全 文 ：9 9 4 1年第 3 期 生物学杂志 总第 59 期
ǎ中山大学生物工程心à
口张添元李文清
ǎ中山大学生物亲)
口王艇罗进贤
王红革张达宏
限制澎费蔚口蓄研炭含墓冕覆瞥篡产因绷一
摘要 采用不连续蔗糖梯度离心法分
万, J提 取 白 兰 ( M i e h e l i a a lb a D C . ) 和 含 笑
( M i
e h e li a f i g o s p r e n g
.
) 叶 绿 体 D N A 。 经
B a m H I畴切后 , 白兰 和含笑分别产生 21 和 25
个片段 , 其中白兰 的各晦切片段在含笑的限制
酶图谱对应位五均观察到 , 白兰和含笑叶绿体
基 因组大小分另!1为 1 3 9 . 7 4 和 1 4 3 . 1 8 k b 。 两基
因组 间的遗传距 离为 0 . 0 29 。 叶绿体 D N A 限
制酶晦切 分析可 以在分子水 平上讨论植物间
的来统 关来 。
关键词 : 叶绿体基因组 限制性内切核酸
酶 限制位点变异 含 笑属
叶绿体是植物进行光 合作用的细胞器 ,具
有独立复制的遗传物质 , 叶绿体基因组的遗传
方式和进化方式均有别于核基因组 「’ l 。 有花植
物叶绿体 D N A 的长度一般为 1 20 一 2 1 k7 b 之
间 , 为闭合环状的双链结构 。 叶绿体 D N A 分
子一般可以分为四个 区域 : 大单考 贝区 、 小单
考贝区和两个反向重复区 。两个反向重复区分
别把大 、 小单考贝区间隔开 ` ’ 。 除少数植物大
l 8
单考贝区因插入而导致基因的组织方式变异
外 , 叶绿体 D N A 的结构通常都比较保守 。 另
外 ,叶绿体 D N A 序列的进化速率也不高 。 据
估计 , 同义替换率每百万年仅为 0 . 1% 〔 3二。 叶
绿体基因组结构和序列的稳定性有利于近缘
种属植物的限制位点变异性分析 。
限制性 内切核酸酶 (简称限制酶 ) 能识别
和剪切双链 D N A 分子 由 4 、 5 或 6 个核昔酸
组成的限制位点 。 如果在限制位点内发生碱基
替换 , D N A 分子经过酶解后产生的酶切片段
的数目和长度就必然产生差异 。根据限制位点
变异数据能够算出同源 D N A 分 子间的遗传
距离从而反映出植物间的系统和进化关系 。有
花植物的 叶绿体 D N A 分子经限制酶处理后
产生出的限制片段借助琼脂糖凝胶 电泳即可
得到分离 , 因此对植物的叶绿体 D N A 分子进
行限制酶分析 已经成为在分子水平上研究植
物系统和进化间题的重要方法之一 ’ ` 。
我们 比较含笑属植物白兰 ( M IC h e l i a a l b a
D C
.
)
、含笑 ( M ie h e li a f i g o S p r e n g . )叶绿体基
因组限制位点变异性 ,试图将这项分子生物学
技术应用于植物系统学的研究领域 。
材料和方法
1
. 实验材料
白兰 (M ie h e l i a a l b a D C . )和含笑 (M IC h e -
一i a f i g 。 s p r e n g . ) 的叶片均采 自中山大学校园
内自然光下生长的植物 。
2
. 叶绿体的初步分离
10 馆 植物叶片饥饿 3 至 4 天后在自来水
中加入洗洁剂洗涤 , 自来水洗多遍 , 蒸馏水洗
3 遍 ,重蒸水洗一遍 。 拭干叶片 . 剪去中脉 , 叶
片剪成 1一 cZ m Z 大小 ,置于预冷的匀浆器内 。
倒入 s o o m l 预冷的缓冲液 A ( s o m m o l / 1 T r i S 、
2 5m m o l / 1 E D T A
、
0
,
3 5 m o l / l 蔗 糖 、 s m nt o l / l
琉 基 乙醇 、 0 . 25 m ol I/ 抗坏 血酸 、 0 . 1% B S A ,
p H 3
.
