萄育种工作提供更系统
更科学的分类资料。
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