全 文 ：甲基紫与苋菜红相互作用的
双波长共振光散射比率光谱研究及其分析应用
张国文 , 蒋　婷 , 王安萍
(南昌大学食品科学与技术国家重点实验室 , 南昌 330047)
摘　要:应用双波长共振光散射比率法(DW-RLS)研究了甲基紫与苋菜红之间
的相互作用 。在 pH 1.24的乙酸钠-HCl缓冲溶液中 , 甲基紫和苋菜红本身的共
振光散射(RLS)信号均很弱 , 但是当它们相互作用形成缔合物时 , 导致 RLS 信
号明显增强并出现新的 RLS光谱 , 适当浓度的 Triton X-100存在使结合反应敏
化 , 缔合物最大散射峰位于 528 nm , RLS 信号强度与苋菜红的浓度呈线性关系。
通过测量 528 nm 处的 RLS 强度或两个波长处 RLS 强度比值(I417 I343), 可对苋
菜红进行定量检测。当溶液中甲基紫的浓度为1.54×10-5 mol L时 , RLS法测定
苋菜红的线性范围和检出限分别为 0.05 ～ 0.50 μg mL 和 0.02 μg mL , 而 DW-
RLS 法的线性范围和检出限分别为0.01 ～ 0.60μg mL和 1 ng mL , 与 RLS法相比
较 , DW-RLS法受酸度 、离子强度等环境条件影响较小 , 并且有更宽的线性范围
和更低的检出限 。
关键词:共振光散射;双波长比率;甲基紫;苋菜红
中图分类号:O657.3　　文献标识码:A　　　文章编号:1000-0720(2009)02-065-05
　　共振光散射(Resonance Light Scattering , RLS)技
术广泛用于核酸 、蛋白质 、多糖 、无机离子及某些
药物的测定[ 1, 2] 。但是 RLS技术也存在干扰因素多
(如入射光强度 、溶液酸度 、实际浓度 、温度和介
质极性等)、信号不够稳定及重现性较差等不足 。
双波长比率法(Dual Wavelength Ratiometry)是对两
个适当波长处的光谱强度相除求商 , 比值大小不
依赖体系的总体光谱强度 , 并且可以借助除法来
削弱一系列因素的影响 , 能有效解决单波长方法
的缺陷 。这种方法对体系表观总体的光信号强度
没有要求 , 所以不受激发光源 、电源的稳定性或
漂移的干扰 , 对实验中存在的不可控因素也具有
更好的稳定性[ 3 , 4] 。双波长比率法在荧光领域已有
较多报道 , 如对 DNA[ 5] 、葡萄糖[ 6]和锌离子[ 7] 等的
测定 。黄承志将双波长比率法与 RLS 技术相结合 ,
提出了双波长共振光散射比率法(Dual Wavelength
Resonance Light Scattering Ratiometry , DW-RLS), 并
应用于 DNA和蛋白质分析 , 结果表明 , 该方法能
够有效地弥补 RLS 技术的不足 , 方法的稳定性 、
重现性和灵敏度都有显著的提高[ 8 , 9] , 然而这种新
技术的应用研究在国内还很少报道。
苋菜红(amaranth , AAT)为阴离子染料 , 是一
种允许使用的合成色素 , 广泛用于饮料 、糖果及
果酒等食品的着色 , 但这种合成色素有一定毒性 ,
过量使用将有害健康。本文用 DW-RLS 法研究了
在 Triton X-100存在下 , 甲基紫(methyl violet , MV)
与苋菜红的相互作用 , 考察了方法的适宜条件和
影响因素 , 测定了样品中的苋菜红 , 并与 RLS 法
进行了比较 。将 DW-RLS 新技术应用于苋菜红测
定 , 拓宽了共振光散射技术的应用领域 , 并对其
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收稿日期:2007-11-30;修订日期:2008-03-10
基金项目:江西省自然科学基金(2007GZH1924)、 江西省教育厅科学基金(GJJ08025)、 教育部长江学者和创新团队
发展计划(IRT0540)项目资助
作者简介:张国文(1966-), 男 , 教授;E-mail:gwzhang@ncu.edu.cn.
