全 文 ：第 16卷第 2期
2007年 4月
中国 组 织化 学 与细 胞化 学 杂志
CHINESE JO URNA L OF HISTOCHEMIS TRY AND CYTOCHEM IS TRY
Vol.16.No.2
Apr.2007
旋覆花素抑制血管内皮剥脱诱导的粘附分子表达
狄柯坪 韩　梅＊ 温进坤
(河北医科大学基础医学研究所 , 部省共建教育部重点实验室 , 石家庄市　050017)
　　 〔摘要〕 　目的　观察旋覆花素对内皮剥脱诱导的新生内膜形成过程中血管壁粘附分子 OPN、 ICAM-1 、 ILK 表达的
影响 , 为寻找该药物抑制新生内膜形成的作用靶标提供实验依据。方法　采用主动脉球囊损伤后血管狭窄动物模型 , 用免
疫组织化学和 Western Blo t方法分别检测血管壁中骨桥蛋白(o steopontin , OPN)、 细胞间粘附分子-1 (intercellular adhe-
sion mo lecule-1 , ICAM-1)、 整合素偶联激酶 (integ rin-linked kinase , ILK)的表达变化及旋覆花素对其的影响。结果　血
管内皮剥脱可诱导血管壁平滑肌细胞大量增生 , 新生内膜呈弥漫性增厚 , 血管损伤局部组织中 OPN 、 ICAM-1、 ILK 的表
达均比正常对照组明显升高 (P <0.05)。旋覆花素治疗组在球囊损伤后 , 血管内膜增生程度显著减轻 , 血管壁 OPN、
ICAM-1 、 ILK 的表达均比模型组明显降低 (P<0.05)。结论　旋覆花素减缓新生内膜形成的效应与其抑制粘附分子的表
达 、 阻断粘附分子信号传递有关。
〔关键词〕 　旋覆花素;　大鼠;　内膜增生;　粘附分子
〔中图分类号〕 　R285.5　　 〔文献标识码〕 　A
ACETYLBRITANNILACTONE INHIBITS ADHESION MOLECULE EXPRESSION
IN NEOINTIMA FORMATION AFTER BALLOON INJURY
Di Keping , Han Mei , Wen Jinkun
(Department o f B iochemistry &Molecular Biology , Hebei Medical Universi ty ,
Shi j iazhuang 500017 , China)
〔Abstract〕 　Object ive To study the relationship between the neoint ima format ion and the adhesion
molecule expression in rat aorte af ter ballo on injury , and the ef fect of acetylbritanni lactone on neoint ima
fo rmation.Methods The model o f vascular resteno sis w as established by balloon injury .Immunohisto-
chemist ry and Western blot were used to de tect the changes o f OPN , ICAM-1 and I LK expressions in vas-
cular t issues af ter balloon injury.Results The neointima thickness in the model g roup w as signif icantly
higher than that in the control g roup at 21 days af ter ballo on injury (P<0.05).As compared w ith that of
the control g roup , the expression activity of OPN , ICAM-1 and ILK in the vascular w all w as enhanced sig-
nificant ly in the model g roup.Acety lbri tannilactone t rea tment resulted in mild int imal hyperplasia and de-
crease in expression level of OPN , ICAM-1 and ILK.(P <0.05).Conclusion Acetylbritannilactone can
significant ly inhibi te neoint ima formation by suppressing the expression of OPN , ICAM-1 and ILK.
