全 文 ：66 3
. 中国中医药科技1 梦关 )年第6 卷6 期
旋复花汤对肝纤维化 、 肝窦毛细血管化
逆转作用的实验研究
陆 雄 顾宏图 卢 红 庞惠芳 朱龙英
(上海中医药大学 ·上海2 X (3 X )2 )
摘 要 运用DM N大鼠肝纤维化模型 , 通过 H . E 、胶原染色、 免疫组化 、 电镜等病理形态学方法观察旋
复花汤治疗大鼠肝纤维化和肝窦毛细血管化 的作用 。 结果发现旋复花汤能有效阻断大鼠肝纤维化和肝
窦毛细血管化的形成证明活血化癣为主方药治疗肝纤维化的有效性 ,提示 ( l) 肝纤维化过程中有“ 血癣 ”
之存在 。 ( 2 )肝窦毛细血管化可能是肝纤维化“ 血瘫 ”证的一 个重要环节。
主题词 肝硬化 / 中医药疗法 @ 旋复花汤 /中医药疗法 肝硬化 / 病理学 肝硬化 / 超微结构 大鼠
旋复花汤是《金匾要略》活血化疲法治疗 “ 肝着 ” 的
经典处方 , 临床运用旋复花汤加减治疗血痕型肝病有
一定的疗效 l[] ,但其是否通过化痕抗肝纤维化 ,尚缺乏
实验 依 据 。 本 课 题 以 二 甲 基 亚 硝 胺 ( 曲讹 t h y li int -
t心。 , , DM N )腹腔注射造成大鼠实验性肝纤维化 , 通
过一系列病理形态学观察 , 研究旋复花汤 对大鼠肝纤
维化和肝窦毛细血管化的逆转作用 。
1 实验材料
1
.
1 动物 W ist ar 雄性大鼠 (购自上海中医药大学动
物中心 ) 2 7 只 , 体重 130 一 250 9 。
1
.
2 主要试剂 二 甲基亚硝胺 ( id l l祀 t lilr in t 、 ~ ne ,
D MN)
,瑞典威灵公司产品。 兔抗人第 8 因子相关抗原
多克隆即用型抗体以及 阴性对照试剂 , 大阪市立大学
山本隆嗣博士惠赠 。 免疫组化 ~ is on 试剂
, 上海中达
医学应用研究所提供 。
1
.
3 旋复花汤的 .aJ 量换算和制备 旋复花汤制备按柯
氏川等所考证的计量换算数据 , 每剂取旋复花 铭 g , 葱
or 根 , 用茜草 1崛 取代新绛少 许 , 水煎浓缩 , 按人 和 动
物间等效计量换算方法匡折算大鼠服用剂 量。
2 实验方法
2
.
1 造模方法
造模 前 按 每 DM N335 u 和 or . 巧M Nac l 稀 释 至
肠 . 96 而 的 比例配成腹腔注射液备用 , 每 W 连续 3d , 给
大鼠腹 腔 注射上 述 DMN 稀释液 0 . Zm L/ 10 9 鼠重 , 共
4w
一
3〕。
2
.
2 分组及治疗
除正常组外 , 模型 动物从造模之 日起随机分为两
组 , 分组情况 如下 : 正常组 6 只 , 从第 4W 起每 d 灌用生
理盐水 Z x】亩 10 9 鼠重 , 共 4 w 。 模型对照组 or 只 , 从第
4 w 起每 d 灌用生理盐水 Zn l L/ 10 9 鼠重 , 共 4 w 。 治疗
组 1 只 , 从第 4 W 起 , 每 d 灌用旋复花汤浓缩液 21 方
10 9 鼠重 , 共 4 W。
2
.
3 指标检测 方法及判定标准
2
.
3
.
1 肝脏 EH 染色及胶原染色病理观察 第 SW 后 ,
所有大鼠用 乙醚麻醉 ,断头处死 , 取肝左叶经常规固
定 , 石蜡包埋 , 切片厚度为 5脚 ,分别作 EH 和胶原染色
(武兆发改良的 Malo yr 氏法 )在光镜下 ,观察肝组织纤
维化程度及细胞的病理变化 , 并参照有关文 献闭 制定
肝组织胶原增生 半定量判断标准 。 正 常肝脏 : 无明显
胶原纤维增生 。 + :胶原纤维增生 , 中央 静脉和门脉区
有少量星 状胶原纤维束放散延伸 , 但无间隔形成 。 +
十 :胶原纤维增 生 , 中央静脉和门脉区结缔组织变厚 ,
由此向四周伸出纤维索 , 形成不完全间隔 。 十 + 十 :胶
原纤维大量增生 , 有个别菲薄的完全间隔形成 ;或较厚
的不完全间隔即将形成假小叶 。 十 十 十 十 : 完全间隔
较厚 , 假小叶大量形成 。
2
.
