全 文 ：现代食品科技 Modern Food Science and Technology 2011, Vol.27, No.8
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超临界 CO2萃取小球藻精油及其抗氧化分析

厉剑剑，张文焕，黄惠华
（华南理工大学轻工与食品学院，广东广州510640）
摘要：本试验采用超临界 CO2萃取小球藻精油。并比较了精油和叶黄素的还原力和 DPPH 自由基清除率。利用 GC-MS 测定精油
中不饱和脂肪酸，分析其抗氧化能力。结果表明，超临界 CO2萃取所得的小球藻精油和提取纯化后所得的叶黄素晶体均具有良好的抗氧
化性。纯化得到的小球藻叶黄素晶体总还原力大于小球藻精油，但 DPPH 自由基清除率小于小球藻精油。同时，小球藻精油含有种类丰
富的不饱和脂肪酸，具有协同抗氧化作用。
关键字：小球藻；精油；抗氧化活性；超临界 CO2萃取
文章篇号：1673-9078(2011)8-938-941
Antioxidant Activity of Chlorella Essential Oil Extracted
by Supercritical CO2 Fluid
LI Jian-jian, ZHANG Wen-huan, HUANG Hui-hua
(College of Light Industry and Food Sciences, South China University of Technology, Guangzhou 510640, China)
Abstract: In this study, supercritical CO2 extraction was used to extract chlorella essential oil and lutein. The antioxidant activities (including
the reducing power and DPPH radical scavenging ability) of the essential oil and lutein were compared. Besides, the content and the antioxidant
activity of unsaturated fatty acids were determined by GC-MS. Results showed that essential oil extracted by supercritical CO2 and purified crystal
lutein has excellent anti-oxidant activity. Purified crystal lutein exhibited higher total reducing power than oil, but lower the DPPH radical
scavenging rate. It was also found that chlorella essential oils were rich in unsaturated fatty acids which have cooperative antioxidation.
Key words: chlorella; essential oil; antioxidant activity; supercritical CO2 extraction

小球藻（Chlorella）属于单细胞藻类，是绿藻门、
绿球藻目、小球藻科中的一个重要的属。小球藻在自然
界分布较广，在海洋、湖泊、池塘、沟渠、潮湿的土壤、
树皮等环境中均可生长繁殖，但以淡水环境为主。不同
的小球藻对温度的适应范围有较大的差别，有的品系可
在 39 ℃高温下良好生长，有的品系可耐受-2 ℃低温。
小球藻的光合效率高，生长繁殖快，适应性强，具有超
量吸收某些有机物和重金属的能力[1]。小球藻细胞中的