〔Key words〕 　A cety lbri tannilactone;　Rat;　Neoint ima formation;　Adhesion molecule
〔收稿日期〕 2006-06-28　 〔修回日期〕 2006-09-04
〔基金项目〕 自然科学基金资助项目 (30472167);河北省
自然科学基金资助项目 (C2005000722)
〔作者简介〕 狄柯坪 , 男 (1970 年), 汉族 , 博士研究生。
＊通讯作者(To whom co r respondence should be addressed)
　　动脉粥样硬化和血管再狭窄是一种慢性血管炎
症性疾病 。血管内皮损伤诱发的单核细胞及血小板
在血管壁的粘附 、聚集是炎性反应的初始步骤。在
此过程中 , 局部炎性细胞释放大量的细胞因子和炎
性因子 , 后者通过自分泌和旁分泌作用刺激单核/
巨噬细胞 、 内皮细胞和血管平滑肌细胞 (vascular
smoo th muscle cell , VSMC)合成释放各种粘附分
子 , 从而加剧炎性细胞浸润 , 诱导 VSMC 向内膜
下迁移 , 最终导致粥样斑块或新生内膜形成。因
此 , 粘附分子在血管炎症发生发展中扮演了重要角
色 。本室在前期研究中发现 , 用非传统的有机溶剂
萃取法从具有抗炎活血作用的中草药欧亚旋覆花中
分离得到的有效部位 (旋覆花素)具有抑制内皮剥
脱后新生内膜形成的功效;同时证实该药物具有抑
制 NF-κB活化及核转位的作用。为了进一步探讨
旋覆花素的药理学机制 , 本研究观察了给予旋覆花
素处理后 , 内皮剥脱局部血管壁粘附分子骨桥蛋白
(osteopontin , OPN)、 细胞间粘附分子-1 (inter-
cellula r adhesion molecule-1 , ICAM-1)、整合素偶
联激酶 (integ rin-linked kinase , I LK)的表达变
化 , 为寻找该药物抑制新生内膜形成的作用靶标提
供实验依据。
材料和方法
1.材料
1.1 实验动物 体重 300-330g 的成年雄性
SD大鼠由河北省医学动物中心提供。
1.2 试剂 旋覆花素由河北医科大学药学院
制备与鉴定;免疫组化染色即用型 SP 系列试剂盒
购自北京中山生物技术有限公司;小鼠抗 ICAM -
1单克隆抗体 、 小鼠抗 ILK 单克隆抗体 、 HRP 标
记的羊抗小鼠 IgG 二抗 、 化学发光试剂盒均购自
S anta Cruz公司。兔抗鼠 OPN 抗体多克隆为本室
自制[ 1] , HRP 标记的羊抗兔 IgG 二抗购自 Santa
C ruz公司。其他试剂均为进口或国产分析纯。
2.方法
2.1 大鼠主动脉内膜损伤模型的复制与分组
参照文献[ 2] 的方法采用球囊内皮剥脱术复制内皮剥
脱模型。用 25%的乌拉坦 3m l/kg 腹腔注射麻醉 ,
分离出左颈总动脉 , 于左颈总动脉远心端结扎 , 近
心端夹闭 。自左颈总动脉远心端剪一楔形切口 , 将
自制的球囊导管向近心端插入至腹主动脉远端 , 注
入 0.9%的氯化钠溶液 0.1-0.15 m l , 使球囊充分
膨胀 , 然后回拉至胸主动脉起始部 。其间以导丝为
轴旋转球囊 , 反复 3次 , 退出导管 , 结扎颈总动
脉 , 松开动脉夹恢复血流 , 缝合切口。术后大鼠随
机分为模型组及给药组 (n=5)。给药组于术前 3d
及术后每天用旋覆花素灌胃 26mg/kg/d , 共灌胃
14d;模型组用等量的旋覆花素的溶剂吐温 80—水
溶液灌胃;以假手术大鼠为对照组 。
2.2 标本制备及免疫组化染色 模型组及给
药组在术后 21d 采取股动脉放血法处死。于胸腹
主动脉非连续切取 2段各约 0.5 cm 长的血管 , 置
于 4%多聚甲醛液中固定 , 石蜡包埋 , 间断均匀切
