全 文 ：第 1 1卷第 3期 生 物 化 学 杂 志 V o l . 1 1 , N o . 3
1 9 9 5 年 6月 C h in e s e B io e h e m i e a l J o u r n a l J u n . , 1 9 9 5
①
凤凰木种子蛋白的分离提纯和生化性质
王文忠 潘克祯
(中国科 学院福建物质结构研究所 , 福 州 3 5。。。 2)
摘要 研究了植物凤凤木种子 中的蛋 白质成分 ,试 图分 离出新的核糖体失活蛋 白 . 凤凤
木种 子经磷酸盐缓冲液抽提 ,硫酸按分级盐析 ,分 子筛和 阴离子交换剂等多次柱层析 ,
分离出三种组分 D r l 、 D r l 和 D r 班 . S D S 一 P A G E 和 I E F 实验表 明这三 种蛋 白质均达到
单一 纯 , 而 H P L C 实验则表明它们 的纯度不低于 90 % . 它们的分子量据 S D S 一 P A G E 和
H P L C 实验分 另,1约 2 3 5 0 0 、 2 6 0 0 0 、 2 8 5 0 0 . I E F 实验测 得三者的 等电点均为 5 . 2 左右 .
测定 了组 分 Dr l 的蛙印泡 裂解活性 , 其毒性约为天花粉蛋 白的 1 / 40 . 分析 了它们 的氛
基酸组成 . 估算 了三 种蛋 白质的二级结构含量 , 结果表 明三 者均 富含 p折叠结构 . 已有
的实验事实表 明这三 种蛋 白质的生化行为明显异 于核糖体失活蛋 白 , 因而很可 能不属
于这一蛋 白质家族 .
关键词 : 凤凰木种子蛋 白 ; 核糖体失活蛋 白 ; 二级结构含量
凤凰木 ( eD l on ix er g ia , L )是生长于热带 、 亚热带地区的一种引人注 目的装饰性中等乔木 .
火红的花朵鲜艳夺 目 ,花期很长 ,至早春时节种子才完全成熟 ,并随棕色豆荚从树上脱落 . 民间
有小孩误食种子而 中毒的例子 ,症状为腹痛 、 流涎 、 头晕等 . 文献也报道了花 、 种子等组织器官
的毒性和其它生理效应 . 如花的水或乙醇抽提液的杀蛔虫效应 ,茎或树皮的水抽提物对猫 、 猴
等实验动物具有催吐和 中枢神经系统抑制作用 l[, 2〕 . 对其中的化学成分也进行了相应的研究 ,
鉴别出若 干种类的物质 . 种子含溶血卵磷脂 ( l y so lec i t h in ) 等磷脂类化合物川 , 花含类胡萝 卜
素〔` ] , 茎皮含赤鲜醇 ( e r y t h r i t o l ) 、 白矢车菊昔元 ( le u e o e y a n id i n ) 仁` , 5」. 以上这些化合物分子量与
蛋白质比较均较低 , 它们与种子毒性 的关系尚不清楚 . 至今为止 , 有效的毒性组分仍然是未知
的 .
核糖体失活蛋 白 ( r i b o s o m e i n a e t i v a t i n g p r o t e in s , R IP )是对真核细胞蛋白质合成过程具有
强烈抑制作用的一类植物毒蛋 白 . 由于它们在医药上的潜在应用价值 ,这类蛋白正越来越受重
视 . 本研究小组也开展了关于核糖体失活蛋白的一系列研究工作 . 我们注意到 ,象其它 已知含
有核糖体失活蛋白的植物材料一样 ,凤凰木种子的磷酸盐缓冲液抽提液对小 鼠表现了显著的
毒理效应 . 有鉴于此 ,我们对种子中的蛋白质组分进行了研究 , 以期探索其中蛋白质成分与种
子毒性的关系 ,探讨其中核糖体失活蛋白存在的可能性 .
① 收稿日期 : 1 9 9 4一 0 1一 2 4 ; 修回 日期 : 2 99 4一 04一 0 7
2 7 0
DOI : 10. 13865 /j . cnki . cj bmb. 1995. 03. 006
1 材料与方法
1
.