DOI :10.13595/j.cnki.issn1000-0720.2009.0049
它食品添加剂的分析检测具有重要的参考价值。
1　实验部分
1.1　仪器与试剂
F-4500型荧光分光光度计(日本日立公司);
UV-2450型紫外-可见分光光度计(日本岛津公司);
PHS-3C型酸度计(上海雷磁仪器厂)。
10 μg mL AAT标准溶液;7.0×10-5 mol L MV
溶液;pH 1.24的乙酸钠-HCl缓冲溶液;体积分数
0.1%Triton X-100;其他试剂均为分析纯 , 水为二
次蒸馏水 。
1.2　实验方法
在 10 mL 比色管中依次加入 2.2 mL MV溶液 ,
3.0mL 乙酸钠-HCl缓冲溶液(pH 1.24), 1.0 mL的
0.1%Triton X-100 , 适量的AAT 标准溶液 , 每加一
种溶液后都进行混匀 , 用水稀释定容至 10 mL。在
200 ～ 700 nm范围内保持 λex =λem进行同步扫描得
到 RLS光谱 。于特征波长 λ=528 nm 处测量 RLS
强度 I 值;不加 AAT , 按上述步骤做空白 , 测定
RLS强度 I0 。令 ΔI=I -I0 , 以 ΔI 作为测定 AAT
的信号响应值 , 同时记录选择的两个用于比率法
波长处的 RLS强度 。
2　结果与讨论
2.1　RLS光谱特征
反应体系的 RLS光谱如图 1 所示 。从图中可
以看出 , MV和AAT自身的 RLS信号很弱 , 没有明
显的 RLS特征峰 , Triton X-100 有一显著特征峰在
290 nm 处 , 在MV和 Triton X-100溶液中加入 AAT
后 , RLS 信号得到较大增强 , 最大散射峰位于 528
nm , 并在 220 ～ 450 nm范围内出现两个散射峰。此
时 AAT 的光散射增强效应来自于 AAT-MV-Triton
X-100缔合物的生成 。在 528 nm处的 ΔIRLS随 AAT
的浓度增大而增强 , 在 0.05 ～ 0.50 μg mL 范围内
呈线性关系 , 对AAT的检出限为 0.02μg mL。
图 1　RLS 光谱
Fig.1　Resonance light scattering spectra
a-MV;b-AAT;c-Triton X-100;d-MV+Triton X-100;e-MV+AAT+Triton X-100;
1※10 ρAAT (μg mL):0.05 , 0.10 , 0.15 , 0.20 , 0.25 , 0.30 , 0.35 , 0.40 , 0.45 , 0.50
2.2　DW-RLS法波长的确定
图2为MV与 AAT反应的吸收光谱图。MV在
275和 577 nm 处有两个特征吸收峰 , 当加入 AAT
后 , 275和577 nm左右出现减色效应 , 发色团的颜
色和吸收都与入射光通过发色团的散射和吸收有
关 , 因此 , MV-AAT缔合物吸收光谱的变化应归于
RLS信号强度的变化。为了选取合适的比率法双
波长 , 应先作一个比率吸收光谱。用 MV-AAT-Tri-
ton X-100 缔合物的吸收谱线(曲线 b)除以空白
MV-Triton X-100的吸收谱线(曲线 a)即可得比率吸
收谱图(曲线 c)。从该比率吸收光谱上可以发现 ,
在200 ～ 640 nm 范围内 , 有 343和 453 nm两个特
征峰 , 峰谷位于 417 nm 。根据Lakowicz波长选择原
则[ 10] , 同时综合考虑 RLS 光谱的特性 , 选择 417
和 343 nm 处的 RLS信号强度比率 I417 I343来对反
应体系的 RLS 性质进行讨论 。内插图为不同浓度
AAT 的比率吸收光谱。可见随着AAT 浓度的增加 ,
343和 453 nm处峰位不变 , 说明 AAT 的浓度对波
长选择没有影响。
2.3　反应条件的优化
2.3.1　溶液酸度的影响　分别考察了 KCl-HCl 、
柠檬酸钠-HCl 、乙酸钠-HCl及Britton-Robinson缓冲
溶液作介质 , 对RLS强度和DW-RLS 强度比值 Iratio
即 I417 I343的影响 , 结果表明乙酸钠-HCl介质的效
果最好。不同 pH的乙酸钠-HCl缓冲溶液与 I ratio或
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ΔI RLS关系曲线如图 3 所示 , 从图中可以发现 ,
ΔI RLS受酸度影响较大 , 当溶液的 pH <1.24 时 ,
ΔI RLS随 pH 增大而增强 , 当 pH 在 1.24 ～ 1.71时 ,
ΔI RLS随 pH 增大而激剧减小 , 继续增大 pH , 体系
的 ΔI RLS值基本稳定。这可能是因为 pH<1.24时 ,
带正电荷的MV与带负电荷的 AAT 通过静电作用
结合为离子缔合物 , 使 RLS 信号明显增强 , 当 pH
>1.24 , MV所带正电荷减少 , 导致了MV 与 AAT
