全 文 ：果 树 学 报 2007,24(4):557～560
JournalofFruitScience
收稿日期:2006-12-30 接受日期:2007-03-26
基金项目:北京市优秀人才项目(20042D0502101);北京农学院三项基金项目;北京市属市管高校人才强教计划项目
作者简介:甄贞,女,硕士。Tel:010-80794426,E-mail:zhenzhen2008486@163.com
5 通讯作者。Authorforcorespondence.E-mail:qinlingbac@126.com;E-mail:caoqingqin@sina.com.cn
栗属植物cpSSR标记技术的建立与体系优化
甄 贞 1,曹庆芹 2*,杨 凯 2,沈元月 1,冯永庆 1,秦 岭 1*
(1北京农学院植物科学技术系,2北京农学院生物技术系,北京 102206)
摘 要:叶绿体微卫星标记是一种新的分子标记技术。用1对来源于拟南芥的cpSSR引物研究栗属资源,对栗属植
物cpSSR反应体系的主要影响因子进行了优化筛选。结果表明,20μL反应体系各组分的最适浓度分别为:2.5mmol/L
Mg2+,0.5UTaqDNA聚合酶,0.25mmol/LdNTP,10mg/L的 DNA模板,正向引物和反向引物都为 0.1μmol/L,
NTCP40最适退火温度为56℃。该体系已成功应用于栗属资源的遗传多样性研究中。
关键字:栗属植物;cpSSR;体系优化
中图分类号:S664.2 文献标识码:A 文章编号:1009-9980(2007)04-557-04
EstablishmentofcpSSRmarkertechnologyandoptimizationofitsreac-
tionsystemingenusCastanea
ZHENZhen1,CAOQing-qin2*,YANGKai2,SHENYuan-yue1,FENGYong-qing1,QINLing1*
(1DepartmentofPlantScienceandTechnology;2DepartmentofBiotechnology,BeijingAgriculturalColege,Beijing102206China)
Abstract:Chloroplastmicrosateliteisanewmolecularmarkertechnology.ExperimentwasconductedwithcpSSRprimers
obtainedfromArabidopsisthalianaforstudyingthegermlasmofgenusCastaneaMil.Theoptimizationofmaininfluential
factorsofcpSSRreactionsysteminCastaneawasstudied.TheresultsshowedthattheoptimumconcentrationsofMg2+,Taq
DNApolymerase,dNTPs,templateDNA,andprimersin20μLreactionsystemwere2.5mmol/L,0.5U,0.25mmol/L,
10mg/Land0.1μmol/L,respectively.56℃wasthemostsuitableannealingtemperatureofNTCP40primer.Moreover,it
wassuccessfulinstudyinggeneticdiversityofgermplasmofCastaneaMil.
Keywords:CastaneaMil.;cpSSR;Optimizationofreactionsystem
现代分子生物学技术的迅速发展,为在DNA水
平上研究板栗种质遗传多样性提供了有效的技术手
段,同时为栗属植物起源和分类研究提供了新的思
路。cpSSR(ChloroplastSimpleSequenceRepeat,叶绿
体简单序列重复)标记技术,是在 SSR标记技术基
础上发展起来的新的 DNA分子标记技术。它具有
SSR标记的优点又兼顾到叶绿体基因组的特点,被
广泛应用于植物群体遗传分析及系统发育分析的
研究中[1]。但由于其引物来源受限,高等木本被子植
物中的应用仅在猕猴桃[2]、柑橘类[1,3]和欧洲栗[4]等果
树中有报道。未见有cpSSR标记用于其它栗属资源
的研究报道。本实验对各个因子的最佳反应条件进
行了摸索,建立了适合于板栗等栗属植物的cpSSR
反应体系。
1 材料和方法
1.1 植物材料
在山东泰安和北京怀柔板栗资源圃选取栗属植
物中野板栗、锥栗、日本栗和板栗等种及具有代表性
的品种或类型15份(表1),以幼嫩叶片作为提取植
物总DNA的材料。
1.2 叶绿体SSR引物(cpSSRPrimers)
用 1对来源于拟南芥 (Arabidopsisthaliana)的