3
.
2 第 8 因子 相关抗原免疫组化观察 取上述石蜡
标本 , 免疫组化染色过程用 Evn is on 试剂两 步法 , D AB
显色 , 甲基绿染核 , 封片 。 染色过程中 , 用第 8 因子阴性
对一照试剂代替一抗作阴性对照 , 参照高氏等圈 的方法 ,
制定如下镜下免疫组化阳性半定量标准 : 一 : 肝血窦内
皮细胞胞浆不着色 。 十 : 肝血窦内皮细胞被染成黄褐
色或黄褐色颗粒 , 但被染的血窦数占总数的 25 % 以下
( or 倍目镜 , 20 倍物镜 ) 。 十 十 : 被染的血窦数占总数的
25 %
一
50 %
。 十 十 + :被染的血窦数超过总数的 50 % 。
2
.
3
.
3 电镜观察 取正 常组 l 例 , 模型组 2 例 ,治疗组
2 例 ,按电镜制样要求取材 、 固定 、 超薄切片和染色 、透
射电镜观察并照相 。 着重观察肝窦窦壁结构 。
2
.
4 统计方法 计数资料用 凡 idt 检验法 。
3 实验结果
l望珍年第 6 卷 6 期 中国中医药科技 36 7
3
.
I HE 和胶原染色 正常组大鼠肝细胞未见变质性
改变 ,无明显胶原纤维增生 。 模型组和治疗组大鼠只
有个别肝细胞发生浊肿 , 点状坏死灶少见 ,但两组胶原
纤维形成量差异明显 ,具体程度见表 1
表 1 模型组和治疗组胶原形成量 比较
组别 肝组织 中胶原形成量
I石击 t分析
模型组
治疗组
+ + + + + + + + + + P值
{0 0 3 6 1
十 + 十 十 十 十 + +
. ~
-
~ 一 ~ . ` 一 .一一一一 ,一 - ~ . ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ , ~ ~ ~ ~ ~ , , ~ ~ ~ 叫. . . . ~ 目,一 ~一
11 2 7 2 < 0
.
05
3
.
2 第 8 因子相关杭原免疫组化染色 阴性对照染色
未见非特异性阳性灶 。 正常组大鼠阳性灶仅出现于中
央静脉和汇管区血管壁 , 肝窦未见 阳性灶 。 模型 组阳
性染色除出现在 中央静脉和汇管区血管壁外 , 许多肝
窦被染成黄褐色 ,且范围较广 。 而治疗组大鼠肝窦第 8
因子阳性范围要轻于模型组 , 见表 2 。
表 2 模 型组和治疗组肝窦第 8 因子表达程度比较
组别 第 8 因子抗原表达 凡山
t 分析
P值一 + + + + + + r I IL
模型组
治疗组 ( O 、 05
3
.
3 电镜观察 正常组大鼠肝窦内皮细胞外周胞浆很
薄 , 有许多小窗孔 , 内皮下未见 明显基底膜 。 模型 组大
鼠表现为肝窦内皮细胞胞浆窗孔数减少或消失 , 有的
部位可见窗孔处有一薄膜连接 , 有程度不等的连续性
基底膜出现 。 治疗组肝窦内皮窗孔减少和 消失程度较
模型组轻 , 基底膜出现程度也较薄 。
4 讨论
4
.
1 肝纤维化 、 肝窦毛细血管化和肝血瘫证
肝纤维化是致病因子持续 、 反复导致肝损伤所致
细胞外基质大量沉积的后果 , 肝纤维化形成过程中一
个关键的病理环节就是发生肝窦毛细血管化 。 正常肝
窦结构特殊 , 其内皮细胞松散连结 , 有 l o nr 左右大的
窗孔 , 内皮下无连续的基底膜 。 这一结构是保证血液
与肝细胞间正常物质交换的组织学基 础 。 肝窦毛细血
管化是指肝窦的内皮细胞表型 发生改变 , 正常内皮的
窗孔数减 少或消失 , 内皮下 出现完整的基底膜 。 这一
病理改变阻碍 了肝细胞从狄氏 间隙摄取氧和营养物
质 , 加重 了肝细胞的损伤 , 同时造成肝 内血流阻力加
大 ,在肝硬化的发 生 和门脉高压 的形成上 意义 重大 。
许多学者认为五 , 从这一 角度出 发治疗肝硬化潜力很
大 。
肝纤维化是西医学病名 , 按其临床症状 , 祖国医学
可能将其归人 “ 积聚” 、 “ 黄胆 ” 、 “ 胁痛 ” 、 “ 疲证 ” 、 ’ ` 瞰胀 ”
等范围 。 至于其病机 , 有学者认为与血癖有密切关系 。
近来 ,有学者通过肝纤维化病人血液流变学的研究 , 明
确提出血僚表现在慢性肝病病理上即是肝纤维化的形
成 ,肝纤维化是肝病血癖证侯产生 的直接原因川 。 还
有学者观察 了慢性肝病血疲证患者血中层粘连蛋白
(NL )
、透明质酸 ( 1认 )的含量 , 结果显示血痕证患者 NL 、
11A 含量显著高与正常人和非血癖证者 。 另外 ,第 8 因
子相关抗原升高也和血疲证有一定关系 。 晚近 , 国外
许多研究相继阐明了 NL 、 1.A[ 是反映肝窦毛细血管化的
几个重要客观依据 。 第 8 因子相关抗原是毛细血管内
皮细胞的一个标志 , 但其在正常肝窦内皮细胞不表达 ,
因而第 8 因子相关抗原表达与否是判断肝窦毛细血管
化的又一客观指标 。 这些研究结果提示了肝窦毛细血
管化可能是肝纤维化血痕证的根本 。
4
.
