全 文 ：2004;30(1) 蚕　业　科　学　　　CANYE KEXUE
收稿日期:2003-10-30
资助项目:科技部基础性项目(编号 NB 03-23);华东船舶工业学院
青年基金(编号 Q 2001×01)。
作者简介:赵卫国(1966-),男(汉),江苏 ,博士研究生 ,副研究员。
Tel:0511-5616570 , E-mail:wgzsri@sina.com
通讯作者:潘一乐 ,研究员 ,博士生导师。
Tel:0511-5616552
桑属植物 ITS序列研究与系统发育分析
赵卫国　潘一乐　张志芳
(中国农业科学院蚕业研究所 ,农业部家蚕生物技术重点开放实验室 ,镇江　212018)
摘　要　用PCR产物直接测序法对桑属的 9个种 3个变种共 13 份桑种质和构属构树的 ITS 序列进行了测定。结果
表明:桑属植物 ITS1长度平均约为189 bp;桑属5.8S rRNA 为152 bp;ITS2长度平均为 212 bp;桑属植物 ITS 序列G+C
含量为 60%左右。用 DNASTAR 软件构建了桑属植物 ITS 序列的系统发育树 ,并探讨了参试桑种质的亲缘关系。
关键词　桑　内转录间隔区(ITS)序列　系统发育
中图分类号　S888.2　　　文献标识码　A　　　文章编号　0257-4799(2004)01-0011-04
　　我国桑树遗传资源丰富 ,大约有3 000份种质资
源 ,包括 15个种 4个变种 ,不少桑种为我国特有 ,且
分布范围广泛。开展桑属植物系统发育和分子进化
研究 ,对丰富的桑树遗传资源收集 、整理 、保存和创
新利用有着重大意义 。
内转录间隔区(internal transcribed spacer , ITS)位
于18S和 26S rRNA 基因之间 ,被 5.8S rRNA基因分
为2段 ,即 ITS1和 ITS2。 ITS 序列在被子植物中的
长度变异很小 , ITS1和 ITS2的长度均不足 300 bp ,
PCR扩增及测序简单易行 ,特别是 PCR产物直接测
序法的诞生 ,极大地推动了 ITS 在被子植物科内 ,尤
其是近缘属间及种间关系研究中的应用[ 1-3] 。在桑
属植物 ITS 研究方面 ,史全良等[ 4]对蒙桑的该序列
进行了测定 ,并对其在桑树分子系统学研究中的应
用价值进行了展望 。本文以桑属植物为材料 , 用
PCR产物直接测序法测定各材料间的系统发育关
系 ,以期为桑树遗传改良提供理论依据 。
1　材料与方法
1.1　材料来源
所有材料采集于国家种质-镇江桑树圃 ,具体见
表1 。
1.2　叶片总 DNA的提取
采用CTAB法[ 5]提取桑树基因组 DNA 。
1.3　ITS序列的扩增 、纯化和测序
PCR扩增反应在PE公司的 9600型PCR扩增仪
上进行 ,反应体系为 50 μL ,内含:双链 DNA模板(约
25 ng),MgCl2(2.5 mmol/L),dNTP(200 μmol/L),正反
引物(5′-CGTAACAAGGTTTCCGTAGG-3′, 5′-TCCTC-
CGCTTATTGATATGC-3′)2 μmol/L , Taq DNA 聚合酶
(1.5 U), 10×PCR Buffer(100 mmol/L Tris-HCl pH
8.3 ,500 mmol/L KCl , 0.01% gelatin)。扩增反应程
序:95 ℃预变性 10 min , 95 ℃变性 1 min ,55 ℃退火
1 min ,72 ℃延伸 90 s;循环 38 次;72 ℃延伸 7 min。
ITS扩增产物的纯化用 GLASSMILK法[ 6] 。纯化 PCR
产物由上海基康生物技术有限公司测序。
1.4　ITS序列分析
ITS1和 ITS2序列范围根据所用引物以及水稻
等相关序列[ 7]确定 。采用 DNASTAR软件进行序列
同源性和聚类分析 。
2　结果与分析
2.1　桑属植物 ITS序列的长度 、G+C 含量
本试验采用PCR产物直接测序法对9个种 3个
变种共 13份桑种质的 ITS 序列进行了测定 ,其长
度 、G +C含量见表 2。
从表2可见:桑属植物 ITS1长度在181 ～ 197 bp之
间 ,最大相差16 bp ,平均约为 189 bp ,与构属构树 192
bp相差不大;桑属 5.8S rRNA 除吉蒙桑为 154 bp 外 ,