6 )
,
1 2 0 0 o r p m 匀 浆 3 次 , 各 4 秒 ,
18 0 0 0印 m 匀浆 3 至 4 次 , 各 5 秒 ,匀浆液四层
纱布过滤 , 一层细布过滤 。过滤时搅动 、 轻度绞
19 9 4 年第 3 期 生物学 杂志 总第 59 期
挤 。 l 0 0 0r p m 离 心 5 分 钟 , 收 集 上 清 液
35 0 印m 离心 10 分钟 , 沉淀悬浮于少量缓冲
液 A , 再次 3 5 0 0 r p m 离心 1 0 分钟 , 沉淀用 s m l
缓冲液 A 充分悬浮 。
3
. 叶绿体的纯化
制备缓冲液 B ( s o m m o l / 1 T r i s 、 2 5m m o l / l
E D T A
、
p H S
.
o )配 制的 6 7% 、 4 5% 、 2 0%蔗糖
梯度 ,冰浴中放置 30 分钟 ,铺上叶绿体悬液 ,
s 0 0 0 r p m 离心 4 0 分钟 ,吸取 4 5%与 6 7%蔗糖
溶液界面上的绿 色层带至消毒的离心管内 , 加
入 3 倍体积的缓冲液 B 充分混匀后 7 0 o o r p m
离心 10 分钟 ,弃上清 液 ,重 复三次 ,倒置离心
管尽量除尽上清液 。
4
. 叶绿体 D N A 的提取
叶绿体沉淀悬浮于 Zm l 缓冲液 B 中 , 加
入用缓冲液 B 配制的 10 %月桂酞肌氨酸钠溶
液 l m l , 室温下放置 10 到 20 分钟 , 加入蛋白
酶 k ( s rn g / m l ) 6 o u l , 3 7 C 保温 4 小时 。 等体积
饱和酚抽提 2 次 ,酚— 氯仿一一异戊醇抽提
2 次 。 上清液中加入 1 / 1 0 体积 3M 醋酸钠溶
液 , 2 倍体积 无 水 乙醇 , 一 20 ℃放 置 过夜 。
5 0 o or pm 离心 20 分钟收集沉淀 , 沉淀角 70 %
乙醇洗涤 2 次 ,真空抽干 ,溶于 S Ou0 IT E 缓冲
液中 , 加入 R N a s e ( s m g / m l ) s u l , 3 7 ,C保温 3 0
分钟 ,再加入蛋白酶 k ( s m g /m l ) 1 2 u l , 继续保
温 1 小时 ,酚抽提 2 次 ,氯仿抽提 1 次 , 乙醇沉
淀 , 一 2 。℃放置过夜 , 离心收集沉淀 ,沉淀溶于
3 5 u l T E 缓冲液 。
5
. 叶绿体 D N A 限制酶酶切分析
酶 切 反 应 总 体积 为 3 u0 l , 其 中叶绿体
D N A uZ g
,
10 倍浓度 酶缓冲液 u3 l , 限制酶 9
单位 , 37 ℃反应 4一 5 小时 。 琼脂糖凝胶 3 v /。 m
电泳 7 小时 , 电 泳缓 冲液 为 T A E ( 4 o rn m o l / 1
T r i S 一 乙酸 , p H S . 0 , Zm m o l / 1 E D T A 一 N a : ) 。
E B 溶液染色 3。 分钟 ,紫外灯下透过红色滤镜
照相 。
6
. 叶绿体 D N A 限制片段 长度和分子量
的估算
按照 E . M . S o u t h e r n 的方法 〔 5 ,进行 。
7
. 叶绿体 D N A 分子间遗传距离的求算
按照 W . B . I J p h ol t 一 6、的方法运算 。
结果
1
. 叶绿体经不连续蔗糖梯度离心方法纯
化
纯化叶绿体是 在提取 叶绿体 D N A 过程
中非常重要的步骤 。按照我们使用的不连续蔗
糖梯度离心 , 可以得到清晰的叶绿体区带 ( 图
1 )
。在光学显微镜下观察 , 纯度 合乎要求 , 叶绿
体呈棱形 、 类 圆形 ,结构完整 。
2
. 叶绿体 D N A 限制酶酶切分析结果
从 白兰和含笑两种植物每 l 。鲍 叶片可以
提取到叶绿体 D N A 约 7。。 g 。 叶绿体 D N A 用
