全 文 ：新疆雪莲提取液预防小鼠卵巢早衰的初步研究
张 冀1，张曼曼1，王 军1，张贝贝1，杨 焕2，庄淑珍1* ，张晓红2* (1．新疆大学生命科学与技术学院，新疆生物资源基因工
程重点实验室，新疆乌鲁木齐 830046;2．新疆农业大学动物医学学院，新疆乌鲁木齐 830052)
摘要 ［目的］初步探讨雪莲提取液调控雌性小鼠生殖生理的机制，为天山雪莲作为女性美容保健用品以及临床预防和治疗妇科疾病提
供理论依据。［方法］选择 60只性周期正常的小鼠，随机分为试验组和对照组，每组 30只;分别于每天 12: 00灌胃 0． 5 ml雪莲提取液和
浓度0． 9%生理盐水，采用阴道脱落细胞涂片观察小鼠性周期变化，并提取双侧卵巢组织ＲNA，采用ＲT － PCＲ分析卵巢中 Pten和 FoxO3
基因的表达情况。［结果］试验组和对照组的小鼠性周期紊乱率分别为 50． 0%和 76． 7% ; FoxO3和 Pten基因在试验组小鼠卵巢中的表
达优于对照组小鼠。［结论］雪莲提取液对连续光照造成的小鼠卵巢早衰现象有一定的预防作用。
关键词 雪莲( Saussurea involucrata) ;卵巢早衰; Pten基因; FoxO3基因
中图分类号 S567 文献标识码 A 文章编号 0517 －6611( 2013) 26 －10622 －02
Preliminary Study on the Saussurea involucrata Extraction in Preventing Premature Ovarian Failure of Mice
ZHANG Ji et al ( Xinjiang Key Laboratory of Biological Ｒesources and Genetic Engineering，College of Life Science and Technology，Xin-
jiang University，Urumqi，Xinjiang 830046)
Abstract ［Objective］To explore the controlling mechanism of reproductive physiology with Saussurea involucrate，preliminarily and provide
theoretical basis for the Saussurea involucrate in prevention and treatment of gynecological diseases and as beauty care products for women．
［Method］60 mice with normal estrous cycle were randomly divided into experimental group ( 30 ) and control group ( 30 ) ． Then the two
groups were taken 0． 5 ml Saussurea involucrata extraction and 0． 9% NaCl by intragastric administration ( ig) ，respectively． Changes of period
sexual cycle was observed by vaginal exfoliate cell smears． The total ＲNA was extracted from ovaries and the Pten and FoxO3 gene expression
was analyzed by ＲT － PCＲ． ［Ｒesult］Periodic disturbance ratio of experimental group and control group was 50% and 76． 7%，respectively．
And the expression of FoxO3 and Pten genes in ovaries of experimental mice were better than the control ones，too． ［Conclusion］There is a
certain preventive effect of Saussurea involucrata extraction on POF of mice caused by continuous light．
Key words Saussurea involucrate; POF; Pten gene; FoxO3 gene