间的静电作用减弱 。而在 pH 0.65 ～ 5.20范围内 ,
双波长强度比值 I ratio变化较小 。因此 , 实验选择
pH 1.24的乙酸-HCl缓冲溶液来调节体系的酸度 ,
且其用量取3.0 mL 最佳 。
图 2　吸收光谱
Fig.2　Absorption spectra
a-MV+Triton X-100;b-MV+AAT+Triton X-100;c-b a;
d※f ρAAT (μg mL):0.10 , 0.20 , 0.30
图3　酸度的影响
Fig.3　Dependence of the RLS intensity ratio on pH
ρAAT=0.20 μg mL
2.3.2　甲基紫浓度的影响　结果表明溶液中 MV
的浓度为 1.54×10-5 mol L (即 2.2 mL)时 , ΔIRLS
最大 , 而浓度过低或过高均导致 ΔI RLS减小 。MV
浓度过低 , 结合反应不完全 , 信号强度较小;而
MV浓度过大 , 由于染料自身的聚集作用也会影响
染料与 AAT 的离子缔合作用从而导致 ΔIRLS降
低[ 2] 。对于 DW-RLS法 , 低浓度时 , Iratio呈缓慢下
降趋势 , 当 MV 的浓度达到 1.54×10-5 mol L 之
后 , Iratio保持稳定。
2.3.3　Triton X-100 的用量　当非离子表面活性
剂Triton X-100用量小于 1.0 mL 时 , ΔI RLS随 Triton
X-100用量的增加而增强 , 之后继续增加 Triton X-
100的用量 , ΔI RLS显著下降 , 可能是由于适量的
Triton X-100对MV-AAT 离子缔合物有较好的溶解
作用 , 从而产生增敏作用 , 但是 Triton X-100在与
缔合物结合的过程中 , 自身也存在形成胶束的自
缔合过程 , 当 Triton X-100浓度过高时 , 分子间聚
集成混合胶束 , 影响缔合作用 , 从而使 ΔIRLS降
低[ 11] 。相比而言 , Iratio值受 Triton X-100 用量的影
响并不大 , 在 0.5 ～ 2.5 mL 范围内 , Iratio 值基本
稳定 。因此 , Triton X-100的最佳用量为 1.0 mL。
2.3.4　离子强度的影响　实验结果表明 , NaCl的
浓度对体系的 ΔIRLS影响较大 , 随着NaCl浓度的增
大 , ΔIRLS降低 , 而 I ratio却基本保持不变 。因此反应
体系应保持较低的离子强度 。
2.4　DW-RLS 法的线性范围和检出限
图 4为在优化的实验条件下 , DW-RLS法 Iratio
随AAT 浓度变化的趋势。I ratio随 AAT 浓度的增大
呈指数衰减。从内插图发现 , 当溶液中MV浓度为
1.54×10-5 mol L 时 , Iratio与 AAT 浓度的对数 lgc
有良好的线性关系 , 线性方程为 Iratio =0.139 -
0.248lgc , R=-0.9950 , AAT 的线性范围在 0.01
～ 0.60μg mL , 检出限为 1 ng mL。
图 4　工作曲线
Fig.4　Calibration curve
cMV=1.54×10 -5 mol L;0.01% Triton X-100;pH 1.24
2.5　共存物质的影响
在实验条件下 , 考察了在 0.20 μg mL AAT 溶
液中加入不同的共存物质对 ΔI RLS所产生的影响 。—67—
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允许量(倍):乙基香兰素 、蔗糖 、山梨酸钾 、K+ 、
Mn
2+和 Cd2+(100);Na+ 、 Zn2+ 、 Cu2+ 、 Mg2+ 、
Al
3+ 、Pb2+ 、甜蜜素和葡萄糖(50);Ca2+和 Fe3+
(20);中性红 、胭脂红和柠檬黄(5), 可见方法有
较好的选择性。
2.6　分析应用
选取葡萄汁 、葡萄酒 、山楂和跳跳糖作为实
验样品 , 分别测定其中的苋菜红含量。样品处理
方法参照GB T 5009.35-1996进行 , 处理得到样品
定容到 25 mL 容量瓶中。准确移取一定量待测样
品溶液于 10 mL 比色管中 , 按实验方法进行测定 ,
并用标准加入法测定回收率 , RLS法和DW-RLS 法
测定结果见表 1。可见 DW-RLS法较之 RLS 法有更
好的灵敏度和准确度。
表 1　实际样品的测定结果
Tab.1　Determination results of real samples
方法 样品 测得值ρ (μg mL)
加入值
ρ (μg mL)
测得总值
ρ (μg mL)
回收率
%
RSD %
(n=5)
RLS
葡萄汁
葡萄酒
山楂
跳跳糖
0.312

0.088

0.15
0.05
0.10
0.05
0.444
0.051
0.204
0.058
88.5