B a m H I完全酶切后 , 用· 1 . 2 %琼脂糖凝胶电泳
分离 ,结果见 ( 图 2 ) 。 根据紫外灯下观察到芡
光强度差别 ,判断有几条片段为多考贝或具同
等长度的片段 。 用已知大小的 入D N A 的 iH n d
l 酶切片段作为标准 ,按照 E ` M . S o u t h e m 的
方法估算叶绿体 D N A 分子经限制酶酶切 后
的各 片段长度及叶绿体 D N A 的分 一 F量 ,
图 1 . 不连续蔗糖梯度离心
图 2 . 叶绿体 D N A 限制性内 切酶酶 切图谱
A
. 入一 D N A H i n d , 的酶 切片段分 子量标准 ;
B
. 白兰 叶绿体 D V A 的 B盯 n H I酶 切片段 ;
C
. 含笑叶绿 体 D N A 的 B、 ` n 1 H I酶 切片段 。
1 9 94 年第 3 期 生物学 杂志 总第 5 9期
表 l 白兰和 含笑 叶绿体 N DA B a m H I带型片段 比较 `
片 段 白 兰
2 6
.
4 4
1 7
.
7( 2 7)
1 1
.
3 8
8
.
8 8
7
.
4 0( 2)
}: {{
总 和 13 9. 74
含
2 6
.
4 4
1 7
.
7 7( 2)
1 1
.
3 8
8
.
8 8
7
.
4 0( 2)
6
.
3 6
5
.
8 3
4
.
5 7
4
.
24
3
.
5 7
3
.
06
2
.
8 7
2
.
5 9
2
.
2 7
2
.
09
1
.
8 0
1
.
74
1
.
3 1
1
.
1 8
1
.
07
0
.
8 1
0
.
69
0
.
63
1 4 3
.
1 8
, 片段长度单位为千碱基对 k( b ) ,括号中数字表示 迁移
率相同的片段数 。
结果见表 1 。 白兰和含笑分别产生 出 19 种和
2 3 种酶切片段 , 其中 一7 . 7 7 k b 和 7 . o 4 k b 的片
段两种植物都具有两条同等长度的片段 。 将所
有酶切片段 累加得到的就是叶绿体 D N A 的
分子量 。 白兰和含笑叶绿体 D N A 的分子量分
别为 1 3 9 . 7 4k b 和 14 3 . 1 8 k b 。
叶绿体 D N A 完全酶切后 , 白兰和含笑的
B a m H I 酶切片段数分别是 21 和 25 。 白兰叶绿
体 D N A 的 21 条酶切片段在含笑的限制酶酶
切结果中均有出现 ,然而含笑具有的 1 . 3 k1 b 、
o
·
8 1k b
、
0
.
6 9 k b 及 0 . 6 3k b 片段在白兰 中未曾
观察到 。 按照 W . B . U p h ol t 的方法 , 我们计算
出白兰和含笑叶绿体基因组之间的遗 传距离
P 的值为 0 . 0 2 9 。
讨 论
目前报道的叶绿体 D N A 提取方法 中 , 实
验材料主要是温室培育幼苗的叶片或原生质
体 。 进行植物 系统学研究时 ,叶绿体 D N A 的
提取材料一般取 自自然光下生长的植物 叶片 。
这些叶片可能会含有较多的多糖 、 草酸钙 以及
酚类物质干扰提取过程 。把 叶片放置子黑暗处
饥饿 3 到 4 天可以减少叶绿体 内淀粉的含量 。
提高匀浆缓冲液中 E D T A 的浓度利于染
色质解离 ,还可以抑制线粒体对提取过程的影
响 。 低 p H 值能够弱化 D N A 、组蛋白和叶绿体
膜间的相互作用 , 降低核 D N A 污染 。 抗坏血
酸的作用是减低匀浆时需要的机械力度 ,保证
叶绿体膜完整 。 牛血清白蛋 白 ( B S A )可以避免
叶绿体簇集 。
不连续蔗糖梯度离心是纯化叶绿体有效
的方法 ,能够很好地把叶绿体同细胞核等分离
开 。 我们也曾应用高离子强度介质提取白兰和
含笑 的叶绿体 D N A ,但是未能理想地解决核
D N A 污染问题 。
含笑和白兰的叶绿体基 因组分别为 1 39 .