基金项目 新疆生物资源基因工程重点实验室开放基金( XJDX0201-
2010-08) ; 新疆大学博士基金 ( 07020428028 ) ; 新疆大学
2013 年度大学生创新训练计划 ( 一般 ) 项目 ( XJU-SＲT-
13062) ;新疆农业大学校前期资助课题( XJAU201109) 。
作者简介 张冀 ( 1991 － ) ，男，河南邓州人，本科，专业: 生命科学，E-
mail: 153315267 @ qq． com。* 通讯作者，庄淑珍，E-mail:
zhuangshuzhen@ 126． com。* 通讯作者，张晓红，E-mail:
zxh19680909@ sina． com． cn。
收稿日期 2013-07-28
卵巢早衰 (Premature ovarian failure，POF)是指多因素
所致的卵巢功能过早衰竭，是妇科内分泌领域的常见疾病之
一。近年来其发病率逐年增高，国内外报道在育龄期女性中
的发病率为 1． 0% ～3． 8%［1 －2］。该病可导致不孕、更年期症
状提前、骨质疏松、动脉粥样硬化及糖尿病等并发症。随着
人们生活水平的提高，女性的生殖健康受到越来越多的重
视，有关 POF的研究也越来越多，但其发病机制仍不清楚，临
床上主要采取激素替代治疗，但效果不佳，所以有效预防卵
巢早衰是行之有效的方法。
天山雪莲(Saussurea involucrata)是一种高原多年生珍稀
草本植物，含有丰富的生物活性成分、营养成分和矿物质，药
用与食用价值非常高，是新疆特有的珍奇名贵中草药。研究
表明，雪莲的有效成分主要为黄酮类化合物和多糖，药理作
用主要有抗炎、抗肿瘤、镇痛、强心、增强人体免疫力、抗疲劳
和抗衰老等［3］。前期预试验发现，给雌性小鼠口服雪莲能明
显预防 POF现象。因此，笔者探讨雪莲提取液调控雌性小鼠
生殖生理的机制，以期为天山雪莲作为女性美容保健用品以
及临床预防和治疗妇科疾病提供理论依据。
1 材料与方法
1． 1 材料
1． 1． 1 研究对象。雪莲提取液，为天山雪莲的醇提液，由新
疆农业大学完成生物资源基因工程重点实验室提取。
1． 1． 2 动物。7 ～8周龄昆明白小鼠，雌性，体重 20 g左右，
购自新疆医科大学实验动物中心，动物使用许可证号:SYXK
(新)2010 － 0003;动物生产许可证号:SCXK(新)2010 －
0001。
1． 1． 3 主要试剂。Taq 酶、反转录酶和 DNA Marker，购自
TaKaＲa公司;TＲIzol，购自 Invitrogen 公司;弗氏完全佐剂
(CFA) ，购自 Sigma 公司;小鼠血清 FSH、E、LH 酶联免疫分
析(ELISA)试剂盒，购自武汉基因美生物科技有限公司;小
鼠 ZP3抗原粉剂和 PCＲ引物，由上海生工公司合成;其余常
用试剂均为国产分析纯，市售。
1． 2 方法
1． 2． 1 多肽合成及 PCＲ引物设计。取小鼠 ZP3 抗原粉剂，
序列为 Asn － Ser － Ser － Ser － Ser － Gln － Phe － Gln － Ile －
His － Gly － Pro － Arg［4］。根据已发表的小鼠 FoxO3(GenBank
No． NM_019740． 2)和 Pten (GenBank No． NM_008960． 2)基
因序列设计引物，引物序列和预期片段大小如表 1，另合成一
对看家基因 HPＲT基因引物作为对照。
表 1 合成的小鼠 FoxO3和 Pten基因引物
引物
名称
引物序列
预期片段
大小∥bp
Pfoxo3 －1 /Pfoxo3 －2 5-TCACACTACGGCAACCAGAC-3 582
5-CCACATTCAAACCAACAACG-3
Ppten －1 /Ppten －2 5-TAACGATGGCTGTGGTTGC-3 574
5-GATGCTTTGCTTGGAAGGA-3
HPＲTS /HPＲTA 5-GTTGGATACAGGCCAGACTTTGTTG-3 352
5-GAGGGTAGGCTGGCCTATGGCT-3
责任编辑 石金友 责任校对 况玲玲安徽农业科学，Journal of Anhui Agri． Sci． 2013，41(26):10622 － 10623，10656
DOI:10.13989/j.cnki.0517-6611.2013.26.083
1． 2． 2 小鼠的饲养。取昆明白雌性小鼠，用无病菌的食物
和水喂养，饲养条件为恒温(24 ℃)、恒湿(60%)、自然昼夜
节律光照，给予足够的水和食物。
1． 2． 3 小鼠 POF模型的制备。将小鼠适应性饲养 1周后，于
