全 文 ：苋菜红-蛋白质体系的共振光散射光谱研究及其分析应用
王晓霞　沈含熙 　郝永梅
(南开大学化学系 ,天津 300071)
摘　要　研究了染色剂苋菜红与蛋白质的结合反应。 在 pH 3.87 的 Clark-Lubs 缓冲介质中 ,
苋菜红与蛋白质通过分子间作用力形成复合物。使最大波长约为 364nm 的共振光散射光谱
得到加强。以苋菜红为标记物根据其共振光散射的增强程度 ,可用于蛋白质的定量测定 , 其
线性响应范围为 0 ～ 5.0 mg L。方法的稳定性及选择性良好 , 用于人血清试样中总蛋白的测
定 , 结果与经典的考马斯亮兰法一致。
关键词　共振光散射光谱 , 苋菜红 , 蛋白质
1　引　　言
辐射光波长与入射光波长相同的光散射称为弹性散射〔1〕。当散射微粒的尺度远远小于入
射光波长时 ,被称为 Rayleigh散射〔2〕 , 如果这种瑞利散射位于吸收带附近 ,则有可能引起散射
强度的急剧增加 ,此种现象被称为共振瑞利散射 ,或称共振光散射。Pasternack等提出了共振
光散射技术并用于核酸的测定〔3〕 ,近年来 , 运用共振光散射技术对核酸与蛋白质等生物大分
子进行定量测定的研究已有许多报道〔4 ～ 7〕 。本文研究了酸性偶氮染料苋菜红(Amaranth)与蛋
白质的结合反应 。在 pH为 3.87的介质中加入蛋白质后 , 苋菜红溶液的共振光散射显著增
强。通过试验 ,确定了以该反应体系用于测定蛋白质的最佳反应条件 ,并建立了测定人血清试
样中的蛋白质含量的新方法。实验结果与经典的考马斯亮蓝法〔8〕相一致 , 方法的灵敏度 , 选
择性及稳定性均有明显提高。
2　实验部分
2.1　仪器与试剂
RF-510及 RF-540型荧光分光光度计 RF-540(日本岛津公司);pHS-2 型酸度计(上海第二
分析仪器厂)。
牛血清白蛋白(BSA)及人血清白蛋白(天津华美生物工程公司产品), 分别配制成 5.0
mg L的标准溶液。苋菜红(上海试剂三厂产品),配制成浓度为 1.0×10-4 mol L 的水溶液 。
Clark-Lub缓冲溶液:在酸度计的指示下 ,于50mL的 0.2mol L邻苯二甲酸氢钾溶液中加入 0.2
mol L 的盐酸溶液至体系 pH 值为 3.87为止 。
2.2　实验方法
于10 mL比色管中依次加入 0.6 mL 1.0×10-4 mol/L的苋菜红溶液 ,1.0 mL C-L缓冲溶液
以及一定量的蛋白质工作溶液 , 以二次蒸馏水稀释至刻度 , 摇匀 。10 min后 , 在荧光分光光
度计上选择 λex =λem =364 nm时体系的共振散射光强度。
第 28卷　　
2000 年 11 月　　　　 　　　　
分析化学(FENXI HUAXUE)　研究简报
Chinese Journal of Analytical Chemistry
　　　　　　　　　 第 11期
1388 ～ 1390
1999-12-02 收稿;2000-05-15接受。
本文系国家自然科学基金资助课题(No.29875011)。
3　结果与讨论
3.1　体系共振光散射光谱
图1为 Δλ=0 nm条件下同步扫描激发与发射波长所得的苋菜红-BSA体系的共振光散射
　图 1　BSA-苋菜红体系的共振瑞利散射
光谱
　Fig.1　Resonance Rayleigh scattering
　spctra of amaranth system
　1.苋菜红(amaranth)(C=5.0×10-6 mol L);
2.Bovine serum albumin(BSA)(C=5.0 mg L);
3.苋菜红(amaranth)(C=5.0×10-6 mol L)。
光谱。图中曲线 1 与 2分别为苋菜红溶液与 BSA溶液
的共振光散射光谱。当 BSA与苋菜红溶液混合以后 , 体
系的共振散射强度明显增强(见曲线 3), 表明带负电荷
的苋菜红与带正电荷的 BSA(等电点为 4.9)通过以静电
引力为主的分子间作用力结合为缔合物 。约在 364 nm
处 ΔI 有最大值。
3.2　反应条件的选择
3.2.1　反应时间与稳定性　苋菜红与 BSA 的反应迅
速 ,室温条件下 10 min即可反应完全 。并在 3 h 内稳定
不变 。实验选择反应时间为 15 min。
3.2.2　反应酸度的选择　当溶液酸度在 pH 1.6 ～ 5.0
之间变化时 , 苋菜红的光散射强度基本不变 , 而BSA-苋
菜红复合物的共振光散射强度 ΔI 则在 pH 3.6 ～ 4.0之
间达到最大值并保持稳定 。实验选择 pH 3.87的 C-L缓
冲溶液控制反应酸度 。
3.2.3　苋菜红浓度的影响　苋菜红浓度较小时 ,复合
物的 ΔI 值较小 ,这是由于 BSA不能与苋菜红充分结合 。
当其浓度达到 6.0×10-6 mol L 时 , ΔI 值最大 。继续增
大苋菜红浓度 ,则 ΔI 值减小 ,这是因为苋菜红本身的光
吸收使光散射强度减弱。实验结果选择苋菜红浓度为 6.0×10-6 mol L。
3.2.4　电解质氯化钠的影响　在本体系中 ,电解质 NaCl浓度小于 4×10-3 mol L时对体系的
共振散射强度基本上不产生影响。继续增大 NaCl的浓度 ,则导致共振散射强度下降 。
3.2.5　表面活性剂的作用 　表面活性剂的加入对 BSA-苋菜红的结合反应有一定的增敏作
用。本文选择了溴化十六烷基三甲基铵(CTMAB),十二烷基硫酸钠(SDS)及 Triton X-100 3种
不同的表面活性剂进行了试验。其增敏效果依次为 CTMAB>SDS >Triton-X-100 ,其增敏率分