1 材料
熟透的凤凰木种子采自厦门大学校园 , 风干后贮于冰箱中备用 . D E A E 一 s印h ad e x A 一 2 5 ,
S e p h a e r y l S
一
2 0 0 系 p h a r m e i a 产品 . D E A E 一 5 2 纤维素为 W h a t m a n 进 口 分装 . T r i s 为 S ig m a 产
品 . 其它试剂均为国产分析纯试剂 .
1
.
2 方法
.1 .2 1 种仁粗提液的制备
凤凰木种子去掉种子外壳后 , 称取 5馆 种仁用粉碎机粉碎 ,浸泡于 5 0 m l , P B s ( Z om m ol / L
p H 7
.
2 磷酸盐缓冲液 , 含 0 . 9% N a CI )中 , 冰箱中抽提过夜 . 次 日匀浆 Zm in ,继续在 4℃冰箱中
静置过夜 , 然后离心弃渣 ,上清液对重蒸水透析 3 x hs ,离心除去沉淀物 . 所得清液加硫酸钱至
9 0%饱和度 . 静置数小时后 ,在 12 o o o r /m in 下高速 离心 10 m in , 收集沉淀物 . 将硫酸钱沉淀溶
于 20 m l 左右的重蒸水中 ,透析后低速离心除去可能出现的任何沉淀 . 所得清液即为粗提液 ,保
存等进一步处理 .
L .2 2 柱层析
层析过程在冰柜 中进行 . 洗脱液用 H D 一 8 8 一 7 A 核酸蛋白检测仪 (上海兴化仪器厂 )监测 , 洗
脱 图谱以 X W T 一 S 记录 仪 自动记录 . 必要时 , 对 收集级分在 7 5 1一紫外可见光光 度计上读取
A : s o
n m值 .
a
.
D E A E
一
S e p h a d e x A
一
2 5 柱层析 : 抽提液对 l om m o l / L T r i s /H C I p H 7 . 2 缓冲液预先透析
平衡 ,然后吸附于用同样缓冲液预平衡过 的 D E A E 一 s eP h a d ex A 一 25 柱上 , 以 。一 0 . s m ol / L 缓冲
液 ( 3 0 0m l v . 5 . 3 0 0 m l )线性梯度洗脱 , 流速 6 o m l / h ,每管收集 6 m l .
b
.
S e p h a e r y l S
一
2 0 0 分子筛柱层析 : S e p h a e r y l S一 2 0 0 填充于 2 . 6e m 只 g o e m 柱 中 , 以洗脱液
( T r i s / H C I
,
p H 7
.
2 缓冲液 ,含 0 . Os m o l / L N a C I) 预平衡 . 加样 Z om l , 洗脱速度 3 o m l / h , 每管收
集 s m l .
。 · D E A E一 52 纤维素柱层析 : 柱体为 1 . c6 m x 2 . sc m ,平衡缓冲液同前述 a 二 脱盐蛋 白质样
品经透析 平衡 后上 样 吸附 . 线性 梯度 洗脱 , 缓 冲液 体系 同前 述 a . , 梯度 自 0 . 0 m ol / L 到
0
.
2 4m o l / L N a C I (各 1 5 o m l ) . 洗脱速度 Z o m l / h , 级分体积每管 4 m l .
L .2 3 分子量测定
分子量测定均利用标准 曲线以内插法计算 . S D s 一 P A G E 实验依据 w eb e : 和 O sb or n 方法
进行 仁6 ] , 凝胶浓度 7肠 . H P L C 分子筛实验在 P r o t e i n 一 6 0 、 P r o t e in 一 1 2 5 串联柱 ( w a t e r s , U S A )上
进行 . 流动相为 0 . 02 m ol / L 磷酸盐缓冲液 , p H 6 . 8 .
L .2 4 等电点测定
采用蔡武成等的方法川 . 样品经脱盐后进行分析 , 聚焦功率不高于 1 . Zw , 恒压 50 0 v , 约
h2 后聚焦完毕 . 采用 iS g m a 公司的标准 p l 蛋白系列 , 另外增加了卵白蛋白 , 牛血清白蛋白作
为标准 p l 蛋白 . 待测蛋白的等电点仍从标准 曲线上读取 .
