全 文 ：中国农业科学　 2000, 33( 2): 98～ 100
Scientia Ag ricultura Sinica
原生质体电融合再生柑橘属间
四倍体体细胞杂种⒇
刘继红 ,邓秀新
(华中农业大学作物遗传改良国家重点实验室 ,武汉　 430070)
Production of Tetraploid Intergeneric Somatic
Hybrid Plants Via Protoplast Electrofusion in Citrus
Liu Jihong , Deng Xiux in
(N ational Key Laboratory of Crop Genetic Improvements,
Huaz hong Agricultural University , Wuhan　430070)
Abstract: M esophyl l protoplasts of Chang shou kumqua t ( Fortunel la obovata ) w ere
fused elect rically wi th embryogenic pro toplasts of Dancy tangerine ( Citrus ret iculata ) .
Plants w ere obtained a fter cul ture o f the fusion-trea ted protoplasts. Cytological
ex aminations show ed tha t the plants w ere tetraploids wi th 36 chromosomes. RAPD
analysis indicated that the plants had bands speci fic to the fusion partners in the primers
( O PA-04 and O PA-07 ) chosen fo r v erifying hybridi ty of the plants. The results
demonst rated that tet raploid intergeneric somatic hybrid plants have been recovered by
fusion o f pro toplasts betw een kumquat and cit rus.
Key words: Fortunella obovata ; Cit rus; Protoplast; Electrofusion; Soma tic hybrids
关键词: 金柑 ;柑橘 ;原生质体 ;电融合 ;体细胞杂种
中图分类号: S666; Q343　文献标识码: A　文章编号: 0578-1752( 2000) 02-0098-03
自 Ohgawa ra等 ( 1985)得到枳与 Trovi ta甜橙属间体细胞杂种植株近 15年来 ,已得到
了约 150例柑橘体细胞杂种〔 3〕 ,其中有种、属间有性和嫁接亲和的组合 ,也有有性和嫁接均
不亲和的属间、族间组合。这些体细胞杂种的获得 ,丰富了柑橘的种质资源库 ,为育种提供了
可供选择和利用的新型试材。本文报道的是最近获得的一例金柑与柑橘属间体细胞杂种。
1　材料与方法
1. 1　材料
丹西红橘 ( Citrus reticulata )愈伤组织悬浮系继代 3次后 ,于第 7～ 10天时取愈伤组织
收稿日期: 1999-07-23
基金项目:国家自然科学基金资助项目 ( 39625017)
作者简介:刘继红 ( 1971-) ,男 ,湖北罗田人 ,讲师 ,博士 ,从事生物技术教学与科研工作。
分离原生质体 ;长寿金柑 ( Fortunella obovata )种子播种于 M T基本培养基 (含 30g /L蔗糖
和 0. 7%琼脂 )中 ,播种后 20～ 30d左右取充分展开的叶片分离叶肉原生质体。
1. 2　方法
吸取 1g左右愈伤组织放入 15mm× 60mm培养皿中 ,加入 1. 5ml酶液 ( 1%纤维素酶
Onozuka R-10+ 2%果胶酶 Serv a+ 12. 8%甘露醇+ 0. 12% MES+ 0. 36% CaCl2 , pH5. 6,过
滤灭菌 )和等体积的 0. 7mo l /L EME培养基〔MT+ 0. 5g /L麦芽提取物 ( M E) + 240g /L蔗
糖〕 , 28℃放在低速 ( 26r /min)摇床上酶解 20h。 将叶片切成 1～ 2mm宽的小条后放入 25ml
三角瓶中 ,酶液组成及酶解条件同愈伤组织。原生质体纯化方法参照 Grosser等〔4〕的方法。
融合方式为电场诱导融合 , AC为 75V /cm ,作用时间 60s; DC为 1250V /cm , 5次脉冲 ,
间隔时间 1s。采用液体浅层培养方法培养原生质体。待细胞团长到肉眼可见时 ,转入 EM E500
培养基 ( M T+ 500mg /L M E+ 50g /L蔗糖+ 0. 7%琼脂 ) ,长出的胚状体转入 EME1500培养
基 ( M T+ 1500mg /L M E+ 50g /L蔗糖+ 0. 7%琼脂 ) ,生芽培养基为 M T+ 0. 1mg /L N AA