2 旋复花汤抗肝纤维化 、 肝窦毛细血管化的作用
旋复花汤是《金匣要略》活血化癖法治疗 “ 肝着 ” 的
经典处方 ,方 中旋复花行气活血通络 , 茜草活血化癖 ,
葱茎温 阳 。 临床运用旋复花汤加减治疗血痕型肝病有
一定的疗效 ,但其是 否通过化寮逆转肝窦毛细血管化 、
改善肝脏微循环 , 从而抗肝纤维化尚缺乏实验依据 。
据报道 D MN 诱导的大鼠肝纤维化模型 , 主要损伤
肝窦 ,从而导致肝窦毛细血管化 ,这种模型有利于观察
活血化寮中药对损伤肝窦的逆转作用 , 从而为化疲法
治疗 “ 血痕 ” 证肝纤维化提供实验依据 。
本课题运用病理组织学 、免疫组化 、 电镜等方法对
旋复花汤抗肝纤维化和肝窦毛细 血管化进行了实验研
究 。 结果发现 : 治疗组大鼠肝组织中胶原形成量明显
减少 , 与模型组比较差异明显 。 说明旋复花汤有抗实
验性肝纤维化的作用 。 另外 , 电镜观察发现对照组大
鼠肝窦内皮细胞间窗孔数减少明显 , 内皮下有连续性
基底膜出现 , 其肝窦毛细血管化程度重 于治疗组 。 第 8
因子相关抗原免疫组化染色也进一 步证实了这一点 。
说明了旋复花有抗肝窦毛细血管化的作用 。 活血化窟
法抗肝纤维化和肝窦毛细血管化的有效性 , 提示 了肝
纤维化过程中 “ 血寮 ” 之存在 , 也从另一侧而揭示 了肝
窦毛细血管化可能是肝纤维化 “ 血窟 ” 证的根本 , 有待
进一步作深入研究 。
参考文献
l 柯学帆 , 等 . 上海中医药杂志 19 8 3 ; ( 12 ) 36
2 徐 淑云主编 . 药理实验方法学 , 人民 I几生出版社 19 8 2口 184
3 1 ,su k绷 )t。 ) H e t 己 . A酬 i眯 , C m l n asr i n lietr d isea
.
l侧X】; 10 : 20
4 徐 列明 . 上海 中医药大学博 士论文集
5 高绪兰 , 等 . 中华病理学杂志 1卯3 ; 2 ( 4) : 24 1
6 Hi e k叮 一 P I . G as tn 吧n t e ro l吧 l侧拓 ; 1 11 (4 ) : 10 3 9
7 沈洁云 ,等 . 辽宁中医药杂志 1卯 7 ; 24 ( 6) : 24 3
( 19英)年 2 月 19 日收稿 )
di 玉e n r te i c c d o ton s
.
e M th
以` : A 而币m l ac lln age ne pl 州石。 sn y 山旧me th a tw s asi n 五l r a o t11切n n a’ 5 w s ai n dc u 司b y a d而卿℃i 九
( AR D )i n r a tw s a
切山e n n l 以儿l .
h T e I s a te w
二 倒记。叫yi v d翻i n o ti f ve , sup :加加习 c o n加 l , ne PI创 t i c c o l l tDI I , het gor ups 比日住 d
初山
~
gn , 刀堵 , dec oc 丘on , p rD lr 幻 it gn b l仪妇 ic m山 it on d ce co l ion an d一gn 少留移 ot rP叨以 e b] 以妇 ic 几d区石on dceo 石即 .R e s己st : 山e花 ~ a c~ d e口 b卜 c卜出唱 e on PJ or t e in 面 a , u耐 il iP d , P l aS naI d试` 肠 x an e 巧 (饮几 ) and er l过 iles ons in eatr -曰 初ht
~
ng 〕留堵 ot p or lno t e b l以刁 ic 二 ul iat on d e e oc it on ,咖le t he ~ gn
, . l g d以二oc it on aws ab l
e ot i m p or
v e b】以刁 il户d ,
p l朋ma t肠旧 n」琳an e 巧田记 er 耐 les ion ,朋d p or l l以 ign b k阅d ic 二 ld a t io n dce co t i on o司y 砰叮曰 a or le in e llan ge o of 州 gl y俘ir de a n d
eI 耐 les i0 I均 .