101.0
116.9
116.8
2.9
2.0
1.6
6.2
DW-RLS
葡萄汁
葡萄酒
山楂
跳跳糖
0.324
0.023
0.075

0.15
0.05
0.10
0.05
0.473
0.075
0.167
0.049
99.4
103.4
92.0
98.4
1.4
2.3
0.4
4.3
参考文献
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1508
[ 2] 　唐晓玲 , 刘忠芳 , 刘绍璞等.中国科学 B 辑 , 2007 ,
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Studies on interaction between methyl violet and amaranth and its analytical application by dual wavelength
resonance light scattering ratiometry
ZHANG Guo-wen＊ , JIANG Ting and WANG An-ping (State Key Laboratory of Food Science and Technology , Nan-
chang University , Nanchang 330047), Fenxi Shiyanshi , 2009 , 28(2):65 ～ 69
Abstract:The interaction between methyl violet and amaranth was studied using dual-wavelength resonance light scat-
tering ratiometry (DW-RLS).In pH 1.24 NaAc-HCl buffer solution , the resonance light scattering (RLS)signal of
methyl violet or amaranth alone was very weak , but it was enhanced significantly and new RLS spectra appeared when
they interacted with each other to form a complex.Moreover , the interaction was sensitized in the presence of appropri-
ate concentration of triton X-100 solution.The maximum RLS peak of the complex is at 528 nm , and the RLS intensity
is proportional to the concentration of amaranth.By measuring the RLS signals at 528 nm and the RLS intensity ratio
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(I417 I 343), respectively , the content of amaranth over a wide dynamic range could be detected.Typically , when
methyl violet concentration was kept at 1.54×10-5 mol L , amaranth could be detected over the range of 0.05 ～ 0.50
μg mL with the detection limit of 0.02μg mL using RLS method , while amaranth could be detected over the range of
0.01 ～ 0.60μg mL with the detection limit of 1 ng mL DW-RLS method.In comparison with RLS method , DW-RLS
method was less affected by environmental conditions such as pH , ionic strength etc , and linear range was broader and
detection limit was lower.
Keywords:Resonance light scattering;Dual wavelength ratiometry;Methyl violet;Amaranth
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