cpSRR引物进行研究。引物由上海生工合成(表2)。
1.3 板栗叶片基因组DNA的提取
CTAB法提取板栗叶片基因组DNA[5],浓度及纯
度用核酸蛋白测定仪(Eppendorf)测定,并用质量分
数0.7%琼脂糖凝胶检测DNA完整性。
DOI:10.13925/j.cnki.gsxb.2007.04.033
果 树 学 报 24卷
表3 cpSSR反应体系
Table3Thereactionsystemofchloroplastsimplesequencerepeat
MgCl2浓度
ConcentrationofMgCl2
(mmol/L)
TaqDNA聚合酶用量
AmountofTaqDNApolymerase
(U)
1.25
1.50
1.75
2.00
2.25
2.50
0.5
1.0
2.0
3.0
4.0
-
正/反向引物浓度
Concentrationofprimer
(μmol/L)
0.1
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
dNTP浓度
ConcentrationofdNTP
(mmol/L)
0.05
0.10
0.15
0.20
0.25
0.30
DNA模板浓度
ConcentrationoftemplateDNA
(mg/L)
5
10
20
30
40
-
种或品种名
Speciesorcultivars
拉丁文名
Latinname
产地
Resource
燕红
Yanhong
锥栗
Henry
台江大板栗
Taijiangdabanli
日本栗
JapaneseChestnut
野板栗
WildChestnut
苇甸无花
Weidianwuhua
垂枝栗
Chuizhili
罗田羊毛栗
Luotianyangmaoli
板栗
Chestnut
怀黄
Huaihuang
红栗
Hongli
罗田中迟栗
Luotianzhongchili
板栗
Chestnut
浅刺大板栗
Qiancidabanli
短花序芽变
Shortcatkinsport
CastaneamolissimaBl.
C.henryiRehd.etWils.
C.molissimaBl.
C.crenataSieb.etZucc.
C.sp.
C.molissimaBl.
C.molissimaBl.
C.molissimaBl.
C.molissimaBl.
C.molissimaBl.
C.molissimaBl.
C.molissimaBl.
C.molissimaBl.
C.molissimaBl.
C.molissimaBl.
北京
Beijing,China
江苏
Jiangsu,China
贵州
Guizhou,China
日本筑波
Tsukuba,Japan
贵州
Guizhou,China
北京
Beijing,China
湖北
Hubei,China
湖北
Hubei,China
湖南
Hunan,China
北京
Beijing,China
山东
Shandong,China
湖北
Hubei,China
贵州
Guizhou,China
湖北
Hubei,China
北京
Beijing,China
表1 栗属植物材料
Table1TheplantmaterialsofgenusCastanea
表2 叶绿体简单重复序列引物
Table2ThecpSSRprimersused
编 号
Code
NTCP40-A
NTCP40-B
退火温度
Tm
(℃)
55.4
51.1
序列长度
Sequence
length(mer)
19
19
序列
Sequence(5’～3’)
GATGTAGCCAAGTGGATCA
TAATTTGATTCTTCGTCGC
1.4 PCR扩增的反应体系和反应程序
1.4.1 cpSSR-PCR反应体系的建立 本实验参考
程运江[6]的方法,初步采用总体积为 20μL的反应
体系:1×Bufer,1.25mmol/LMgCl2,0.2mmol/LdNTPs,
1UTaqDNA聚合酶,10mg/LDNA模板,0.10μmol/
L正向和反向引物。DNA模板采用燕红的基因组
DNA,采用NTCP40引物进行扩增。反应采用20μL
体系,将 TaqDNA聚合酶、引物浓度、MgCl2等设置
不同的梯度以确定最佳反应体系(表3)。
1.4.2 cpSSR-PCR反应程序的优化 PCR的扩增
在GenAmpPCRSystem9700型扩增仪进行,反应程
序为:94℃预变性 5min→94℃变性 1min→56℃
退火30s→72℃延伸1min(32个循环)→72℃延伸10
min。根据扩增体系的选择结果,应用NTCP40引物
与燕红 DNA模板,将退火温度设计为 10个梯度,
即:44、46、48、50、52、54、56、58、60、62℃。扩增结果
采用2.5%Agarose凝胶电泳进行检测。
1.5 PCR产物检测