C
o n e il 玲ion :
~
gn ,留呀 ot p or n犯 t e bl仪刁 ic 二滋iat on 故倪 t ion co咖 al 一 is dler 晚 at 叱 p l眼 15 i n d u e记 场 哪的助砂d左 , het
C份a t l v e e任ce t ~ het 比 st an l o n g t l此 e dce co t ions
.
L A BO RA
l
l D R Y ST UD Y O N AN lT l VE R FI B R OS IS A N D A N IT S IN U S O ID
C API L L AR IZ A T ION O F X乙A八子石厅乙减 D EC O CIT O N
肠 儿 o n g , e t al
f 弘。 。峭成 r阮介 , 、 如了几】夕_ 弘。 ” 硒越 交详幻3卫)
nI o ld e r ot
~
h het ft
u l c
it on of Chi
n e se h e r sb 沁 u刀功J i` de喇 ion atP h o l哈 c an d hi solt q夕c l n e t场dS , s cu h as EH 而 n -
ign j
n助 l in o l云st ` 】祀而 s t yr 、 田 ld el 。 改 or l l it c n艾犯 o pe we 二 1洲刃 ot o b se vr e X i四沂访au dce co t i on p er V e n t ign il ve r 五b阴 15 an d is
~
d
份 pl l面azt i on ius gn l)MN he P a it c 五IJ联 15 m de e l of art .
竹屺 政 t il t s hso w de 幻瓜叻功边川 触佣6 on co d d e玉 ict ve ly iihn ibt e x pe ir n祀 I l tal h e Pa it e if bosr is a n d si~ d
o
ian l颐 iazt on . 月
d les 1
11(】e a t记 that p~ o t i gn b l似1 ic o ul iat on ot er ~
st as is dce co it on ~
e压戈 it 、 fo r het 能叻刀朋 t of il ver if b明 15 .
1盛 B ORA T OR Y STU DY ON T HE E F FE C T O F F L AM M U l N A V E LU IT P ES
PO L Y SA C C HRI DE O N 升认 N S P LA IT ON TUM OR IN M O U S E
Y a n M ao 一 x i a嗯 , e t al
(头 八皿了月崎〕蒯 of hZ 咖 nZ g 乃侧 Jin c e , 从功洲幽乙 3 1以】拍)
Obj ce it ve
: nI o找】e r ot ivne ist g aet het e玉 ct on t~ 禅iat on t
t川 10 r of VF PI
,剧几 , F V3P hiw hc , d眠 址汕 of se arP a tio n s ub -
st
~
丘明】 月油彻之迈` ￡朋 vle 理匆” 儿勺,献入瓜似 ( Fv p ) .
eM
t l目如 : c el s iatr n sl 的 a n d 肠 ~ i , td a t己 ir hg t一 s u】犯范 Ua行ny for the 而 ce we er inj ce det int aT 一 pe ir t o r启川 y iwt h
D用 1汪丫几 ,卿马 esr 伴 c t ive ly at let dos age of s 、 or 、 20 I n岁吨 · d , or day s la t e r , ilet 而 ce we le ~ ut de adn t
L川 lo r we er extI’a c det ,
此n het t~ 卜 而五ib iot n aert c o 川d 晚 阅 cl il a et d
.
EAC ~
i~ ul
a艰e d int ar 一 pe ir t o n eal l y for 而 ce , het r n e d iic ne jus t il ke 目x ” er
~ inj ce
t记 5 111℃ talt
~
卜 or days al etr , het s~ val ist au it o of 而 ce ~ 司
〕货钾以】,
~
t l』al y
,
ht e ex t
e r l山飞 ar et of ht e 而 ce
s山 、 ival it n l e s
.
c o zdd 玩 c司c ul at ed
R
e s d st : 叨屺 vae r ag e t~
一
inl 五ibt io n o et s on sl 即 朋d 呢 * er 目” v e 30 % , 。山e丽 se FV I、 on 振 . tha t城 e s』粥 t田 Ice s
c o u l d ex et nd t h
e s山 , I v司 it lne on EAC
.
Co n e lu s ion J 勺甲1 ,卿巧 ,别马 hva e the e fe e st of er p o is ng on 茹d t~ lS 即朋d 梅
, 朋d ext 诫 gn ht e ~ val it lne of而沈 杭 ht unt lor , F VP h as the d 坦激 t e ir ist c of we n ant i 一 t~ r ac it vi yt
.