L .2 5 氨基酸组成分析
用酸解法水解 , O P A 柱后衍生法测定 ,在 L C 一 4 A H P L C 色谱仪 (S hi m ad uz , JaP an )上进行 .
L .2 6 蛋白质合成抑制活性测定
分析测定了 rD l 的蛙卵泡裂解活力 ( G e r m i n a l V e s ie a l B r e a k d o w n , G V B D ) , 由该方法的建
立者熊用周等测定 阳〕 .
2 7 1
L 2. 7 二级结构含量预测
根据蛋白质氨基酸组成 , 采用 M us k al & iK m 所导出的 Jac k 一 K in fe 多元线性回归系数集 ,
用 自编的 F O R T R A N 7 程序进行预测阂 . 核糖体失活蛋 白的氨基酸组成从其序列计算得
出 〔` o〕 .
2 结果与讨论
.2 1 凤皿木种子中蛋白的分离纯化
完整的种子中种皮所含的有色物质对分离提纯 的影 响很大 . 抽提液 p H 值越高 ,颜色越
深 . 这 些色素为棕色 ,极易吸附于阴离子交换柱
上 . 在离子交换柱层析和分子筛层析中 ,有色物 , 。 ~
质都散布到整个洗脱液体积中 ,很难彻底除去 .
种仁和种皮之间夹有一明胶样层 ,此夹层也不利
于分离提纯 , 因为它 的 PBS 抽提物在硫酸按盐
析时产生大量沉淀 , 干扰 了溶液中蛋白的盐析 .
但这些物质不能吸附到离子交换剂上 , 可据此除
去 . 以上两个问题相当棘手 ,增加 了分离提纯 的
难度 . 目前暂时通过手工剥除种壳 ,只对种仁 (子
叶 )进行抽提来解决 ,较为费时 . 另外 , 抽提液在
低盐浓度下 , 如稀释或透析时 ,往往产生浑浊现
象 . 为防止其对层析的不利影响 ,上柱前要预先
透析平衡除去可能的沉淀物 . 清液中蛋白质绝大
部分仅吸附于阴离子交换剂上 ,而不吸附到阳离
子交换柱上 .
粗提液首先经过 n E A E s e p h a d e x A 一 2 5 柱
分离 ,得到两个主峰 , 如 iF g . 1一 a 所示 . 第一蛋 白
{
F电. 1 C h r o m a t o g r a p h y o f e ur d e e x t r a e t
( a ) D E A E
一跳 p h a d e x A 一 2 5 e h r o m o t og r a p h y o f e ur d e e x -
t r a e t
.
( b ) eS p h
a e r y l S
一
2 0 0 e h r o m o t o g r a p h y
.
F r a e t i o n s f r o rn
t h e se e o n d m a oj r 沐 a k o f ( a ) w e r e l o a d e d . ( e ) F in a l e h r -o
m a t o g r a P h y o n D E A E
一
5 2 e e l u l o se e o lu m n
.
T h e r e so vl ed
p ea k
s w e r e D r l
,
Dr l
, a n d Dr 1 f
r o m r ig h t t o le f t
E凌坛U他 咖侧叮勺
8 10 拐
F冶h t i v e m o b正 t y
F地. 2 E s t i m a t i o n o f r e al t i v e m o le e u al r m a se s o f D r l , D r 一 , a n d Dr 1 b y ( a ) DS S P A G E a n d ( b ) HP LC a n a ly s is
T h e s t a n d a r d p r o t e in s w e r e bo
v in e al b u 而 n ( 6 7 k D ) , o v al b u m i n ( 4 3 k D ) , t r i e h os a n t h i n ( 2 7 k D ) , a dn ly so 却m e ( 1 4 . 3 k D ) .
T h e 卯 s i t i o n s ar e in d i e a t e d b y t h e ar o w s . A b cs ias s : r e al t i v e m o b il t y ; Or d i n a t e s : lo g o r i t h m o f m o le e u lar m a s s
2 7 2
峰经 S DS一 PA G E检测 ,具有较多的弱染色带 , 且分子量较大 , 暂时没有深入研究 . 收集第二蛋
白峰 , S D S 一 P A G E 实验提示其组分具有合适的分子量范围 , 染色带型也较简洁单一 这样 , 第
二峰级分进一步以 S一 2 0 柱分离 ,结果如 iF g . 1一 b . 收集主峰级分 ,最后在 D E A E 一 52 柱上层析 ,
可得三个分离较好的蛋白峰 ,如 iF g . 1一 。 所示 , 即为分离得到的三个组分 rD l 、 D r l 和 D r 班 .
