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胡枝子属植物40个野生居群种子蛋白谱带多样性研究



全 文 :58  草 业 科 学 24卷 5期
5 /2007 PRAT ACULT URA L SCIENCE Vol. 24 , No. 5
种子科技
胡枝子属植物 40个野生居群  
种子蛋白谱带多样性研究  
闫伟红1 ,徐 柱2 ,师文贵2 ,李临杭2 ,马玉宝2
(1. 中国农业科学院研究生院 ,北京 100081;2. 中国农业科学院草原研究所 ,内蒙古 呼和浩特 010010)
摘要:利用 SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳技术 , 对采自内蒙古 、河北 、山西 、宁夏和甘肃 5 个省 3 种 2 变种的 40
个胡枝子属植物野生居群种子蛋白进行遗传多样性研究。结果获得 32 条谱带 ,有 4 条谱带为稳定表达带 ,
其余 28 条谱带均有不同程度的多态性 , 多态率 90. 6%,分子量 108. 1 ~ 10. 3 kDa , 各居群间遗传相似系数变
异范围为 0. 42 ~ 1. 00 ,遗传变异较大 , 多态性较高。遗传相似系数为 0. 581 时聚为 4 类:第Ⅰ 类包括二色胡
枝子 Lespedeza bicolor 的 3 个居群;第Ⅱ类包括 23 个居群 ,即牛枝子 L. potaninii的 11 个居群和达乌里胡
枝子 L. davurica 的 12 个居群;第Ⅲ类包括牛枝子的 2个居群;第Ⅳ类包括尖叶胡枝子 L. hedy saroides的 4
个居群和细叶胡枝子 L. hedy saroides va r. subsericea 的 8个居群。其中第Ⅲ类的牛枝子2 个居群单聚一类 ,
表明与其它牛枝子居群遗传差异大。从种的水平看 ,绝大部分来自于相同或相似的地理生态环境的居群聚
为一类。达乌里胡枝子与牛枝子亲缘关系较近 , 尖叶胡枝子与细叶胡枝子亲缘关系较近 , 这与形态学鉴定
结果相一致。由此认为 ,胡枝子属植物是种间 、种内具有丰富的蛋白质多态性的种群 , 可作为研究种内变异
和生态型的重要依据。
关键词:胡枝子属;种子蛋白;多样性;野生居群
中图分类号:S541+. 501   文献标识码:A   文章编号:1001-0629(2007)05-0058-06
* 蛋白质作为基因的直接稳定产物 ,能反映生
物 DNA 组成上的差异[ 1] 。种子蛋白作为一种遗
传标记越来越多地应用于植物种质资源研究中 ,
同时利用种子蛋白分析也是估计当地植物居群遗
传多样性的有效方法之一 。由于种子蛋白是植物
体中一类有高强度表达 ,且能在种子内积累到很
大量而不降解的蛋白质 ,其电泳谱带具有高度稳
定性 、专一性和叠加性。因此 ,种子蛋白作为遗传
标记被广泛用于种 、属间关系 ,种间或种内遗传多
样性分析 ,品种鉴定及物种起源的研究[ 1-3] 。
胡枝子属植物为灌木 、半灌木或草本植物 ,我
国约 26种 。多数具有耐干旱 、耐贫瘠 、耐寒冷 、耐
热 、耐酸 、耐刈割等优良特性 ,是荒山荒地造林的
先锋树种 ,可用于饲料 、水土保持和土壤改良 、蜜
源植物和药用。胡枝子属植物在我国大部分地区
都有分布 ,其野生种质资源丰富 ,近几年该属植物
的开发利用受到人们的重视[ 4-7] 。试验采用 SDS
聚丙烯酰胺凝胶电泳法对 3种 2变种的 40个胡
枝子居群野生种子蛋白进行分析 ,旨在从生化水
平上探讨其遗传多样性 ,初步明确不同种间以及
种内不同居群间的遗传差异 ,为胡枝子属植物种
质资源开发利用提供依据 。
1 材料与方法
1. 1 供试材料 供试植物来源见表 1。材料于
2001和 2002年采集。试验全部用的是采自原生
存环境的种子 。此试验包括 3种 2变种 ,40个居
群 ,二色胡枝子 Lespedeza bicolor 3个居群 ,尖叶
胡枝子 L. hed ysaroides 4 个居群 , 细叶胡枝子