别达到 81%(CTMAB),78%(SDS)及 37%(Triton X-100)。有关表面活性剂增敏的有效浓度分
别为 1.4×10-4 mol L(CTMAB), 8.0×10-4 mol L(SDS)和 1.0×10-3 mol L(Triton X-100)。
3.3　共存物质的影响
共试验了多种氨基酸及某些常见金属离子对反应的干扰作用。试验结果表明 ,氨基酸(包
括甘氨酸 、脯氨酸 、色氨酸 、精氨酸 、赖氨酸 、胱氨酸 、组氨酸 、缬氨酸等)和多种常见金属离子
(如钙 、镉 、钴 、铜 、铁 、汞 、镁 、镍 、锌等)基本上不影响蛋白质的测定。
3.4　工作曲线的绘制
参照实验步骤 ,以牛血清白蛋白及人血清白蛋白绘制了测定蛋白质的工作曲线。直线的
回归方程及相关系数为:ΔIBSA=15.59CBSA(mg L)-0.89 , r=0.9996;ΔIHSA=15.02CHSA(mg L)
-1.40 ,线性范围为 0 ～ 0.5 mg L。方法的检出限分别为 22μg L 与 24 μg L。
1389第 11期 王晓霞等:苋菜红-蛋白质体系的共振光散射光谱研究及其分析应用 　　
3.5　血清试样中蛋白质的测定
利用本方法对正常人血清(由南开大学医院提供)中的蛋白质含量进行了测定 。测定前 ,
将新鲜血清用水稀释 1000倍 ,分取适量溶液按实验方法进行测定 ,结果列于表 1之中 。由表
可知 ,本方法所得结果与经典的考马斯亮兰(CBB G-250)法完全一致 。
表 1　人血清试样中蛋白质含量的测定结果
Table 1　Results of protein assay in human serum sample
试样编号
Sample No.
测得蛋白质含量 Protein Found(g L)
This method(n=5) CBB G-250 method
回收率(%)
Recovery
相对标准偏差(%)
RSD
1 71.4 72.1 98.87 1.34
2 97.7 79.5 97.92 1.32
3 74.0 73.3 100.4 1.56
References
1　Bohren C F , Huffmann D R.Absorption and Scattering Light by Small Particles.New York:JohnWiley &Sons , 1983:7
2　Stanton S G , Pecora R, Hudson B S.J.Chem.Phys., 1981 , 75(12):5616
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4　Guo Zhongxian , Li Li , Shen Hanxi.Anal.Chim.Acta , 1999 , 379:45
5　Guo Zhongxian , Shen Hanxi.Spectrochim.Acta , 1999 , 55:2919A
6　Li Tianjian(李天剑), Shen Hanxi(沈含熙).Chemical Journal of Chinese Universities , 1998 , 19:1570
7　Huang C Z , Li Y F , Mao J G , Tan D G.Analyst , 1998 , 123:1401
8　Bradford M M.Anal.Biochem., 1976 , 72:248
Resonance Light Scattering of Protein-Amaranth System and
Its Analytical Application
Wang Xiaoxia , Shen Hanxi ＊ , Hao Yongmei
(Department of Chemistry , Nankai University , Tianjin 300071)
Abstract　The binding reactions of the dye amaranth with proteins have been studied.In Clark-Lubs
buffer of pH 3.87 the amaranth combines with proteins by intermolecular forces to form complexes ,
causing an enhance of resonance light scattering (RLS)at maximum wavelength of about 364 nm.Based
on the enhancement of RLS , a novel method for the determination of proteins using amaranth as a labeling
agent was developed.The linear range for the determination of proteins is 0 to 5.0 mg L.The method has
been used to determine total proteins in human serum samples and is of accuracy and torelant to many
foreign substances.
Keywords　Resonance light scattering , amaranth , protein
(Received 2 December 1999;accepted 15 May 2000)
1390　　 分 析 化 学 第 28 卷