其余完全一致 ,为 152 bp ,说明该区比较保守;桑属植
物 ITS2长度在208 ～ 219 bp间 ,最大相差 11 bp ,平均
11
DOI :10.13441/j.cnki.cykx.2004.01.004
为212 bp;桑属植物 ITS序列长度和已报道的被子植
物长度基本一致(ITS1在 187 ～ 298 bp间 , ITS2在 187
～ 252bp间);桑属植物 ITS序列G +C 含量为 60%左
右 ,而且 ITS1和 ITS2基本一致 ,反映出协同进化现象。
表 1　桑属材料的来源
Table 1　The source of materials
桑种　Species 材料　Accessions 来源　Origin
鲁桑　M.multicaulis Perr. 纳溪桑　Naxisang 四川省纳溪　Naxi city , Sichuan Province , China
白桑　M.alba Linn. 牛耳桑　Niuersang 山西省阳城　Yangcheng city , Shanxi Province , China
大叶桑　M.alba var.macrophylla Loud. 珙县黑油桑　Gongxianheiyousang 四川省珙县　Gongxian city , Sichuan Province , China
白脉桑　M.alba var.venose Delile. 纹契桑　Wenqisang 陕西省周至　Zhouzhi city , Shaanxi Province , China
广东桑　M.atropurpurea Roxb. 伦教 40号　Lunjiao No.40 广东省顺德　Sunde city , Guangdong Province , China
山桑　M.bombycis Koidz 剑持　Jianchi 日本国　Japan
长果桑　M.laevigata Wall. 德江 10号　Dejiang No.10 贵州省德江　Dejiang city , Guizhou Province , China
蒙桑　M.mongolica Schneid. 吉蒙桑　Jimengsang 吉林省　Jilin Province , China
鬼桑　M.mongolica var.diabolica KOIDZ. 有毛岩桑　Youmaoyansang 贵州省　Guizhou Province , China
暹逻桑　M.rotundiloba Koidz. T11 泰国　Thailand
长穗桑　M.wittiorum Hand-Mazz. 黔鄂桑 1号　Qianesang No.1贵 14号　Gui No.14
贵州省德江　Dejiang city , Guizhou Province , China
贵州省毕节　Biejie city , Guizhou Province , China
鸡桑　M.australis Poir. 插桑　Chasang 四川省　Sichuan Province , China
外源种　Outgroups 构树　B .papyrifera 南京林业大学　Nanjing Forestry University , China
　　所有桑属材料均采集于国家种质-镇江桑树圃。
All mulberry materials sampled were from National Mulberry Genbank in the Sericultural Research Institute , CAAS , Zhenjiang , Jiangsu Province , China.
表 2　桑属植物的 ITS序列长度 、G+C含量以及在 GenBank的登录号
Table 2　Length(bp)and G+C contents of ITS1 , 5.8S rRNA and ITS2 of genus Morus and GenBank accession No.
材料
Materials
ITS1 5.8S rRNA ITS2
长度(bp)
Length
G+C
(%)
长度(bp)
Length
G+C
(%)
长度(bp)
Length
G+C
(%)
GenBank登录号
Accession No.