L. hedy saroides var. subsericea 8个居群 ,牛枝子
13个居群 ,达乌里胡枝子 L. davurica 12个居群。
种子于 2002年和 2003年在中国农业科学院草原
所呼和浩特市沙尔沁试验场种植 , 2005年和 2006
年采集标本并进行鉴定。运用数量分类学和传统
形态学结合的方法。
* 收稿日期:2006-11-13
基金项目:国家重点基础研究发展计划(973)生态系统
服务功能与生态 - 生产功能区优化布局
(G2007CB106806)
作者简介:闫伟红(1979-), 女 , 内蒙古赤峰人 , 在读硕士
生。E m ail:yanw eihong7037@yah oo. com. cn
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表 1 供试材料胡枝子属植物来源
编号 种名 原生境 采集地点
1 二色胡枝子 林间 内蒙古通辽市科左后旗大青沟保护区
2 牛枝子 路边 内蒙古哲盟扎旗黄花山镇
3 牛枝子 丘陵区 内蒙古清水河北
4 牛枝子 沿路 内蒙古丰镇至山西大同
5 牛枝子 路边 山西浑源县境内恒山
6 二色胡枝子 山坡 山西省五台山佛母洞
7 达乌里胡枝子 山坡 内蒙古乌盟卓资县卧佛山
8 牛枝子 林下 内蒙古大青山西九峰山
9 二色胡枝子 山地 、草原 、山坡 内蒙古兴安盟阿尔山市好森沟林场
10 达乌里胡枝子 山坡 内蒙古呼盟扎兰屯吊桥公园
11 达乌里胡枝子 山坡 内蒙古呼盟海拉尔东山
12 达乌里胡枝子 林缘 、沙地 内蒙古呼盟伊敏东南玉维纳河 10 km 处
13 达乌里胡枝子 山坡 、山地 、草地 内蒙古兴安盟阿尔山市王叉沟林场东
14 牛枝子 路边 河北承德市避暑山庄
15 达乌里胡枝子 山坡 、草地 河北围场锥子山
16 尖叶胡枝子 路边 、封育 、草地 内蒙古哲盟扎鲁特旗哲北农场
17 尖叶胡枝子 山坡 内蒙古哲盟扎旗巴镇南
18 细叶胡枝子 路边 内蒙古哲盟扎旗黄花山镇
19 细叶胡枝子 山坡 、草地 河北围场锥子山
20 细叶胡枝子 山坡 内蒙古呼盟海拉尔东山
21 细叶胡枝子 林间 、杂类 、草草原 内蒙古呼盟鄂旗伊敏镇东北
22 细叶胡枝子 山地、草甸、草原、公路边 内蒙古呼盟额尔古纳市西南 20 km 处
23 细叶胡枝子 山坡 山西省五台山佛母洞
24 牛枝子 山沟 、坡地 内蒙古大青山西九峰
25 达乌里胡枝子 山坡 内蒙古哲盟扎旗巴镇南
26 达乌里胡枝子 路边 、封育 、草地 内蒙古哲盟扎鲁特旗哲北农场
27 牛枝子 山坡 河北承德市避暑山庄
28 达乌里胡枝子 山地 、草原 内蒙古锡盟蓝旗
29 牛枝子 山坡 山西原平县轩岗镇
30 细叶胡枝子 山坡 、山地 、草地 内蒙古兴安盟阿尔山市王叉沟林场东
31 细叶胡枝子 山地 、草原 、山坡 内蒙古兴安盟阿尔山市好森沟林场
32 尖叶胡枝子 林间 内蒙古通辽市科左后旗大青沟保护区
33 尖叶胡枝子 沙地 、灌丛 内蒙古通辽市科左后旗巴胡塔
34 牛枝子 路边 宁夏固原县东
35 牛枝子 路边 甘肃西峰东北
36 达乌里胡枝子 山地 山西省太原市北
37 达乌里胡枝子 山地 、草原 内蒙古伊盟万家寨
38 牛枝子 路边 山西省轩岗
39 牛枝子 公路边 山西偏关 209国道
40 达乌里胡枝子 路边 、草地 山西吉县
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1. 2 种子贮藏蛋白电泳 采用 SDS 聚丙烯酰
胺(SDS - PAGE)凝胶双板夹芯式垂直板电泳法
进行[ 8 , 9] 。凝胶板大小为 20 cm ×12. 5 cm ×0. 1
cm 。0. 1%考马斯亮蓝(R - 250)染色 10 h 左右 。
甲醇 -冰乙酸脱色 ,直到检验出清晰的蛋白质谱
带为止。将每个样品的种子去皮后 ,数 10粒种子
用钳子夹碎 ,然后将其加入蛋白质提取液(4 mL
10%SDS ,1. 2 mL 2 - ME , 2. 75 mL 甘油 ,1 g 溴