三种组分在 S D S 一 P A G E 上均为单一带 , 测得 D r l 、 D r l 、 rD l 的分子量分别为 2 98 0 、 25
7 0 0
、
2 8 7 0 0 ( F i g
.
2
一 a )
.
H P L C 单峰性 也很好 ( F i g . 3 a 一 e ) ,结果为 2 3 5 0 0 、 2 6 1 0 0 、 2 8 6 0 0 ( F i g . 2 -
b )两者结果一致 .
2
.
3 等电点测定
三种蛋 白的等电点均在 5 . 2 左右 ( iF g . 4) . 三种蛋白在同一凝胶柱上聚焦 ,可 区分三条聚
焦线 ,外周两线距离小于 Zm m (胶柱长 gc m ) . 无需染色即可观察到三条等电聚焦的沉淀线 . 这
一性质可能有助于将来利用等电沉淀来简化分离步骤 ,提高提纯效率 .
(b )
(e )
暇 7
6
5
4
4 6
】月明 th InCI
F啥 . 3 H P L C e lu t i o n p r o f i l e s o f ( a ) D r l , ( b )
D
r l , ( e ) D r l
T h e p r o f i l e s o f t h e p e a k
s i n d i e a t e d t h a t t h e p r于
t e i n
s
h
a
d b e e n h ig h ly p u
r i f i e d
.
T h e d e g r e e s o f
p u r i t y a s e s t i m a t e d b y t h
e i n t e g r a l p e a k a r e a s
e x e e e d e d 9 0 %
F ig
.
4 E s t im a t i o n o f i s o e l e e t r i e p o i n t
s o f D
r l , D
r l , a n d D
r l
T h e 卯 s i t i o n s w e r e i n d i e a t e d b y t h e s i n g l e a r r o w s . T h e p H g r a d le n t
w a
s e a li br a t e d by s t a dn
a r d p
r o t e i n s o f
a
m y lo g l
u e o s id
a s e
( 3
.
5 5 )
,
t r y p s i n i n h ib i t o r ( 4
.
5 5 )
,
bo v i n e
s e r u m
a
lb u m i n ( 4
.
9 )
, o v a l
u
b
u
m i n
( 5
.
1 )
, 卜l a e t o g lu b i n A ( 5 . 1 3 ) , e a r b o n i e a n h y d r a s e B ( 5 . 8 5 , bo v i n e ) ,
e a r b o n i e a n h y d r a s e B
,
( 6
.
5 7 , h u m a n )
,
m y o g lo b i n ( 6
.
7 6 , 7
.
1 6 )
,
L
-
la e t i e d e h y d
r o g e n a s e ( 8
.
5 5 )
, t r y s i n o g e n ( 9
.
3 )
.2 4 氨基酸组成分析
结果列于 T ab l e 1 .
T a b l e 1 A m in o a e id e o m p o s i t i o n o f D r l
,
D r l
, a n
d D
r l ( m o l )
D r l D
r l D r l D r l D r l D r l
A ,
a 3
·
9 4 “ · ` 0 ` 2 · 7 3 … L e U ` 4 · “ 0 ` 4 · 3 0 ` 5· 75
C y , N d N d N d
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e ` 3 · “ 4 “ · “ ` 4 · “ o
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G , y 4 4
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梦, , .9 竺 1。· 2 8 7 · 。 5 { Ya“ 7 · 7 5 ` 7 · 2 7 ’ 9 一 8`“ e ` 5 · 5。 ` 5 · ” 2 ` 5 · ” 5 } T r p N d N d N dL y s 1 1 · 1 2 14 · 1 2 8 · 5 7 } T y r 14 · 8 0 8 · 6 7 7 · 2 8
N d
: n o t d e t e r m i n e d G l x
: s u rn o f G ln a n d G lu A
s x : s u m o f A s n a n d A s p
2 7 3
2
.