片 , 切片厚约 5 μm 。采用 SABC 方法进行免疫组
化染色 , 分别以抗 OPN (1∶80)、 抗 ICAM-1 (1
∶80)抗体为一抗 , 其他操作按试剂盒说明书进
行 。以镜下出现棕黄色颗粒为阳性标准。用 PBS
替代一抗做阴性对照。每张切片在高倍镜下随机选
取 5个不同视野 , 观察记数每个高倍镜下阳性细胞
数 。
2.3 Western Blo t分析 按照文献[ 3] 的方法
提取血管细胞总蛋白 , 用改良的 Low ry 法测定蛋
白浓度 。各组取等量蛋白提取液与 5×SDS 上样缓
冲液混匀后 , 100℃沸水浴中加热 5 min , 自然冷
却后在 120V 恒压条件下 , 经 8%的十二烷基硫酸
钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳 (SDS-PAGE)分离。电
泳结束后 , 把粘有蛋白的凝胶电转移至 PVDF 膜
上 。在室温条件下用 5%的脱脂奶粉封闭 PVDF
膜 4 h , 然后分别与抗 OPN 抗体 (1∶400)、 抗
ICAM-1抗体 (1 ∶300)、 抗 I LK 抗体 (1∶400)
4℃反应过夜 。于室温条件下用 T TBS 震荡洗膜 ,
每次 10min , 共 3次 , 再用 HRP 标记的相应二抗
(1 ∶10000)室温反应 2 h , PVDF 膜经 TTBS 、
TBS 充分洗涤后应用化学发光法显影 。采用美国
Kodak公司 ID数码成像分析系统分析结果 。
2.4　统计学处理 全部实验数据经 SPSS10.0
统计软件包处理 , 数据用均数士标准差 ( x ±s)表
示 , 多样本均数采用单因素方差分析 (one w ay
ANOVA), 组间均数比较采用 t 检验 , 以 P <
0.05为差异有显著性。
结 果
1.旋覆花素对球囊损伤大鼠新生内膜的抑制
作用 血管形态学改变发现 , 光镜下正常组大鼠主
动脉壁各层结构完整 , 内膜表面光滑仅见单层内皮
细胞 , 中膜 VSMC排列整齐呈梭形。球囊损伤 21
天后 , 主动脉内膜出现进行性增厚 , VSMC 大量
增生;中膜 VSMC 排列紊乱;管腔缩小。给药组
的血管内膜增厚程度比模型组显著减轻 , 内膜与中
膜比例 (I/M 值)比模型组显著降低 (图 1A ,
1B)。提示旋覆花素具有抑制球囊损伤后新生内膜
形成的作用 。
206 　　　　　　　　　　　　　　　中国组织化学与细胞化学杂志　　　　　　　　　　　　　　　　第 16卷
　　　　　　　　　　　　　　图 1 大鼠主动脉组织形态学改变
A H E 染色 (×200)　B 内膜/中膜比值.(n=5)
Fig.1　The mo rphological changes of ao rtic ar te ry
A　HE staining (×200)　B　Ra tio o f intima/media (I/M)
＊＊P<0.05 v s normal , ■■P<0.05 v s mode l
　　2.旋覆花素对血管新生内膜中 OPN 表达的
抑制作用 OPN 作为去分化型 VSMC 的标志蛋
白 , 在 VSMC 的表型转化即由收缩型向合成型转
化的过程中起着重要作用。为了探讨 OPN 在旋覆
花素抑制球囊损伤后内膜增生中的作用 , 本实验检
测了 OPN 在损伤血管中的表达变化。免疫组化结
果发现 , 正常组主动脉未见 OPN 阳性染色细胞;
模型组新生内膜处可见大量 OPN 阳性细胞;给旋
覆花素的治疗组仅在近管腔新生内膜处可见少量
OPN 阳性细胞 。从组化结果可以看出 , OPN 阳性
细胞数及着色强度与内膜增厚程度之间存在明显正
相关关系 (图 2A)。Weste rn Blo t结果也显示 , 在
正常血管细胞中 OPN 表达很少;从内皮剥脱诱发