酚兰 ,1. 6 mL 1 mol /L T ris - HCl , pH 值 6. 8 ,加
双蒸水定容到 20 mL)500 μL 中 , 2 h 后 10 000
r /min离心 10 min。取上清液加等体积样品提取
液摇匀 ,以备上样 ,每个样品上样量为 15 μL。分
离胶浓度为 12%,浓缩胶浓度为 3%,分离胶缓冲
溶液为pH 值8. 8的 Tris - HCl ,浓缩胶缓冲溶液
为 pH 值 6. 8的 Tris - HCl ,电极缓冲溶液为 pH
值 8. 3的 Tris - Gly 。电泳条件为稳流不稳压 ,浓
缩胶稳流在 40 mA ,分离胶稳流在 60 mA ,电泳
5 ~ 6 h ,即指示剂距凝胶底部 1 cm 左右 ,然后测
量蛋白质迁移长度 、剥胶 、染色 、脱色 、拍照。标准
蛋白 D532S 分子量为 6. 5 ~ 200 kDa。
1. 3 数据分析 采用 SDS - PAGE 法 ,按每个
居群检出清晰蛋白质谱带出现有无进行标记 ,有
为 1 ,无为 0 ,列出 1 - 0数据阵 。依据这些排列对
不同居群的种子蛋白带利用 Jaccard 系数按不加
权成对群算术平均法(UPGMA)进行遗传相似性
聚类分析 ,统计分析在软件 NTSYS - pc 2. 1系统
下进行[ 10-13] 。再利用公式蛋白质相对迁移率=脱
色后蛋白质移动距离×染色前分离胶长 /染色前
指示剂移动距离×脱色后分离胶长 ,计算蛋白质
相对迁移率和分子量 。
2 结果与分析
2. 1居群种子蛋白带型多态性分析 经过对
40个来源于不同地区的胡枝子属植物居群种子
贮藏蛋白电泳 ,共检测到 32 条蛋白谱带 ,其中有
4条谱带为稳定表达带(均为 100%表达),其余 28
条谱带均有不同程度的多态性 ,多态性数目占分
离出总条带的 90. 6%(表 2)。所有出现谱带分子
量为 108. 1 ~ 10. 3 kDa ,点位带编码是分子量的
顺序排列 ,即分子量最大的点位带为谱带 1 ,分子
量最小的点位带为谱带 32 ,依次加以编码。32条
种子贮藏蛋白谱带又可划分为 α、β 、γ和 ω4 个
区 ,绝大多数材料在 4 个区均存在差异 ,α区(第
24至 32条)有 9条;β区(第 8至 23条)有 16条;
γ区(第 2 至 7 条)有 6 条;ω区只有 1 条(第 1
条)。ω区的蛋白谱带组合类型最少 , β区的蛋白
谱带组合类型最多(图 1)。40 个居群种子贮藏蛋
白谱带型各不相同 ,少者可分离出 13条 ,多者可
达 22条 。说明不同居群材料在编码贮藏蛋白基
因水平上存在着广泛变异 ,具有丰富的多态性 。
表 2 40 个胡枝子属植物居群种子蛋白电泳
出现点位带和分布频率
位点 出现电位带数 出现频率 相对迁移率 分子量(kDa)
1 8 0.200 0. 135 108. 1
2 31 0.775 0. 166 97. 9
3 17 0.425 0. 187 91. 6
4 25 0.625 0. 198 88. 5
5 22 0.550 0. 213 84. 3
6 24 0.600 0. 234 78. 9
7 22 0.550 0. 244 76. 4
8 30 0.750 0. 270 70. 4
9 13 0.325 0. 291 65. 8
10 35 0.875 0. 302 63. 6
11 5 0.125 0. 307 62. 6
12 30 0.750 0. 322 59. 7
13 13 0.325 0. 333 57. 6
14 13 0.325 0. 343 55. 8
15 23 0.575 0. 354 53. 9
16 28 0.700 0. 369 51. 4
17 16 0.400 0. 504 33. 5
18 12 0.300 0. 515 32. 3
19 32 0.800 0. 525 31. 3
20 34 0.850 0. 546 29. 3
21 19 0.475 0. 572 27. 0