5蛋白质抑制活性
rD l 的 G V D B活性如 T ab l e 2 . 据此推算 , 其毒性约为天花粉蛋 白的 1 / 40 . 至于活性随时
间衰减的现象 , 尚不能确定其原因 .
T a b l e 2 T
o x i e i t y o f D r l
A m o u n t / p g R e l a t i v e t o x i e i t y
10706’0)( )(,0O5泊川T r i e h o sa n t h i n
T r i e h o sa n t h i n
rD I
】万 I
芳
A s s a y e d 3 d a y s a f t e r d i s so l
v e d
.
.2 6 二级结构含 t 预测
rD l
、
rD l 和 rD 兀的预测结果列于 T ab le 3 ,表中 。 % 、 p%和 。 %分别是 。 螺旋 、 月折叠和无
规则伸展肤段的百分含量 . 对 已知的 10 种核糖体失活蛋 白的预测结果同列于 T ab l e 3 中供 比
较 . 可见本文所分离的三种蛋白与核糖体失活蛋白存在很显著的差异 .
T a b l e 3 eS
e o n d a r y s t ur
e t u r e e o n t e n t P r e d i
e t io n o n D r l
,
Dr l
,
D r 1 a n d t
e n
R IP
s
Q
% 日% c %
T r i e h o as n t h i n 4 8
.
3 1 6
.
3 35
.
2
M o m o r e h a r in 4 8
.
6 1 4
.
1 3 7
.
2
a 一 L u f fin 4 7
.
6 1 9
.
1 3 3
.
5
件L u ff in 4 9 . 0 1 0 . 7 4 0 . 3
R i e in A C h a i n 3 9
.
0 2 3
.
3 3 7
.
7
R i e in u s e o m m u n i s a g g lu t in i n 3 8
.
4 2 6
.
1 3 5
.
4
A br in A e h a i n 3 1
.
5 2 8
.
3 4 0
.
3
P o k e w e e d a n t i v i r a l p r o t e in 4 1
.
7 1 3
.
5 4 4
.
7
M i
r a b i il a n t iv i r a l p r o t e i n 4 6
.
4 1 7
.
6 3 6
.
0
S a Po r i n
一 6 4 9
.
9 9
.
8 4 9
.
3
D r 1 1 1
.
7 3 8
.
0 5 0
.
3
D
r 1 1 8
.
5 4 1
.
3 4 0
.
2
D r 1 1 6
.
6 4 3
.
1 4 0
.
3
T h e e o n f id e cn e a n d r e il a b i li t y o f t h e m e t hdo
o n a d a t a ba s e o f 1 0 4 p r o t e i n
s a r e :
a
%
:
m e a n = 1 2
·
8%
, 。 = 1 2 . 1% 日% : m e a n = 10 . 6% , 。一 4 . 6写仁9〕
.2 7 D r l
、
D r l 和 D r 皿作为核掩体失活蛋 白的可能性
一般认为碱性的等电点 ( p l 一 8 一 1 0) 和 30 kD 左右的分子量 ,是单链核糖体失活蛋 白的两
个特征 . 因为等电点偏于碱性 , 阳离子交换柱层析广泛地应用于核糖体失活蛋 白的分离提纯
中 . 我们曾经借鉴这些方法 ,使用 C M 纤维素等阳离子交换剂进行分离 , 结果蛋白吸附很少 ,无
法层析出蛋白峰 . 事实上 , 已分离的三种蛋白 IP 均偏于酸性 , 与一般情形不符 . D : I 的 G v B D
活力与其它核糖体失活蛋白比较 ,也显得太低 . 从氨基酸组成来看 , 它们之间也存在较大差异 .
尤其从二级结构含量预测的结果看 , 差别也是很显著的 . T ab l e 3 显示 ,核糖体失活蛋 白 Q 螺旋
含量高 ,而 目前分离的三种蛋白则富含 日折叠 . 从预测方法的可靠性判断 ,预测结果所反映的
两者间差异应该是可信的 . 考虑到结构是功能的基础 ,结构上的差异大大减少了这三种蛋白作
为核糖体失活蛋白的可能性 . 综上所述 ,我们初步推测认为这三种蛋白很可能不是核糖体失活
蛋 白 . 种子上是否存在其它可能的核糖体失活蛋 白 , 种子的有效毒性组分 , 以及已分离的三种
蛋白的生物学功能等问题 ,还有待进一步深入研究 . 最后 ,我们注意到富含 p折叠的蛋白质主
2 7 4
要有神经毒素 (多为小分子量活性肤 ) , 免疫球蛋白和蛋白水解酶类等 . 鉴于蛋白水解酶作为胞
外酶在植物中的广泛分布和众所周 知的重要性 , 我们将着重考虑所分离的三种蛋白质作为水
解酶类的可能性 .