的新生内膜中可检测到较高水平的 OPN;服用旋
覆花素的给药组血管壁中 OPN 水平显著低于模型
组 (P <0.05)。这提示 , 旋覆花素具有抑制新生
内膜细胞 OPN表达的作用 (图 2B 、 2C)。
207　第 2 期　　　　　　　　　　狄柯坪等.旋覆花素抑制血管内皮剥脱诱导的粘附分子表达
　　图 2 旋覆花素抑制血管新生内膜 OPN 的表达
A.免疫组化染色 (×200)　B.Western blot 分析　C.OPN 相对水平分析
Fig.2　Acetylbritannilactone inhibits expression of OPN in neointima fo rmation
A.Immunohisto chemistry staining(×200) 　B.Western blo t ana ly sis　C.Ana ly sis o f OPN rela tive lev el
＊＊P<0.05 vs normal , ■■P<0.05 v s model
　　3.旋覆花素抑制球囊损伤后血管壁 ICAM-1
的表达 ICAM-1可介导白细胞与内皮细胞及病变
部位的 VSMC 粘附 , 促进 VSMC 的迁移与增
殖[ 4] 。免疫组化结果显示 , 正常组主动脉未见
ICAM-1阳性染色细胞;模型组新生内膜区域出现
大量的 ICAM-1 阳性细胞;旋覆花素治疗组新生
内膜处仅可见少量 ICAM-1 阳性细胞 (图 3A)。
Western Blot也显示出相似的结果 , 在正常血管壁
中检测不到 ICAM-1的存在;但在模型组的新生
内膜中 ICAM-1水平明显升高;给药组血管损伤
处的 ICAM-1表达明显减少 , 约为模型组的 30%
(图 3B 、 3C)。
208 　　　　　　　　　　　　　　　中国组织化学与细胞化学杂志　　　　　　　　　　　　　　　　第 16卷
　　图 3 旋覆花素对血管新生内膜 ICAM-1 表达的抑制作用
A.免疫组化染色(×200) 　B.Western blo t 分析　C.ICAM-1 相对水平分析
Fig.3 Acety lbritannilactone inhibits expression of ICAM-1 in neointima fo rmation
A.Immunohisto chemical staining(×200)　B.Weste rn blot analy sis　C.Analy sis of ICAM-1 rela tive lev el
＊＊P<0.05 vs normal , ■■P<0.05 v s model
　　4.球囊损伤后血管壁 ILK 的变化　I LK 是广
泛分布于多种细胞中的一种丝/苏氨酸蛋白激酶 ,
是介导粘附分子信号经整合素跨膜转导至胞内后再
向下游传递的关键分子。为了探讨旋覆花素抑制
OPN和 ICAM-1表达的生物学意义 , 本实验进一
步观察了 ILK在血管新生内膜中的含量。Western
Blo t结果显示 , 在正常组仅有少量 ILK 存在;模
型组 ILK 的表达明显被上调;旋覆花素治疗组
ILK 的表达虽然比对照组增加但仍比模型组显著降
低 , ILK 在三个实验组血管壁中的表达变化与
OPN 和 ICAM-1具有一致关系。提示 , 旋覆花素
具有抑制粘附分子表达和阻碍粘附分子信号传递的
作用 (图 4A 、 4B)。
讨 论
炎症反应是造成内皮剥脱术后再狭窄发生的重
要原因 。血管损伤局部募集的大量炎性细胞通过释
放一系列细胞因子促使 VSMC粘附 、 迁移与增殖。
OPN 是由增殖活跃的 VSMC 合成分泌的一种重要
的细胞外基质粘附分子 , 具有诱导细胞的粘附和迁
移的功能[ 5] , 是介导 VSMC 由中膜向内膜下迁移
的关键分子 , 也是血管重塑的重要标志物 。我室以