以质量分数 2.5%琼脂糖凝胶电泳(Agarose
electrophoresis)和 6%聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE
electrophoresis)检测 PCR产物进行。应用设计好的
体系和程序,以NTCP40引物对15种材料的基因组
DNA进行扩增,以PAGE电泳检测为最终结果。
2 结果与分析
2.1 cpSSR-PCR反应体系的建立与优化
2.1.1 Mg2+、TaqDNA聚合酶、cpSSR引物的浓度
由图 1可见,当 Mg2+浓度为 1.25mmol/L时,cpSSR
扩增产物量极少,谱带微弱,不易观察;浓度在 1.5～
1.75mmol/L时,谱带模糊;在2.0～2.5mmol/L时扩增
谱带均清晰且稳定,无非特异性扩增。Mg2+确定为
2.5mmol/L。TaqDNA聚合酶用量在0.5～4.0U的范
围内均有扩增产物,且扩增条带的亮度、清晰度一
致,无明显差异,条带清晰、易于观察。从经济角度综
合考虑,本实验选择0.5U的TaqDNA聚合酶浓度
进行扩增。0.1~1.0μmol/L的引物,均可以扩增出条
带。0.1、0.2、0.4和0.6μmol/L引物的扩增产物条带
清晰,整齐明亮,便于观察。0.8和 1.0μmol/L的引
物扩增条带亮度稍暗。结合分辨率在80～500bp的
6%PAGE电泳检测发现,高浓度的引物会产生非特
异性扩增,杂带产生会影响对主带的分辨。从节约药
品的角度综合考虑,本实验选择正向和反向引物均
为0.1μmol/L进行扩增。
558
4期 甄 贞等:栗属植物cpSSR标记技术的建立与体系优化
图1 不同MgCl2、TaqDNA聚合酶和引物浓度下的
cpSSR扩增结果
1～6泳道:MgCl21.25、1.50、1.75、2.00、2.25、2.50mmol/L;7～11泳道:
TaqDNA酶0.5、1.0、2.0、3.0、4.0U;
12～17泳道:cpSSR引物0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0μmol/L
Fig.1TheamplificationresultsofcpSSRwithdiferent
amountofTaqDNApolymerase,diferent
concentrationofMgCl2andprimers
Lane1-6:MgCl21.25,1.50,1.75,2.00,2.25,2.50mmol/L;Lane7-
11:TaqDNAPolymerase0.5,1.0,2.0,3.0,4.0U;
Lane12-17:cpSSRPrimer0.1,0.2,0.4,0.6,0.8,1.0μmol/L
图2 不同dNTP、DNA模板浓度下的cpSSR扩增结果
1～5泳道:dNTP0.05、0.10、0.20、0.25、0.30mmol/L;6~10泳道:DNA
模板5.0、10、20、30、40mg/L
Fig.2TheamplificationresultsofcpSSRwithdiferent
concentrationofdNTPandtemplateDNA
Lane1-5:dNTP0.05,0.10,0.20,0.25,0.30mmol/L;Lane6-10:
templateDNA5.0,10,20,30,40mg/L
图3 不同退火温度下的cpSSR扩增结果
1～10泳道:44、46、48、50、52、54、56、58、60、62℃
Fig.3TheamplificationresultofcpSSRwithdiferent
annealingtemperature
Lane1-10:44,46,48,50,52,54,56,58,60,62℃
图4 引物NTCP40扩增15份材料的6%聚丙烯酰胺图谱
M:100bpladder;1.燕红;2.锥栗;3.台江大板栗;4.日本栗;5.野
板栗(贵州);6.苇甸无花;7.垂枝栗;8.罗田羊毛栗;9.板栗(湖
南);10.怀黄;11.红栗;12.罗田中迟栗;13.板栗(贵州);14.浅刺
大板栗;15.密云短花序芽变
Fig.4Bandingpaternsof15samplesin6%polyacrylamide
gelseparationwithNTCP40primerpairs
M:100bpladder;1.Yanhong;2Henry;3.Taijiangdabanli;4.Japanese
chestnut;5.Wildchestnut(Guizhou);6.Weidianwuhua;7.Chuizhili;
8.Luotianyangmaoli;9.Chestnut(Hunan);10.Huaihuang;11Hongli;
12.Luotianzhongchili;13.Chestnut(Guizhou);14.Qiancidabanli;15.