22 40 1.000 0. 577 26. 5
23 40 1.000 0. 624 22. 9
24 1 0.025 0. 650 21. 0
25 1 0.025 0. 676 19. 4
26 1 0.025 0. 697 18. 1
27 1 0.025 0. 712 17. 3
28 12 0.300 0. 754 15. 1
29 40 1.000 0. 780 13. 9
30 35 0.875 0. 822 12. 2
31 37 0.925 0. 842 11. 4
32 40 1.000 0. 874 10. 3
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图 1 供试胡枝子属植物 40 个居群 SDS- PAGE种子蛋白质带
2. 2聚类分析和居群遗传多样性分析 图2
为利用 Jaccard遗传相似系数对供试 40个胡枝子
属植物居群的蛋白质谱带作出的聚类图 。由图 2
所示 ,40个居群在遗传相似系数为 0. 581 时聚为
4类 。第 Ⅰ类包括二色胡枝子的 3个居群(1号 ,
6号和 9号),分别依次采自内蒙古东部区哲盟 、
兴安盟和山西省五台山。种内居群间遗传差异不
大。第Ⅱ类包括 23个居群 ,即牛枝子的 11个居
群(2 ,3 ,4 ,5 ,8 , 24 ,29 ,34 ,35 ,38和 39号)和达乌
里胡枝子的 12个居群(7 , 10 , 11 , 12 , 13 , 15 , 25 ,
26 ,28 , 36 , 37 和 40 号)。它们又可划分为 3 亚
类 ,第 Ⅰ个亚类含牛枝子的 5个居群(2 ,3 ,4 ,5和
8号),采自内蒙古东部区哲盟(2号)、西部区大青
山(8 号)、清水河(3 号)、丰镇至山西大同县
(4号)和浑源县(5号),聚为此亚类的牛枝子居群
间遗传差异不大 ,但原生境差别很大 ,这可能与其
在自然条件下的生殖方式有关;按地理区域划分 ,
牛枝子居群 2和 8号并没有分别聚在第 Ⅲ类和第
Ⅲ亚类 ,说明牛枝子居群 2和 8号遗传变异较大 ,
其遗传多样性地域分布差异较大。第Ⅱ个亚类含
达乌里胡枝子的 12 个居群 ,又被划分为 2组 ,第
1组有 9个居群 , 7 、36 、37和 40号聚为一小组 ,采
自内蒙古中西部区乌盟(7号)、伊盟(37 号)及山
西太原(36号)和吉县(40号),其余 5个居群聚为
另一小组 , 采自内蒙古东部区呼盟(10 , 11 和
12号)、兴安盟(13号)和河北围场(15号),两小
组居群间遗传差异较大;第 2组有 3 个居群(25 ,
26和 28 号), 采自内蒙古东部区哲盟(25 和 26
号)和锡盟(28号), 1组和 2组间遗传差异不大。
第Ⅲ个亚类含牛枝子的 6个居群(24 , 29 , 34 , 35 ,
38和 39 号),采自内蒙古大青山(24 号)、山西
(29 , 38和 39号)、宁夏(34号)和甘肃(35号),海
拔均在1 100 m 以上 ,其中此亚类居群 24 号与第
Ⅰ亚类居群 8号地理生态环境相近 ,但没有聚为
一类 ,说明两居群间遗传差异较大。第 Ⅲ类包括
牛枝子的 2个居群(14号和 27号),均采自河北
承德 ,但生境不同 。牛枝子的这 2个居群单分一
类 ,没有与其它居群聚在一起 ,说明这 2个居群遗
传变异很大。由第Ⅱ类和第 Ⅲ类知 ,牛枝子的 13
个居群与达乌里胡枝子的 12个居群亲缘关系较
近 ,这与《内蒙古植物志》[ 14] 所述牛枝子是达乌里
胡枝子的变种说法相一致 ,也与前期形态学鉴定
结果相吻合。第Ⅳ类包括尖叶胡枝子的 4个居群
(16 ,17 ,32和 33号)和细叶胡枝子的 8个居群(18 ,
19 ,20 ,21 ,22 ,23 ,30和 31号),尖叶胡枝子的居群
33号单聚一组 ,说明其遗传变异很大 ,其它 3个居
群另聚一组 ,均采自内蒙古东部区哲盟 ,但生境不
同。细叶胡枝子的 8个居群聚在一起 ,采自内蒙古