往的研究表明 , 利用抗 OPN 抗体可有效抑制
VSMC 的粘附与迁移 、 并可减缓内皮剥脱诱导的
新生内膜的形成[ 6] 。此外 , 在血管内膜损伤早期 ,
募集于局部的单核/巨噬细胞以及活化的 VSMC 还
209　第 2 期　　　　　　　　　　狄柯坪等.旋覆花素抑制血管内皮剥脱诱导的粘附分子表达
　　图 4　旋覆花素对血管新生内膜 ILK 表达的抑制作
用 (n=5)
A.Western blo t分析　B.ILK 相对水平的 West-
e rn blot分析
Fig.4　The inhibition expression of ILK by inulicin
in neo intima fo rmation
A.Western blo t analysis　B.Analy sis of ILK rela-
tive level
＊＊P<0.05 vs normal , ■■P<0.05 v s model
可分泌 ICAM-1 , 后者可进一步促进单核/巨噬细
胞浸润 , 加剧血管炎症反应的程度 。由此可见 , 由
血管损伤局部释放的粘附分子在血管炎症的发生过
程中发挥了重要的作用。因此 , 抑制粘附分子的表
达或者阻断其功能已成为研制新型抗血管再狭窄药
物的新靶标。
欧亚旋覆花 (Inula Britannica)性味咸 、 温 ,
属菊科旋覆花属植物 , 是一种传统的中草药 , 具有
活血化瘀抗炎止痛之功效 。本研究小组利用已获专
利授权的技术从欧亚旋覆花的氯仿提取物中分离出
的旋覆花素 , 其所含有的主要有效单体成分是旋覆
花内酯 (1-o-ace tylbritannilactone , ABL)以及其
同系物 , 一种结构上属于苯并呋喃酮衍生物的物
质。前期实验表明 , 旋覆花素具有抑制内皮剥脱诱
导的血管壁 NF-κB 活化和 A P-1表达的作用。NF-
κB和 AP-1是多种粘附分子表达的转录调控因子 ,
在调节血管炎症转归中处于中心地位。本研究在此
基础上进一步观察旋覆花素抑制 NF-κB 、 A P-1 表
达与活化后 , 对下游靶基因表达的影响 , 以期验证
旋覆花素抗血管炎症反应的终末效应。
病理切片显示球囊损伤组内膜增生明显 , 旋覆
花素治疗组内膜增生程度显著减轻 。免疫组织化学
染色发现 , 球囊损伤组 OPN 、 ICAM-1 阳性细胞
不仅大量表达而且分布广泛;应用旋覆花素治疗组
OPN 、 ICAM-1阳性细胞的数量和分布范围均明显
减少;可见在本实验条件下旋覆花素抑制新生内膜
的形成与其抑制 OPN 、 ICAM-1 的表达具有相关
关系。这也提示内膜的增生程度与 OPN 、 ICAM-1
的表达量有关[ 7] 。Western Blo t结果也显示 , 旋覆
花素可明显抑制内皮剥脱诱导的 OPN 、 ICAM-1
的表达 , 并且还可通过抑制 ILK 表达而阻断粘附
信号在细胞内的传递 , 这就在分子水平上证实 , 旋
覆花素抑制 OPN 、 ICAM-1 、 ILK的表达与其发挥
抗内膜增生的作用之间存在一定的关系。通过下调
OPN 的表达可削弱其诱导的 VSMC 的迁移与增
殖;通过下调 ILK 的表达阻断了细胞迁移的信号
转导途径;通过减少 ICAM-1 的表达减少了炎性
细胞在血管损伤部位的粘附与聚集 , 减弱了局部的
炎症反应。结果表明 , 旋覆花素通过多靶点 、 多途
径的干预 , 而产生抗内膜增生的药理作用 。
总之 , 旋覆花素减缓新生内膜形成的效应与其
抑制粘附分子表达 、阻断粘附分子信号传递有关。
然而 , 由于旋覆花素是含有多组分的有效部位 , 其
不同组分在抑制血管炎症的作用途径及分子靶标方
面是否存在协同作用尚有待于深入研究。
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