纳溪桑　Naxisang 189 59.3 152 55.3 217 60.8 AY345153
牛耳桑　Niuersang 181 59.1 152 54.6 217 62.2 AY345157
珙县黑油桑　Gongxianheiyousang 189 59.3 152 55.3 209 62.7 AY345148
纹契桑　Wenqisang 190 60.0 152 55.3 219 62.1 AY345149
伦教 40号　Lunjiao No.40 189 59.3 152 55.3 208 62.5 AY345145
剑持　Jianchi 188 58.5 152 42.1 210 57.8 AY345151
德江 10号　Dejiang No.10 189 59.8 152 55.3 208 63.0 AY345147
吉蒙桑　Jimengsang 197 58.9 154 55.2 210 62.9 AY345158
有毛岩桑　Youmaoyansang 189 59.3 152 55.3 210 62.9 AY345146
T11 189 59.3 152 55.3 211 62.6 AY345150
黔鄂桑 1号　Qianesang No.1 189 59.8 152 55.3 213 61.5 AY345154
贵 14号　Gui No.14 189 59.8 152 55.3 209 62.9 AY345155
插桑　Chasang 189 59.3 152 55.3 210 62.9 AY345152
平均　Average 189 212
构树　B.papyrifera 192 68.8 148 57.4 - - AY345156
12 　　　　蚕　业　科　学 2004;30(1)
2.2　桑属植物 ITS序列的聚类分析
用DNASTAR分析软件对测定 ITS 序列进行了
桑属植物的同源性分析 ,结果显示桑属植物和桑科
构属植物间的同源性在 60%～ 75%,而桑属植物内
材料间都大于此值 ,大部分材料间的相似系数在
90%以上 ,其亲缘关系较近 ,其中插桑(属于鸡桑)和
有毛岩桑(属于鬼桑)ITS 完全相同 。通过序列配
对 ,序列总长度为 623 bp ,变异位点为 260个 ,说明
该序列完全可用于聚类分析。用 Clustalx 软件对 14
个样本 ITS序列进行了聚类分析 ,建立了其系统进
化发育树(图 1)。从聚类结果来看 ,桑科的构属和
桑属单独聚为一类 ,说明桑属属于单系 ,这与作者
等[ 6]利用叶绿体 trnL-trnF 基因间隔区序列研究结果
一致 。单独从桑属植物聚类结果来看:供试桑种质
中的蒙桑单独聚为一类 ,亲缘关系最远;插桑和有毛
岩桑聚为一类 ,和形态分类基本一致 ,插桑和有毛岩
桑在形态上都具有长花柱;其它桑种质聚为一类 ,在
这个聚类中又可分成 2个聚类 ,黔鄂 1号 、剑持 、纳
溪桑和纹契桑聚为一类 ,说明它们有相近的亲缘关
系 ,桑属其余材料聚为一类 。
图 1　桑属植物 ITS序列系统发育树
Fig.1　Phylogenetic tree of genus Morus generated from ITS sequences(The number represents nucleotide substitutions)
3　讨论
由于桑树是异花授粉 ,自然界分布极广 ,易杂
交 ,又能通过无性繁殖 ,因此通过长期的自然杂交和
人工杂交 ,使桑树的遗传背景相当复杂。传统的形
态学 、染色体核型分析和同工酶分析等方法 ,难以解
决桑树系统进化和分类上的许多分歧 ,不能充分满
足种质资源鉴定和育种工作的需求。另外 ,在桑树
方面目前虽进行了分子标记技术研究 ,但主要集中
在RAPD技术对桑属系统学研究 ,其局限性也被相
继提出。为此 ,本文利用 PCR产物测序法 ,对桑属
植物 ITS 序列进行了分析 ,通过揭示 DNA 分子核苷
酸的变异来研究桑属的系统发育 ,比一般方法更直
观 、准确。以后有望在桑属植物中利用多重序列来
研究其系统发育和进化。
参 考 文 献
1　王建波 ,陈家宽.核 rRNA的 ITS序列在被子植物系统与进化研究
的应用(J).植物分类学报 , 1999 , 37(4):407-416
2　王小全 ,洪德元.植物分子系统学的研究进展概况(J).植物分类
学报 , 1997 ,35(5):465-480
3　赵志礼 ,董辉.核糖体 DNA ITS区序列在植物分子系统学中的价
值(J).植物资源与环境学报 , 2000 , 9(2):50-54
4　史全良 ,赵卫国.桑树 ITS序列测定及特点的初步分析(J).蚕业
科学 , 2001 ,27(2):140-141
5　赵卫国 , 潘一乐 ,黄敏仁.桑属种质资源的随机扩增多态性 DNA
研究(J).蚕业科学 , 2000, 26(4):197-204