东部区哲盟(18号)、呼盟(20 ,21 ,22号)、兴安盟(30
和31号)、河北围场(19号)和山西五台山(23号),居
群间的遗传差异较大。由此得出 ,尖叶胡枝子与细
叶胡枝子亲缘关系较近 ,这与《内蒙古植物志》[ 14] 说
法相一致 ,也与前期形态学鉴定结果相吻合。
由聚类图可以看出 ,在种的水平上 ,绝大部分
来自于相同或相似的地理生态环境的居群聚为一
类 ,这与形态学鉴定的结果基本一致;其中 ,达乌
里胡枝子与牛枝子亲缘关系较近 ,尖叶胡枝子与
细叶胡枝子亲缘关系较近 。这与红霞[ 15] 应用支
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序分析法对 28个较为稳定可靠的形态学性状研
究得出的二色胡枝子→尖叶胡枝子→细叶胡枝子
→达乌里胡枝子→牛枝子的起源和演化关系基本
相符 。
据报道 ,供试的胡枝子属植物有二倍体和四
倍体之分[ 16 , 17] ,这与本文种子蛋白分析产生的四
倍体的达乌里胡枝子和牛枝子聚在一起 、二倍体
的其它种聚在一起的结果相同 , 这也进一步说明
染色体与蛋白质之间遗传关系的一致性 。
由此认为 ,胡枝子属植物是种间 、种内具有丰
富的蛋白质多态性的种群 ,可作为研究种内变异
和生态型的重要依据 。
图 2 胡枝子属植物电泳蛋白谱带聚类图
3 讨论
种子贮藏蛋白具有高多态性 ,其谱带和组合
方式完全受基因控制 ,几乎不受环境的影响 ,可以
作为稳定的遗传标记 ,对生物种内和种间的遗传
多样性[ 18 , 19] 、系统进化和演化关系等进行研究 ,
从生化水平揭示遗传变异和多样性的机理 ,为细
胞学 、DNA 分子方面和形态学分类提供有说服力
的证据[ 1-3] 。
采用此方法对 3 种 2变种的 40个胡枝子属
植物野生居群种子蛋白首次进行了分析研究 ,居
群间遗传差异表现得很明显 ,个别居群遗传变异
很大 ,种内居群聚类状况与材料来源存在相关性 ,
这在一定程度上客观反映了胡枝子属植物遗传资
源多样性和其野生种质资源分布的地域性。
目前对胡枝子属植物的遗传多样性研究刚刚
开始 ,由于各研究者所用的材料和方法不同 ,所得
的胡枝子属种间亲缘关系也不一样 ,同时 ,研究所
涉及的种较少 ,方法较单一 ,难以较系统地评价胡
枝子属植物的遗传多样性 。因此有必要采用各种
方法 ,选取更多的种来对该属植物的遗传多样性
做深入的研究 ,并为评价其遗传多样性提供技术
支持 ,进而提高胡枝子属植物种质资源的收集 、鉴
定 、评价 、利用和创新的效率 ,更有效地为育种和
生产服务 。
另外 ,应用种子贮藏蛋白法对自交植物居群进
行遗传多样性分析 ,禾本科较多 ,豆科较少。豆科
植物以其特殊的花结构保证其自花授粉 ,例如豆科
的野大豆 Glycine soja是自交植物 ,其基因频率随
群体变化很大[ 12] ,而且自交种平均一半多的遗传
变异存在于居群之间[ 20 , 21] 。试验得出了供试胡枝
子属植物各个基因位点的频率在居群间变化很大 ,
50%以上居群之间存在遗传变异 ,由此推断 ,供试
胡枝子属植物可能自交 。这与张吉宇[ 20 , 21] 应用等
位酶研究证明达乌里胡枝子和二色胡枝子以自交
为主是相符的。因此 ,探讨通过种子贮藏蛋白法 ,
从生化水平上更好地证明其自交性和说明胡枝子
属植物有丰富的遗传多样性 。再扩大种和样品的
采集量和采用单株分析 ,是非常必要的 。
5 /2007 PRAT ACULT URAL SCIENCE(Vol. 24 , No. 5) 63 
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Study of seed protein band pattern diversity of 40 wild populations of Lespedeza
YAN Wei-hong1 , XU Zhu2 , SHI Wen-gui2 , LI Lin-hang2 ,MA Yu-bao2
