全 文 ：作者简介:魏文志(1970 -),男 ,扬州大学动物科学与技术学院讲师。
E-m ail:w zw ei38@ sohu. com
收稿日期:2006 - 07 - 25
第 22卷第 5期
2 0 0 6年 9月
FOOD＆MACH INERY
食　品　与　机　械 V o.l 22, No. 5
Sep. , 2006
小球藻糖蛋白的分离纯化与抗氧化活性评价
Iso lation purification and anti-ox idation of the
g lycoprote in from chlore lla pyreno idosa
魏文志 1, 2
WEIWen-zhi1, 2　
夏文水 1
X IAWen-shui1　
吴玉娟2
WU Yu-juan2
(1.江南大学食品学院 ,江苏 无锡　214036;2. 扬州大学动物科学与技术学院 ,江苏 扬州　225009)
(1. S chool of Food Science and Technology, Southern YangtzeUniversity, Wuxi, J iangsu 214036, China;
2. College of Anim al S cience and Technology, Yangzhou University, Yangzhou, J iangsu 225009, China)
摘要:小球藻经热水抽提 、脱蛋白 、醇析得粗糖蛋白 ,再经葡
聚糖凝胶层析得到两种糖蛋白组分 (CGPⅠ 和 CGPⅡ ), 经
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳 , 证明为电泳纯物质 , 分子量分别
为 63. 7, 21. 0 kDa。利用 α-脱氧核糖法 、连苯三酚自氧化法
进行抗氧化实验 , 结果显示:CGPⅠ和 CGPⅡ均有一定抗氧
化能力 , 且 CGPⅡ高于 CGPⅠ 。
关键词:小球藻;糖蛋白;分离纯化;抗氧化活性
Ab stract:C rude g lycop ro tein w as ex tracted from C h lorella Py renoidosa
w ith hotw ater, and p recipitated by ethanol after dep rotein ization. Tw o gly-
coprotein s(CGPⅠ and CGPⅡ ) w ere p repared after fu rther purification on
Sephad ex colum n ch rom atog raphy, and their pu rity ofPAGEw as exam ined
w ith SDS-PAGE. Their mo lecular w eight are 57. 6 kD and 21. 0 kD re-
spective ly. The an tixo idan t activities w ere tested using α-Deoxyribose
m ethod and Pyrogal lol self-oxidat ion m ethod. The resu lts show ed that bo th
CGP from Ch lorel la Pyrenoidosa had capacity of anti-oxid ation, and that of
CGPⅡ w as h igher than CGPⅠ .
Keywords:Ch lore lla pyreno idosa;G lycop rotein;Iso lation pu rification;An-
tioxygen ic activity
糖蛋白是一类由糖类和蛋白质以共价键连接形成的接
合蛋白 , 已有研究认为糖蛋白具有抗肿瘤 、促进机体免疫等
功能 [ 1] 。小球藻(Chlorella Py renoido sa)是单细胞藻类 , 也称
绿藻。小球藻生态分布广 , 易于培养 , 可快速繁殖和生长 , 是
地球上动植物中唯一能在 20 h增长 4倍的生物 [ 2] ,具有很高
的应用价值。目前小球藻已经广泛地应用在食品添加剂 、动
物饲料 、美容产品 、医药制剂等方面。已经有实验证明:小球
藻热水抽提物具有促进免疫 、抗肿瘤的作用 [ 3 , 4] 。自由基是
人体生命活动中生物化学反应的中间产物 , 许多疾病的发
生 、发展与自由基对组织的损伤有密切关系 , 自由基可加快
机体的衰老过程 , 可诱发癌症 、心血管疾病等 [ 5] 。由于小球
藻细胞壁在机体内难以消化 , 有必要对小球藻活性成分进行
提取。 Tanaka等 [ 6]已经发现:普通小球藻 CK22藻株的一种
糖蛋白提取物对小鼠实验和自发肿瘤转移有显著的抑制作
用。本试验从工业培养的蛋白核小球藻提取 、分离 、纯化获
得糖蛋白纯品 , 并测定了糖蛋白抗氧化活性的能力。
1　材料与方法
1. 1　材料与仪器
小球藻:江苏农科院微藻研究中心;
SephadexG-75:瑞典 Pha rm ac ia公司;
标准分子量蛋白质:宝生物工程(大连)有限公司;
HD-21-1型核酸蛋白仪:上海青浦沪西仪器厂;
756MC分光光度计:上海实验仪器分析总厂;
EPS300电泳仪:上海天能科技有限公司;
FD-5型真空冷冻干燥机:上海离心机械研究所。
1. 2　实验方法
1. 2. 1　糖蛋白的分离纯化
分离提取:称取小球藻藻泥 80 g, 加蒸馏水 800 m L, 于
90 ℃水浴中抽提 3次 , 每次 6 h, 离心 , 合并上清液 , 50 ℃水