Shortcatkinsport
2.1.2 dNTP、DNA模板的质量浓度 由图2可以看
出,dNTP浓度为0.05~0.10mmol/L时,电泳条带细
且不清晰。0.20~0.30范围内可以扩增出清晰明亮、
易于观察的条带。本实验选择0.25mmol/L的dNTP
作为优化浓度。5个DNA模板浓度均扩增出清晰的
产物,条带亮度、粗细差别不明显。由于DNA在实验
过程中会发生降解而损失,因此,本着节约材料和不
影响实验结果的原则,本实验采用10ng/μL的DNA
模板进行扩增。
2.1.3 退火温度 由图 3可以看出,NTCP40引物
对的适合退火温度范围为52~58℃。低于50℃的扩
增条带暗淡,44℃条件无扩增产物。60℃以上扩增
主带逐渐模糊。对于NTCP40引物对而言,参考聚丙
烯酰胺凝胶电泳结果,选择56℃度为退火温度。
2.2 cpSSR引物的验证
以 PAGE凝胶电泳检测扩增结果,图 4为
NTCP40引物扩增15份材料的电泳结果。电泳条带
清晰,能够很好地进行检测和多态性分析。进一步证
明本实验体系适用于栗属植物cpSSR的扩增。
3 讨 论
3.1 cpSSR体系的构建
Mg2+的质量浓度对 PCR扩增结果影响很大,适
宜的浓度一般为0.5～2.5mmol/L[7]。Mg2+浓度过高,容
易生成非特异性扩增产物,背景干扰加强;浓度过低
则会降低扩增产率,甚至不能扩增出条带。TaqDNA
聚合酶浓度也是影响扩增结果的重要因素,过多不
仅增加实验成本,而且会引起非特异性扩增产物的
增加,过少会使 PCR的扩增量不足,常用浓度为
1.0～2.5U。引物与模板结合的程度和结合量是影响
扩增产率和稳定性的主要因素,引物浓度过高会引
起非特异性扩增,过低导致 PCR扩增量不足,不利
于结果的检测。dNTPs是靶序列扩增的原料,高于
50mmol/L时还会抑制TaqDNA聚合酶的活性[8],过
低则没能够完成预先设定的循环数就终止了,应选
择适宜浓度。较低的退火温度能够保证引物与模板
结合的稳定性,但也会使引物与模板产生错配,产生
非特异性条带;退火温度过高则会抑制引物与模板
的结合[9]。任何组分的量过多过少都会对实验结果
造成严重的影响,因此,在扩增结果相差不大的情况
559
下,尽可能选择药品使用量少、条带清晰的泳道。
3.2 cpSSR引物的应用
cpSSR因为具有操作简便、多态性高、重复性
强、通用性高和安全可靠的优点,已经迅速用于作物
种质资源研究,栗属植物中已用于欧洲栗。板栗
cpSSR引物开发才刚刚开始,本研究参考前人在其
他植物中所采用的方法,合成cpSSR通用引物并筛
选出适用于板栗资源的引物,主要目的是先建立起
板栗cpSSR技术体系。所用材料既有中国栗的特有
种,又有日本栗等栗属资源,在不同材料之间,所用
引物在本实验所确立的实验条件下,结果表现稳定。
一旦有更多的引物得到开发,cpSSR技术将在栗属
植物起源与进化等多个研究领域得到广泛应用。
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