色素主要包括叶绿素和类胡萝卜素。以干物质计，小球
藻中的叶绿素含量通常为 4%~6%；胡萝卜素含量为
0.0441%~0.0448% ，类叶黄素 (xanthophylls) 含量为
0.267%~0.310%[1]。
超临界流体萃取技术是近 20 年来国际上迅速发展
起来的最先进的物理萃取技术，已广泛应用于食品、香
料、石油、化工、医药等行业。CO2是最常用的超临界
收稿日期：2011-03-11
基金项目：国家十一五科技支撑计划项目(2006BAD27B03)；广东省科技计划项
目(2010B020312005)
作者简介：厉剑剑（1988-），男，硕士研究生，研究方向为食品工程
通讯作者：黄惠华，男，教授，博导
流体。超临界 CO2萃取应用于中药领域，与传统方法比
较，具有许多独特的优点。在国外已有利用超临界 CO2
萃取小球藻的研究报道[2]，但是在我们国内，这方面的
研究甚少。本实验主要研究超临界 CO2萃取得到的精油
进行纯化以及抗氧化性的初步测定。
1 试剂与仪器
小球藻，购于 CSIRO Marine Laboratory (Hobart,
Australia )；无水乙醇，分析纯，天津市百市化工有限公
司；乙腈，色谱纯，天津四友精细化工有限公司；甲醇，
色谱纯，天津四友精细化工有限公司；叶黄素，1 mg，
美国 Sigma 公司；DHG-9123A 超临界 CO2萃取设备，
广州轻工业研究所；高效液相色谱仪，美国戴安公司。
采用高效液相色谱进行叶黄素含量的分析。采用
Dionex HPLC 系统测定，选用 Symmetry C18 色谱柱（5
μm; 250 mm×4.6 mm），流动相为甲醇:乙腈=9:1，流动相
流速 1.0 mL/min，进样量 10 μL，柱温 25 ℃，PDA996
检测器在 440 nm 与 470 nm 处检测叶黄素，以 Sigma 公
司的叶黄素（lutein）作为标样进行叶黄素定量分析。得
到回归方程 Y=8.7668X-40.546，其中 Y 为峰面积
DOI:10.13982/j.mfst.1673-9078.2011.08.016
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（R2=0.9992）。
2 实验方法
2.1 小球藻精油提取技术路线
2.1.1 小球藻原料的预处理
购买原料→在低温（40~50 ℃）下烘干→称取藻粉 100.0 g→
加入一定体积的无水乙醇→密封、避光浸泡 24 h
2.1.2 超临界CO2萃取流程[3]
(1)SC (L) FE-CO2流程：
CO2钢瓶→冷冻系统→贮罐→高压泵→萃取釜→解析釜→冷
冻系统(循环)
(2)真空浓缩：
萃取物→0.09 MPa，40 ℃下浓缩，去掉夹带剂无水乙醇→小
球藻精油（深绿色油状物）
本试验主要研究小球藻中的活性成分，所以确定以
萃取所得的小球藻精油得率（10-2 g/g 小球藻粉）以及油
中的叶黄素浓度（mg/g 小球藻油）为考察指标。而影响
超临界 CO2萃取效果的主要因素有：萃取压力（MPa）、
萃取温度（℃）、萃取时间（h）、夹带剂用量（mL）以
及 CO2 流量（L/min）[4]；。根据响应面设计试验，得到
叶黄素的最佳提取工艺为压力：16 MPa，萃取温度：
30 ℃，萃取时间：2.8 h，无水乙醇用量：199 mL（液
固比 1.99:1），此时为超临界临界状态；重复萃取三次，
得到叶黄素浓度为 7.13±0.10（mg/g 小球藻精油）。在
对提取得到的小球藻精油在真空度 0.1 Pa，进料量 2 D/s
(1.5~2.0g/min)，薄膜蒸馏刮板转速采用设备推荐值 250
r/min，冷凝水温 10 ℃，140 ℃条件下进行分子蒸馏，
最后对收集得到的重组分在 20% NaOH 水溶液（皂化剂
用量为 1:40）下进行皂化反应，皂化时间 3 h，皂化的
温度为 50 ℃，得到了含量为 230.56±0.23 mg/g 的叶黄
素晶体，从而为高纯度叶黄素的大量生产打下了坚实的