致谢 本所唐根源 、 吴红京 同志帮助完成涉及 H P L C 的有关实验 , 谨致谢意 . 同时感谢本组各位同事所
给予的支持 .
参 考 文 献
1 P a n t U C
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. 月 ` r ba l P of . , 1 99 2 , 18 : 16 0一 1 6 1
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C h e n d r a S
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3 El
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P la nat M ed
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C h a r a c t e r i z a t i o n a n d S e c o n d a r y S t r u c t u r e
C o n t e n t P r e d i c t i o n o f N o v e l P r o t e in s f r o m t h e S e e d s o f eD l
o n i x er g认
W
a n g
,
W
e n 一 Z h o n g P a n
,
K e
一
Z h e n
( F u 7故 n I n s t t’ u t e of R e s ea cr h on t h e S t ur c t u er o f M a t t e r
,
hC in
e s e A c ad
e m少 Of S c ic cn e s
,
F u z h ou 3 5 0 0 0 2 )
A b s t r a c t I n a n a t t e m p t t o s e a r e h f o r n o v e l r ib o s o m e i n a e t iv a t i n g p r o t e i n s ( R IP s )
,
t h e p r o t e i n
e o n s t i t u e n t s o f t h e s e e d s o f t h e p l a n t eD枷红 er g 故 h a v e b e e n in v e s t ig a t e d . T h r e e n o v e l p r o t e in s ,
D r l
,
D r l
, a n d D r l
,
h a v e b e e n is o l a t e d a n d p u r i f i e d t o h o m o g e n e i t y a s d e m o n s t r a t e d b y S D S
-
P A G E a n d IE F e x p e r im e n t s
.
T h e d e g r e e s o f p u r it y o f a l l t h e t h r e e p r o t e i n s e x e e e d 9 0 % a s e s t i
-
m a t e d b y H P L C a n a l y s i s
.
T h e m o l e e u la r m a s s e s o f t h e t h r e e p r o t e i n s a r e a p p r o x im a t e l y 2 4 k D
,
2 6 k D a n d 2 9 k D r e s p e e t iv e ly b y b o t h S D S
一
P A G E a n d H P L C a n a ly s e s
.
T h e is o e le e t r i e p o i n t s w e r e
e s t im a t e d t o b e a r o u n d p H S
.
2 b y IE F e x p e r im e n t
.
T h e p r o t e in D r 1 h a s a l s o b e e n a s s a y e d f o r
G V B D a e t i v i t y a n d s h o w e d a p p r o x im a t e l y l / 4 0 a s e f f e e t iv e a s t r ie h o s a n t h in
.
T h e a m i n o a e id e o m
-
P o s i t i o n s h a v e a ls o b e e n d e t e r m i n e d
.
S e e o n d a r y s t r u e t u r e e o n t e n t e s t im a t i o n s r e v e a l t h a t t h e t h r e e
p r o t e i n s a r e a ll a b u n d a n t i n 件s h e e t s t r u e t u r e . T h e b ioc h e m ie a l b e h a v io r o f t h e t h r e e p r o t e i n s r e -
s e m b le s e a e h o t h e r a n d d if f e r s f r o m t h a t o f R I P f a m i l y
.
T a k i n g a l l t h e e v id e n e e s a v a i l a b le
,
t h e
p r o t e i n s m o s t p r o b a b ly b e lo n g t o a d i s t i n e t p r o t e in f a m i l y o t h e r t h a n t h e R I P f a m i l y
.
K e y w o r d s : eD lon ix er g 故 ; R ib o s o m e in a e t i v a t i n g p r o t e i n s ; P u r i f i e a t i o n ; S e e o n d a r y s t r u e t u r e
C o n t e n t
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