每天早 10:00和晚 22:00取阴道脱落细胞涂片 1次，持续 2周，
选择性周期正常的小鼠随机分为 3组:POF试验组、佐剂对照
组、空白对照组，每组 10只，编号。将 3组小鼠的光照时间改
为 24 h，POF试验组小鼠双侧后脚掌掌心处皮下注射 0． l ml
CFA －ZP3混合液(每侧0． 05 ml);佐剂对照组同法注射CFA －
双蒸水混合液 0． l ml;空白对照组不作任何处理。注射后继续
取阴道脱落细胞涂片观察小鼠性周期变化，持续 2周。
1． 2． 4 雪莲提取液对雌性小鼠 POF的预防。小鼠的饲养
同“1． 2． 2”。选择性周期正常的小鼠随机分为 2 组:试验组
和对照组，每组10只。试验组小鼠每天12:00灌胃雪莲提取
液 0． 5 ml，对照组同法灌胃 0． 5 ml浓度 0． 9%生理盐水。从
第 8天起取阴道脱落细胞涂片观察小鼠性周期变化，每周连
续 6 d，休息 1 d，两周后颈椎脱臼法处死小鼠并取双侧卵巢
组织，用于提取 ＲNA。
1． 2． 5 小鼠血清 FSH、E、LH酶联免疫分析(ELISA)。于小
鼠眼眶采血，获取血清，ELISA分析按试剂盒说明书进行。
1． 2． 6 总 ＲNA的提取及 ＲT － PCＲ。CＲA录盒说明书分离
卵巢组织，Trizol提取总 ＲNA;按反转录试剂盒说明书进行反
转录，获得 cDNA。PCＲ反应条件为:95 ℃，4 min;95 ℃预变
性 1 min;55 ℃变性50 s;72 ℃退火1 min;共35 个循环，72 ℃
延伸 5 min。
1． 2． 7 统计学处理。试验数据采用 Prism 5． 0 统计软件进
行处理。两组之间采用独立性检验进行分析，P ＜ 0． 05 为差
异显著，有统计学意义。
2 结果与分析
2． 1 小鼠 POF模型的制备 经连续不断的光照，3组小鼠
在第 2周均出现不同程度的 POF指征，表现为精神萎靡和皮
毛光泽度下降等。阴道脱落细胞涂片观察发现，3 组小鼠均
出现了不同程度的性周期紊乱(表 2)。佐剂对照组和空白
对照组的紊乱率与 POF 试验组相比，差异不显著(P ＞
0． 05) ，表明连续光照加以其他干扰刺激可以促进小鼠卵巢
早衰的发生。鉴于试验的是探讨雪莲能否预防卵巢早衰，而
作息时间不规律是影响现代女性身体健康的最主要因素之
一，因此为使研究更贴近生活，后续试验均选择对不作任何
处理的小鼠连续光照。
表 2 连续光照对小鼠性周期的影响
组别 数量 性周期正常
性周期紊乱
性周期
延长
性周期
停滞
无明显
性周期 合计
性周期
紊乱率
%
POF试验组 10 0 0 8 2 10 100
佐剂对照组 10 2 0 0 8 8 80
空白对照组 10 2 2 2 4 8 80
2． 2 雪莲提取液对雌性小鼠 POF的预防
2． 2． 1 雪莲提取液对小鼠性周期改变的影响。通过对试验
组和对照组小鼠阴道脱落细胞涂片观察可知，两组小鼠性周
期紊乱的比率分别为 76． 7% 和 50． 0%，差异显著(P ＜
0． 05) ，表明口服雪莲提取液对雌性小鼠卵巢早衰现象有一
定的预防作用(表 3)。
表 3 雪莲提取液对雌性小鼠卵巢早衰的预防作用
组别 数量 性周期正常
性周期紊乱
性周期
延长
性周期
停滞
无明显
性周期 合计
性周期
紊乱率
%
对照组 30 7 11 3 9 23 76． 7
试验组 30 15 4 6 5 15 50． 0
2． 2． 2 雪莲提取液对小鼠 FoxO3 和 Pten基因 mＲNA 水平
表达的影响。分别提取小鼠卵巢组织总 ＲNA，反转录得到
cDNA后检测 FoxO3和 Pten基因在 ＲNA水平的表达。ＲT －
PCＲ结果显示，与 HＲPT 基因比较，动情周期正常的小鼠
FoxO3和 Pten基因均有表达，动情周期延长和停滞的小鼠
FoxO3基因弱表达，Pten 基因正常表达;无明显动情周期的
小鼠 FoxO3基因弱表达，Pten基因几乎无表达(图 1)。由表
4可知，试验组小鼠 FoxO3基因和 Pten基因的表达情况明显
优于对照组。
注:M． DL2000DNA Marker;1．动情周期正常小鼠卵巢 FoxO3 的表
达;2．动情周期正常小鼠卵巢 Pten的表达;3．动情周期延长小
鼠卵巢 FoxO3的表达;4．动情周期延长小鼠卵巢 Pten的表达;
5．动情周期停滞小鼠卵巢 FoxO3 的表达;6．动情周期停滞小
鼠卵巢 Pten的表达;7．无明显性周期小鼠卵巢 FoxO3 的表达;
8．无明显性周期小鼠卵巢 Pten 的表达;9． FoxO3 阴性对照;
10． Pten阴性对照。