基础。
2.2 小球藻精油及叶黄素晶体的抗氧化测定
2.2.1 还原力测定[5]
其测定原理即抗氧化剂或样品将 K3Fe(CN)6 还原成
K4Fe(CN)6，后者再与 Fe+3作用生成普鲁士蓝，在 700 nm
波长测定吸光值，以检测普鲁士蓝之生成量，作为抗氧
化剂或样品的还原力，吸光值越高，表示其还原力越强。
吸取待测溶液 1.0 mL，加 pH 6.6 的磷酸缓冲液 2.5
mL 和 1%铁氰化钾溶液 2.5 mL，混合后在 50 ℃放置 20
min，加入 10%三氯乙酸溶液 2.5 mL，以 10000 r/min 转
速离心 10 min，上清液取2.5 mL，加入 2.5蒸馏水和 0.1%
氯化铁 2.5 mL，混匀，静置 10 min，在 700 nm 处测定
吸光度。同一测定重复三次。
2.2.2 DPPH 自由基清除率测定[6]
1,1-二苯基苦基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl,
DPPH）是一种稳定的有机自由基，其溶液具有特征的
紫红色团吸收峰，当存在自由基清除剂时，由于与其单
电子配对而使其吸收逐渐消失，其褪色程度与其所接受
的电子数成定量关系，因而可用分光法进行定量分析。
吸取待测溶液 2.0 mL，加入 0.2 mM DPPH 溶液 2.0
mL，摇匀，放置 30 min。以无水乙醇调零，测定 517 nm
处的吸光值 A 样品。同时，测定样品溶液 2.0 mL 与无
水乙醇 2.0 mL 混合液在 517 nm 处的吸光度 A 对照，再
测定 2.0 mL DPPH 溶液与 2.0 mL 无水乙醇在 517 nm 处
的吸光值 A 空白。同一测定重复三次。
清除率＝[1-(A 样品-A 对照)/A 空白]×100%
2.3 小球藻精油不饱和脂肪酸的测定
2.3.1 甲酯化[7]
其原理主要是先利用皂化反应除去不皂化物，将脂
肪酸从三甘酯上释放出来，样品在 BF3 催化下与甲醇发
生催化反应生成脂肪酸甲酯，再利用正己烷将脂肪酸甲
酯萃取出来，并通过加入饱和的食盐水使脂肪酸甲酯与
其它水溶性物质分开。
称取 0.050 g 小球藻精油（临界 CO2萃取工艺：压
力 16 MPa，萃取温度 30 ℃，萃取时间 2.8 h，无水乙醇
199 mL）于 50 mL 圆底烧瓶中，在样品中加入 3.00 mL
KOH 甲醇溶液进行皂化，在 70 ℃水浴锅中加热回流 5
min，取出冷却至室温；加入 5.00 mL 三氟化硼溶液，在
70 ℃水浴锅中加热回流 5 min，取出冷却至室温；加入
3.00 mL 正己烷，70 ℃水浴锅中加热回流 5 min，取出
冷却至室温；加入饱和食盐水至瓶颈，静止 3~5 min，
用移液枪吸取上层油样约 1 mL 于干燥的进样品中，待
进行 GC-MS 分析。
2.3.2 GC-MS 分析条件
GC 条件：色谱柱 DM-FFAP 30 m×0.25 mm×0.25
μm，Dikma 公司，柱前压 65.2 kPa，分流比 30:1，进样
量 1 μL，柱温 120.0 ℃，保持 2 min 后，以 5 ℃/min 升
到 150 ℃，保持 2 min，再以 20 ℃/min 升到 230 ℃，
保持 5 min，进样口温度 250 ℃，检测器温度 300 ℃，
载气为氦气。
MS 条件：离子源温度 280 ℃，电离方式 EI，电
子能量 70 eV，扫描范围 40.00 m/z~800.00 m/z。
3 结果与讨论
3.1 小球藻精油与叶黄素晶体的抗氧化性
3.1.1 还原力测定
称取一定量的小球藻精油与叶黄素晶体，分别用无
水乙醇配成 20、40、60、80、100、500、1000 μg/mL
的溶液，同时选择常用的抗氧化剂 BHT 与 VC配成同样
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浓度的溶液与以上两种溶液进行对比，每组测定均重复
三次，取平均值，误差范围不超过 5%。