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Institute of Chinese Academy of Ag riculture Science , Inner M ongo lia , Huhhot 010010 , China)
Abstract:Genetic diversi ty of seed sto rage protein w as estimated on 40 wi ld Lespedeza populat ions (3
species and 2 varied specie s) from Inner Mongolia , Hebei , Shanxi , Ningxia and Gansu provinces , u-
sing SDS - PAGE techniques. To tal 32 bands w ere found varing in mo lecular weight f rom10. 3KDa to
108. 1KDa;among which , 4 bands w ere shared by all the populations and other 28 show ed (90. 6%).
The genetic similarity coeff icient varied f rom 0. 42 to 1. 00 , giving g reater genetic variation and higher
po lymo rphism. Clustering w ith UPGMA using genetic similarity coef ficient at 0. 581 show ed the ex-
i stence o f 4 different g roups. Three populations of L. bicolor were classif ied as the fi rst group. The
second g roup consisted of 23 populations , including 11 populations of L. potanini i and 12 populations
of L. davurica. Tw o populat ions o f L . potaninii were included in the third group. The fourth g roup
w as made up of 4 populat ions of L. hedy saroides and 8 populations of L. hed ysaroides. var. subseri-
cea. A t species level , a majority of populations f rom the same or sim ilar areas w ere gathered toge ther.
L. davurica was gene tically close to L. potanini i;while L. hedy saroides was close to L. hed ysar-
oides var. subsericea , indicating that cluster analy sis coincided w ith the results of mo rpholog ic identif i-
cation. Therefo re , abundant protein diversi ty among Lespedeza species could be an impor tant refer-
ence to intraspecies varia tion and ecological type research.
Key words:Lespedez a;seed pro tein;diver si ty ;w ild population