6　赵卫国 ,张志芳 ,潘一乐.桑树 trnL-trnF 基因间隔区序列的特点及
分析(J).蚕业科学 , 2002, 28(2):83-86
7　Takaiwa F , Oono K , Sugiura M.Nucleotide sequence of the 17s～ 25s
spacer region from rice rDNA(J).Pl Mole Bio , 1990 ,(4):355-364
13第 1期 赵卫国等:桑属植物 ITS序列研究与系统发育分析
Phylogenetic Relationship of Genus Morus by ITS Sequence Data
ZHAOWeiguo　PAN Yile　ZHANG Zhifang
(Key Laboratory of Silkworm Biotechnology of Ministry of Agriculture;The Sericultural Institute Research ,
Chinese Academy of Agricultural Sciences , Zhenjiang 212018)
　　Abstract　ITS(internal transcribed spacer)sequences of 13 mulberry materials , which belong to 9 species and 3
varieties , and 1 B.papyrifera were determined using direct sequencing of PCR product in this paper.The length of ITS1
and ITS2 of mulberry is about 189 bp and 211 bp , respectively , while that of 5.8S rRNA is 152 bp.Its G +C contents
is about 60%.Phylogenetic analysis of ITS sequences using DNASTAR software indicated that genus Morus is mono-
phyletic group and their affinity relationship is discussed.
Key words　　Morus alba ITS Phylogeny
全国桑树种质资源研讨会会议纪要
2003年 12月 21-23日 ,由中国农业科学院蚕业研究所 、国家种质镇江桑树圃主持的全国桑树种质资源
研讨会在江苏省镇江市召开 ,来自全国 11个省 、市 14家单位的26名专家学者参加了研讨会。
研讨会邀请中国农业科学院作物品种资源研究所方嘉禾研究员和曹永生研究员出席会议并分别作了题
为“我国作物种质资源保护利用现状与行动建议” 、“国家科技基础条件平台建设与桑树种质资源共享”的学
术报告 。中国农业科学院蚕业研究所常务副所长郭锡杰研究员出席研讨会并讲话 ,中国农业科学院蚕业研
究所副所长李龙研究员 、科研处处长张健副研究员 、栽桑研究室主任程嘉翎副研究员出席研讨会。研讨会由
国家种质镇江桑树圃负责人潘一乐研究员主持。
本次研讨会是 1979年全国桑树品种资源及育种座谈会以来 ,首次召开的全国桑树种质资源会议 ,得到
了全国各地蚕业科研单位及大专院校领导 、专家 、同行的积极响应。研讨会收到论文 19篇 ,并编辑印刷了论
文集 ,论文范围涉及桑树种质资源的收集 、保存 、鉴定 、评价 、创新与利用等诸多方面的内容 。参加研讨会的
各位代表就各自单位桑树种质资源的收集 、保存 、鉴定 、评价 、创新与利用等进行了汇报交流 ,并就种质交换 、
种质共享以及各方利益保护等方面进行了深入的座谈与探讨。
与会代表均认为研讨会不仅开得很成功 ,而且开得非常及时 ,并建议以后应多召开此类研讨会 。经过
“七五” 、“八五” 、“九五”3个五年计划后 ,我国桑树种质资源工作取得了很大的进展 ,很有必要开这样一次全
国性的会议 ,交流各自的成果 ,探讨以后的研究方向。同时 ,全国桑树种质资源工作者已基本实现了新老交
替 ,召开这样一次全国性的会议有助于年轻一代的桑树种质资源工作者增进了解 ,加强合作 ,促进桑树种质
资源学科的发展 。
我国是世界蚕业的发源地 ,也是桑树的重要起源中心之一 。桑树种质资源是我国蚕业实现可持续发展
的重要物质基础 。我国的桑树种质资源研究虽然取得了巨大的成就 ,但与印度 、日本等国家相比 ,还存在着
基础设施落后 、研究经费短缺 、研究深度不够等问题。与会代表呼吁国家加大对桑树种质资源研究的投入力
度 ,促进我国桑树种质资源学科加快发展 ,为我国蚕业发展奠定坚实的基础 。
14 　　　　蚕　业　科　学 2004;30(1)