表1 不同抗氧化剂的还原力比较
Table 1 The reducing power of different antioxidants
浓度
/(μg/mL)
20 40 60 80 100 500 1000
EC50
/(μg/mL)
小球藻精油 0.05 0.12 0.42 0.45 0.59 1.15 2.04 87.29±2.18
叶黄素晶体 0.15 0.27 0.44 0.72 1.71 2.83 3.43 64.12±1.60
VC 0.07 0.23 0.27 0.34 0.48 1.99 2.72 105.32±2.63
BHT 0.09 0.28 0.30 0.41 0.63 1.74 1.91 88.40±2.21
注：EC50：700 nm 时吸光度达到 0.500 时的样品浓度。
抗氧化剂的还原能力与其抗氧化性之间存在联系。
抗氧化剂是通过自身的还原作用给出电子而清除自由基
的，其还原能力越强，抗氧化行越强。从表 1 中可知，
叶黄素晶体的 EC50值为 64.12±1.60，与其它三种物质的
EC50值相比为最低，说明了叶黄素晶体具有较强的抗氧
化能力；未提取叶黄素的小球藻精油的 EC50 值为
87.29±2.18，与 BHT 相近而比 VC的 EC50值大，说明了
小球藻精油也具有较好的抗氧化性，这是由于小球藻精
油中除了含有叶黄素与叶黄素酯外，还有相当丰富的不
饱和脂肪酸。当溶液浓度均有 100 μg/mL 时，叶黄素晶
体的吸光值为 1.707，由此也能说明叶黄素晶体的抗氧化
性最好。
3.1.2 DPPH 自由基清除率测定
称取一定量的小球藻精油与叶黄素晶体，分别用无
水乙醇配成 2、5、20、40、60、80、100、500、1000 μg/mL
的溶液，同时选择常用的抗氧化剂 BHT 与 VC配成同样
浓度的溶液与以上两种溶液进行对比，每组测定均重复
三次，取平均值，误差范围不超过 5%。
表2 不同抗氧化剂的DPPH清除率比较
Table 2 Scavenging effects of different antioxidants on DPPH radicals
浓度/(μg/mL) 2 5 20 40 60 80 100 500 1000 EC50
小球藻精油 30.52 45.67 59.88 67.92 87.54 92.23 97.44 97.12 98.03 9.57±0.24
叶黄素晶体 14.63 20.11 33.56 58.38 72.62 79.93 85.33 94.57 97.81 33.25±0.83
VC 10.47 18.33 24.6 61.46 77.56 80.52 87.83 92.34 96.71 33.78±0.85
BHT 12.34 15.77 19.67 41.62 44.85 48.21 56.58 60.31 77.49 84.28±2.11
从表 2 中可知，小球藻精油的 EC50值为 9.57，与其
它三种物质的 EC50值相比为最低，说明了小球藻精油具
有较强的 DPPH 自由基清除能力，这可能是因为小球藻
精油中含有丰富的不饱和脂肪酸，使得其清除 DPPH 自
由基的能力更强；叶黄素晶体的 EC50值为 33.25，与 VC
相近而比 BHT 的 EC50值小，这说明了叶黄素晶体也具
有较好的 DPPH 自由基清除能力，但与小球藻精油相比
则相对较差，这可能是叶黄素与叶黄素酯、不饱和脂肪
酸相比不善于清除 DPPH 自由基。当溶液浓度均有 60
μg/mL 时，小球藻精油的清除率为 87.54，由此也能说明
小球藻精油的 DPPH 自由基清除能力最强。
综上所述，超临界 CO2萃取所得的小球藻精油和提
取纯化后所得的叶黄素晶体均具有良好的抗氧化性。但
本章试验只能是一个叶黄素体外抗氧化功能的初步测定
分析，要全面评价叶黄素的体外抗氧化性还应对羟基自
由基的清除能力和超氧阴离子自由基的清除能力进行进
一步的测定分析。
3.2 小球藻精油中不饱和脂肪酸的测定