+ 0. 5mg /L BA+ 0. 5mg /L K T + 25g /L蔗糖+ 0. 7%琼脂。生根培养基为 1 /2M T +
0. 1 mg /L IBA+ 0. 5 mg /L N AA+ 0. 5 g /L活性炭+ 25g /L蔗糖+ 0. 7%琼脂。再生植株
染色体检查、 DNA提取、 PCR扩增和电泳检测与以前的报道相同〔 1〕。
2　结果与分析
2. 1　融合再生植株
电场诱导的原生质体融合产物培养到第 7～ 10天时 ,原生质体恢复第 1次分裂 ,随着培
养过程的进行 ,分裂的细胞不断增多 ,第 20天时能观察到多细胞团 ,此时应及时加入新鲜培
养基 ,以降低培养液的渗透压。 30d左右就能出现肉眼可见的小愈伤组织。 待其长到 1～
2mm大小时 ,转至 EM E500培养基。 30d左右长出绿色胚状体 ,胚状体转至 EM E1500培养基后
迅速长大 ,将长到子叶期的胚状体转入生芽培养基 ,切下再生出的丛芽转入生根培养基 , 20
～ 30d就可以长出根 ,得到完整植株 (图版-1)。本组合得到近 20棵再生植株 ,目前均已移入
温室 ,生长良好。再生植株叶片长椭圆形 ,形状与长寿金柑相似 ,但叶尖形状与丹西红橘相
似 ,表现出杂种的特点 ,叶片具有翼叶 (图版 -5)。
2. 2　再生植株的倍性分析
从再生植株中选取 4棵进行染色体检查 ,结果表明它们都具有 36条染色体 (图版-2) ,
是四倍体 ( 2n= 4x= 36)植株。
2. 3　再生植株杂种特性分析
根据本室以往的研究结果 ,挑选 2个 10-mer随机引物 ( OPA-04和 O PA-07)对已完成
倍性检查的 2棵植株进行杂种特性分析。 2个引物都能将长寿金柑和丹西红橘区分开 ,从引
物 O PA-04的扩增带型图中可以看出 , 2棵植株都具有双亲的特征带 ,其带型为双亲之和
(图版 -3) ,表明这 2棵植株具有融合亲本的遗传物质 ,为杂种起源 ;它们的杂种特性为引物
O PA-07的扩增带型进一步证实 ,在其扩增带型图中 , 2棵植株也都具有双亲的特征带 (图版
-4) ,但丹西红橘有 2条特征带在再生植株中未出现。
结合细胞学和 RAPD分析的结果 ,可以看出所分析的 2棵植株是长寿金柑和丹西红橘
的属间四倍体体细胞杂种。
992期 刘继红等: 原生质体电融合再生柑橘属间四倍体体细胞杂种
3　讨论
长寿金柑具有多胚特性 ,丹西红橘也是高度多胚品种 ,由于无性胚的干扰 ,通过有性杂
交很难得到二者间真正的杂种。 本研究通过原生质体融合技术成功地获得它们的体细胞杂
种 ,进一步说明体细胞杂交在柑橘遗传改良上具有很大的应用潜力。柑橘异源四倍体体细胞
杂种在育种上的应用之一是作为父本用于倍性育种 ,与单胚二倍体品种杂交 ,以培育三倍体
无籽品种〔5〕。 本研究获得的异源四倍体体细胞杂种为这一工作的开展提供了可供选择和利
用的父本材料。
RPAD标记是鉴定体细胞杂种的有效手段 ,本研究应用此技术也成功地鉴定了融合再
生植株的杂种特性。在所试用的 2个引物中 ,再生植株之间带型一致 ,基本上都是双亲之和 ,
只在 O PA-07引物中有一定的区别 ,这一现象在以往也已有所报道 ,可能是杂种植株中亲本
基因组 DNA发生重组 ,使与引物结合的位点发生变化所致〔2〕。
参考文献:
〔 1〕　刘继红 , 胡春根 , 邓秀新 . 澳洲指橘与柑橘属间原生质体电融合再生二倍体体细胞杂种 (英文 )〔 J〕 . 植物学报 .
1999, 41( 11): 1177～ 1182.
〔2〕　李文彬 ,梁红健 ,孙勇如 , 等 . RAPD鉴定栽培稻与野生稻体细胞杂种〔 J〕.生物工程学报 . 1996, 12( 4): 390～ 393.
〔3〕　 Gros ser J W , Mourao-Fo F A A, Gmi t ter F G Jr, et al. Allo tet raploid h ybrids b etw een cit rus and seven related
g enera produced by somatic h ybridi zation〔 J〕 . Th eor. Appl. Genet. 1996, 92: 577～ 582.
〔4〕　 Gros ser J W , Gmi t ter F G Jr. Pro toplas t fusion and ci t rus improvemen t〔 J〕. Plant Breed Rev. 1990, 8: 339～ 374.
〔5〕　 Oiyama I, Kobayashi S, Yoshinaga K, et al. Use of pollen f rom a somatic h ybrid betw eenCitrus andPoncirus in the
production of t riploid〔 J〕 . Hort Sci. 1991, 26( 8): 1082.
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100 中　国　农　业　科　学 33卷