图 1 FoxO3和 Pten基因在不同状态雌性小鼠卵巢表达的 ＲT －
PCＲ结果
表 4 雪莲提取液处理后 FoxO3基因和 Pten基因在小鼠卵巢中的表达
组别 数量 FoxO3表达 Pten表达 Foxo3和 Pten同时表达
对照组 30 12 11 7
试验组 30 6 9 15
3 结论与讨论
模型研究是深入探讨 POF疾病发生和发展机制的必要
条件，目前以小鼠为对象进行预防性卵巢功能早衰研究的资
料很少。基于环境和精神心理因素成为现代女性 POF发生
的主要原因，试验采用对雌性小白鼠连续光照模拟现代女性
经常熬夜、作息时间不规律等生活习惯，成功获得了卵巢早
衰的小鼠模型，为探索雪莲作为保健用品预防女性卵巢早衰
的可能机理提供了保障。
将雪莲作为治疗妇科的良药和预防妇科疾病以及美容
等古已有之，但其具体机理鲜有报道。试验结果表明，试验
( 下转第 10656页)
3260141 卷 26 期 张 冀等 新疆雪莲提取液预防小鼠卵巢早衰的初步研究
少。世界卫生组织建议每人每天允许摄入的 Cd量为 57 ～71
μg。文蛤闭壳肌中的 Cd虽然较内脏团要少得多，但也要经
过一段时间的消除净化其含量才能降低，这样的文蛤闭壳肌
只要一次性摄入不是太多，基本上是安全的。但是，文蛤内
脏团中 Cd的消除能力比闭壳肌小，即使经过较长时间的消
除净化，Cd残留量仍然很高，对人的身体健康仍然会产生威
胁，因此建议尽量减少文蛤内脏团的食用量。
研究表明，重金属在水产动物体内各组织富集量差异显
著，肾脏、肝脏等都是重金属的重要靶器官［9 －11］。据报道，一
般重金属污染物是集中在动物或人的肝脏或肾脏中，而肌肉
中重金属的含量相对较低。Can Li 等［12］试验表明挪威龙虾
不同组织的汞含量次序为:鳃 ＞卵 ＞内脏 ＞卵巢 ＞闭壳肌。
朱玉芳等［13］研究表明克氏原螫虾各器官对 Cd 的富集作用
为:鳃 ＞肝 ＞足肌 ＞腹肌。因此，在水生动物中，肌肉中重金
属的含量相对而言是较低的。
该试验所用的消除代谢时间虽然较短，从食用安全性角
度看，这也是符合上述结论的。据此推测，随着消除时间的
延长，文蛤闭壳肌和内脏团中 Cd含量将会有显著降低，且由
于闭壳肌的代谢与富集速率的比值大于内脏团，所以相对于
闭壳肌内脏团中 Cd含量的消除能力较小，更需较长的消除
时间进行代谢，其含量才有可能会减少至与闭壳肌中的含量
相当。
王凡等［9］在栉孔扇贝对 Cd的富集和消除试验中发现，
11 d后栉孔扇贝鳃和肌肉对 Cd 的排放率都达到了 65%以
上。在 Cd污染较为严重的海区养殖的文蛤收获前一段时间
在洁净的海水里养殖并肥育一段时间对于减少 Cd等重金属
污染是十分有效的，即收获后需经较长时间的消除净化才能
被安全食用。
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11 －12．
( 上接第 10623页)
组和对照组均有不同数量的小鼠发生性周期紊乱，但是试验
组小鼠的性周期紊乱率明显低于对照组，表明口服雪莲提取
液可以有效缓解外界不良环境对雌性机体的刺激，从而降低
对小鼠卵巢的损伤。
在分子水平上，试验通过 ＲT － PCＲ 的方法检测 FoxO3
和 Pten基因在动情周期正常和异常小鼠中的表达情况，与文
献报道的结果有相似性，但是为什么动情周期异常的小鼠 2
种基因表达不一致还有待进一步的研究。研究表明，FoxO
蛋白在哺乳动物生殖发育中发挥重要作用，FoxO3 基因可能
对哺乳动物早期卵泡发育调控的作用非常关键，是哺乳动物
卵泡发育的重要调节因子。缺失 FoxO3a的雌性小鼠均具有
特征性的卵巢表型即球型卵泡激活，从而导致卵母细胞死
亡、卵巢功能早期衰竭及继发性不孕的发生［5 －7］。PTEN 是
一种脂质磷酸酶———去磷酸肌醇磷脂，并作为 PI3K 的主要
负调节因子发挥作用。研究表明，删除小鼠原始卵泡卵母细
胞的 Pten基因，运用转基因小鼠生长分化因子 9(GDF － 9)
启动子来表达 Cre重组酶，最终导致整个原始卵泡池过度激
活，从而使所有的原始卵泡过早耗竭。近年研究表明，调节
原始卵泡募集基因 Pten和 FoxO3等表达缺失或者突变可直
接导致原始卵泡池的耗竭加速，最终导致卵巢早衰加速［8］。
试验结果表明，以雪莲提取液对经连续光照刺激的小鼠灌
胃，发现雪莲提取液可以维持 FoxO3 和 Pten 基因在小鼠卵
巢中的表达，从而保护小鼠卵巢机能，延缓小鼠由于持续光
照造成的卵巢早衰，对卵巢早衰起到一定的预防作用。
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