小球藻细胞中含有丰富的不饱和脂肪酸，其含量甚
至还高于很多植物[8]。本课题在在利用分子蒸馏对小球
藻精油进行纯化时，收集得到的轻组分为橙黄色油状物，
初步判断该橙黄色油状物为蒸馏出来的不饱和脂肪酸，

同时，通过上述的抗氧化试验，发现小球藻精油也
具有良好的抗氧化性，这可能是因为其中含有丰富的不
饱和脂肪。但由于本课题的研究重点在叶黄素的提取纯
化上，所以未对小球藻精油中的各种脂肪酸进行详细的
定性定量，只选用 GC-MS 分析方法进行初步的分析，
小球藻精油的 GC-MS 分析离子流总图见图 1。
对小球藻精油进行甲酯化后，进行 GC-MS 分析，
结果见表 3。从表 3 中的 GC-MS 分析结果中可知，小球
藻精油中的不饱和脂肪酸种类多样。经过质谱数据系统
检索（质谱数据库 NTST）与人工谱图解析，总共鉴定
出总馏出峰的 88.24%，其中含量较高的有 14-甲基十五
烷酸甲酯（14.27%）、棕榈油酸甲酯（19.61%）、十六
碳二烯酸甲酯（7.36%）、α-麻酸（22.71%）与油酸甲
酯（13.08%）。由于在进行 GC-MS 分析前，对小球藻
精油进行了甲酯化处理，所以可以认为小球藻中含有种
类丰富的不饱和脂肪酸，其中含量较高的主要有α-麻酸、
油酸、十六碳二烯酸、棕榈油酸与 14-甲基十五烷酸。
由于本课题不是重点研究研究小球藻精油中的不饱和脂
肪酸，所以在此仅作了简单的分析处理，但小球藻精油
中的不饱和脂肪酸含量丰富，利用的价值高，有待以后
的研究再作进一步的分析。
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图1 小球藻精油的离子流总图
Fig.1 GC-MS total ion chromatogram of chlorella oil
表3 小球藻精油的GC-MS分析结果
Table 3 GC-MS analysis of chlorella oil
序号
保留时间
/min
名称
百分比
/%
1 3.270 十七烷 1.38
2 3.459 十七碳烯 1.66
3 6.092 未检出 --
4 7.142 未检出 --
5 8.748 2,4-二叔丁基苯酚 1.98
6 9.067 未检出 --
7 9.380 14-甲基十五烷酸甲酯 14.27
8 9.675 棕榈油酸甲酯（十六碳烯酸,透明质酸） 19.61
9 10.106 14-甲基棕榈酸甲酯 0.87
10 10.336 十六碳二烯酸甲酯 7.36
11 11.192 9,12,15-十八碳三烯酸甲酯 7.97
12 12.131 硬脂酸甲酯 1.48
13 12.461 油酸甲酯 3.23
15 13.170 油酸甲酯 13.08
16 14.026 9,12,15-十八碳三烯酸甲酯（α-麻酸） 14.74
17 14.811 花生酸甲酯 0.61
合计 88.24
4 结论
4.1 通过还原力的测定得知，超临界 CO2技术萃取产物
叶黄素晶体的 EC50值为 64.12，与小球藻精油、BHT 以
及 VC三种物质的 EC50值相比为最低，说明了叶黄素晶
体具有较强的抗氧化能力；小球藻精油的 EC50 值为
87.29，与 BHT 相近而比 VC的 EC50值大，说明了小球
藻精油也具有较好的抗氧化性。
4.2 通过 DPPH 自由基出去率测定得知，小球藻精油的
EC50值为 9.57，与小球藻精油、BHT 以及 VC三种物质
的 EC50 值相比为最低，说明了小球藻精油具有较强的
DPPH 自由基清除能力；叶黄素晶体的 EC50值为 33.25，
与 VC相近而比 BHT 的 EC50值小，这说明了叶黄素晶体
也具有较好的 DPPH 自由基清除能力。
4.3 小球藻中含有种类丰富的不饱和脂肪酸，其中含量
较高的主要有 α-麻酸、油酸、十六碳二烯酸、棕榈油酸
与 14-甲基十五烷酸。
参考文献
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