7 4 k b 和 一4 3一 s k b , 两者大 小近似 , 在分子长
度上属于 比较典型的有花植物 叶绿体 D N A
类型 。
亲缘关系较远的植物 ,例如不同纲 、亚纲
或 目间的植物 ,它们叶绿体 D N A 分子的限制
图谱共性甚少 。 然而 , 同科的植物间就开始显
现出相似性 ,属 内植物 间具有明显的相似性 。
比较含笑属植物 白兰和含笑叶绿体 D N A 的
B a m H I 酶切图谱 , 两者共有的相同酶切片段
为 21 条 , 表现出很高的同源性 。 烟草属 ( iN c 。 -
t i a n a )
、 月见草属 ( O e n o t h e r a ) 、 番茄属 ( L y e o p -
e r s i e o : 1 )
、 茄属 ( S o la n u m ) 、 芸苔属 ( B r a s s i e a ) 、
亚 麻属 ( L i n u m ) 、 狼尾草属 ( p e n n i s e y u m ) 、 山
羊草属 ( A ge il o sP )等属植物的研究都表明 ,植
物间叶绿体 D N A 限制位点变异性 可以表征
亲缘关系的远近 ,从而建立起一种在分子水平
上的分类方法 。
同线粒体和核 D N A 相 比叶绿体 D N A 在
进化上比较保守 , 白兰和含笑叶绿体基因组间
的遗传距离是 0 . 0 2 9 。 . 与灵长类动物的线粒体
基因组比较 , 含笑属植物叶绿体基因组的进化
速率要慢 10 倍 。 滨黎属 ( A tr i p lex )的研 究还
表明叶绿体基因组的进化速率也比单考贝的
核 D N A 为慢 。 叶绿体基因组进化慢的原因可
能是 D N A 碱基替换率低 “ 。
考虑到叶绿体 D N A 的保守性和 白兰与
含笑是同属植物亲 缘 关 系 较 近 , 我 们选 择
( 下转 第 2 5 页 )
,l,曰nJJ任
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19 9 4年第 3 期 生物学 杂志 总第 9 5期
2
.中药对 实验性 糖 尿病 小 鼠血 浆 中
M M S 含量的影响 。 由表 2可见 ,糖尿病模 型
组血浆中 M M S 含量明显升高 , 中药组均能降
低实验性糖尿病小鼠血浆中 M M S 含量 ,与四
氧嗜咤组相 比 ,均有显著性差异 。
表 2 ,降枪饮对实验性抽尿 病小鼠血浆中 M M S 含里影 响 `
士 S D )
组别 例数 M M S ( 。 /d l )
正常空白对照 1 0 16 8士 2 4 . 3
四氧啥 陡 l 0 2 54士 2 3 . 4 △
四氧啥 咤+ 降搪饮 l 0 1 7 5士 3 (、 . 4 关
四氧啥 咤十消渴丸 l 0 1 7 8士 2 3 . 2 朴
△ 与正常空白对照组相 比 p < 0 . 01 , , 与 四氧啼陡组相
比 p ( 0 . 0 1
讨论
目前关于中分子物质的化学本质 尚未完
全阐明 , 但在尿毒症时为一类多肤混合物已得
到肯定 , 并证实了肝性昏迷和急性烧伤毒血症
等疾病血中 M M S 含量增高 ,而随着疾病的治
疗和好转 , 血中 M M S 含量恢复或趋于正常 。
虽然有关尿毒症中分子肤与胰岛素形成牢固
的复合物 , 改变胰岛素的化学性质 , 从而使得
它很难或不能与特异的细胞受体结合 , 以及关
于伴有多发性神经病变的尿毒症患者经清除
中分子物质后 , 神经病变而获得改善报道 L` ) 。
然而有关糖尿病血浆 M M S 堆积的机理仍不
清楚 。 本文结果表明 , 降糖饮中药使实验性糖
尿病小 鼠血中 M M S 含量下降 ,提示糖尿病小
鼠血浆 M M S 含量的增加可能是糖尿病引起
各种并发症所致川 。
糖尿病在祖国医学中属于消渴症 ,临床辨
证较为复杂 ,通常从肾虚 ,肺燥立论 , 降糖饮中
药组方既重用健脾养阴 , 又具活血化疲和酸敛
固涩之用 。 从本实验结果来看 ,该中药对糖尿
病小鼠的血糖和 M M S 含量明显下降 ,与病理
模型组相 比 , 具有 显著性差异 ( p < 0 . 01 ) 。 上
述实验结果 ,我们推测该中药可以促使未被损
伤的胰岛 p细胞分泌胰岛素增加 ,使糖尿病症
状得以改善 , 致血糖和 M M S 含量降低 。 对于
糖尿病小 鼠血浆 中的 M M S 积聚机理 , 以及中
药降低 M M S 和血糖的可能机理 尚有待进 一
步的研究和探讨 。
参考文献
1
.
B
奋,
b龟) A . L , e t a l : T r a n s A m S o e A r r i f I n t e r n
o
r g a n s 1 8 : 9 8
,
19 7 2
2
. 王铁丹 , 《广东生化通 讯 》 , 6 ( 1 . 2 ) : 1 5 1 9 8 9
3
. 杜翠芬等 , 《广州医药 》 , 5 : 3 0 , 1 9 8 7
4
. 张龙 云等 , 《蚌埠医学院学报 》 , 2 : 47 1 9 8。
r a卜 r ! l a n 几 1 1 1在I t 宝 J la飞 , 〔,p江 e 刁 10
6
.
K e
s
h v i c h e t a l
:
S e m
l n N e p b r o l
19 8 4
3 ( 4 ) 2 9 5 19 8 3
(上接 第 20 页 )
B a m H I 酶处理叶绿体 D N A 。 因为 B a m H I 限
制酶在叶绿体 D N A 上的识别位点多 ,增加了
观察到叶绿体 D N A 分子间差异的可能性 。
参考文献
[ 1 ] L
e
h v a
s
l a ih o H
,
S a u r a A
,
L o k k i J
.
C h l o
r o p l
a s t D N A
v a r i a t i o n i n t卜e g r a s , t r ib e F e s r u c e a e . T he o r A p p l G e n e t
1 9 8 7
:
74
:
2 9 8一 3 0 2
仁2〕oD o b l o y J , R e o f r o e W , B ; a n t o n A . R e 、 t r l以 i o n s i t e
v a r i企, t i o n i n t h e Z e 老1 e h l o r o P la s t g e n o rn e
.
G e n
e t l e s 1 9 8 7
: 11 7 :
1 39一 14 7
仁3〕Z u r a w 、 k i G . C l o g g M T , B r o w n A H D . T , , e n a t u r e
o f
n u (·
l
e o t i (」e s e q t j e n e e be t w e e n 卜a r l e y a n d m a i沈 e h l o r o p l a s t
D N A
.
G e n e t i
e s 1 9 84 : 10 6
: 7 3 5一 74 9
[ 4 J P
: , lm
e r
J D
,
Z :
L
m i
r
D
.
C h l o r o p l
a s t D N A e v o l u r io n
a n d p 卜y l o g 护 n e t一e r e l a t i o n s l l i p s i n L y y e o p e r s i e o n . P r o e N a t l
A ( a d S e
t
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仁5 ] 5 0 、 , : }、 e r n E M . M e a s o r e m o n t o f D N A Ie n g t l l l〕y g e l
e l护 c r r o p h o r e s i s
.
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: l 〔) o : 3 1 9一 3 23
[ 6〕B r o w n W M . G o o r g e M , W IIs o n A C . R a p id e v o l u -
r i o n o f a n i rn
奈t
l m i t o c !
一o r z d r i a l D N A
.
P
r o e N
是l t l A e a d 反 一 U S A
1 9 7 9
: 7 6 : 1 9 6 7一 19 7 1