浴中真空浓缩 ,用 Sevag法脱蛋白 [ 7] , 用 4倍体积无水乙醇沉
淀 , 先后用丙酮和乙醚对沉淀物脱水 , 得粗糖蛋白。
纯化:将提取的粗糖蛋白用蒸馏水复溶后 , 上预先平衡
好的 SephadexG-75柱(1. 6 cm ×50 cm), 0. 001 m o l /L磷酸缓
冲液洗脱 ,流速 0. 5 mL /m in, 每管 4 mL, 分管收集。核酸蛋
白仪 280 nm下检测蛋白质吸收峰 , 苯酚-硫酸法测定糖的吸
光度。收集蛋白质和糖重合峰 , 透析膜透析 、浓缩 、冷冻干燥
得糖蛋白纯品。得率 =糖蛋白纯品质量 /小球藻藻泥质量。
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DOI牶牨牥牣牨牫牰牭牪牤j牣issn牣牨牥牥牫牠牭牱牳牳牣牪牥牥牰牣牥牭牣牥牥牰
1. 2. 2　纯度鉴定及分子量测定　采用 SDS-聚丙烯酰胺凝胶
电泳 , 分离胶浓度 15%,电极缓冲液为 T ris-甘氨酸电泳缓冲
液 , 水 ∶异丙醇 ∶冰醋酸(13∶5∶2)的 0. 1%考马斯亮蓝
R-250染色 ,水 ∶乙醇∶醋酸(17∶1∶2)脱色 ,采用标准分子
量蛋白质作标准 , 溴酚蓝为指示剂 ,以分子量的对数对各蛋
白相迁移率作出标准曲线 , 根据糖蛋白的迁移率从标准曲线
上读取分子量 [ 8] 。
1. 2. 3　化学组成分析
糖含量测定:采用苯酚-硫酸法测定 [ 9] ,以葡萄糖为标准
物质;
蛋白质含量测定:采用 Low ry法测定 [ 10] , 以牛血清白蛋
白为标准物质。
1. 2. 4　羟基自由基清除率的测定　采用 α-脱氧核糖法 [ 11] ,
取 0. 2 m L的 FeSO4-EDTA混合液(10 mm o l /L)于具塞试管
中 , 加入 0. 2 mL的 α-脱氧核糖法溶液(20 mmo l /L), 然后再
加入 0. 2 m L测试样品 , 并用磷酸缓冲液(pH为 7. 4)定容至
1. 8 m L,最后加入 0. 2 mL的 H2O2(10 mmo l /L), 37 ℃水浴
1 h, 然后加入 2. 8%的三氯乙酸 1 mL终止反应 , 再加入 1%
的硫代巴比妥酸 1 mL, 混匀后沸水浴中加热 10 m in, 冷却后
于 532 nm处测吸光度 As(Abserbance)。
不加样品 , 同样操作处理 ,测定其对比吸光度 Ac(Abse r-
bance comparison)。样品清除能力 SA%(Scaveng ingA ctiv ity)
=(As-Ac) /A s。
1. 2. 5　类 SOD活性测定　采用连苯三酚自氧化法 [ 12] 。测
定时 , 于 4. 5 mL浓度为 50 mm o l /L、 pH8. 3磷酸缓冲液中加
入 50 mm o l /L邻苯三酚 10 μL,迅速摇匀 , 倒入光径 1 cm的
比色杯中 , 在 325 nm波长下每隔 30 s测 A值 1次 ,要求自氧
化速率每分钟 O. D值变化约 0. 07。测试样品类 SOD活性测
定方法与上相同 , 加入邻苯三酚前加入待测样品溶液 , 得数
据后按下式计算酶活力。酶活单位定义:每毫升反应液中 ,
每分钟抑制邻苯三酚自氧化速率达 50%的酶量为 1个酶活
单位(U /mL):
酶活性(U /mL)=
0. 070 -A
325 nm
/m in
0. 070
50% ×反应液总体积 ×
样液稀释倍数
样液体积
2　结果与讨论
2. 1　一般性质
提纯后的两种小球藻糖蛋白经冷冻干燥为白色棉花状
物质 , 易溶于热水 、稀碱或稀酸 , 4%的水溶液呈透明胶状。
不溶于乙醚 、乙醇 、丙酮 、正丁醇等有机溶剂。 CGPⅠ 得率为
1. 29%, CGPⅡ得率为 1. 01%。
2. 2　纯化
从图 1可以看出 , 小球藻粗糖蛋白经 Sephadex G-75凝
胶柱层析 , 经核酸蛋白检测仪检测得到两个单峰 , 每管经苯
酚-硫酸法测定糖组分 , 吸光度峰与蛋白质峰基本对应。说
明两种组分具有糖蛋白的特征。
图 1　粗糖蛋白在 SephadexG-75层析柱上的洗脱曲线
小球藻在市场上已经有很成熟的产品 , 但关于小球藻糖
蛋白提取纯化的研究报道不多 , 仅见于李亚娜等 [ 13]采用水
浸提 、乙醇沉淀 、沉淀物离心后的上清液作为糖蛋白粗品 , 再
分别经离子交换层析和凝胶柱层析得到一种糖蛋白 , 但不同
的分离纯化方法得到的组分可能不一样 [ 14] 。 本实验经热水
抽提 、 sevag法脱蛋白 、醇析 ,再经葡聚糖凝胶层析 ,得到 2种
糖蛋白。
2. 3　纯度鉴定及分子量测定
2种小球藻糖蛋白 SDS-PAGE电泳图谱为一条带(见图
2),说明 2种糖蛋白为电泳纯。蛋白质标准曲线表明 , 它们
的分子量分别为 63. 7, 21. 0 kDa。经苯酚-硫酸法测定 , CGP
Ⅰ糖含量为 84. 98%, CGPⅡ糖含量为 57. 64%;经 Low ry法
测定 , CGPⅠ 蛋白质含量为 12. 95%, CGPⅡ蛋白质含量为
28. 00%。
图 2　糖蛋白的电泳图谱
2. 4　小球藻糖蛋白的抗氧化活性
2. 4. 1　羟自由基清除率的测定　体外分别加入分离纯化的
两种糖蛋白 0, 0. 001, 0. 01, 0. 1, 1. 0 m g /m L浓度梯度 , 每个
梯度 3个重复 , 计算平均值。图 3结果表明:2种糖蛋白对羟
21
科研开发 　 2006年第 5期
自由基( OH)均有清除作用 , 并且随着浓度的增加 , 清除羟
自由基的作用增强 , 并且 CGPⅡ的清除效果要高于 CGPⅠ 。
图 3　不同浓度糖蛋白对羟基自由基清除率的影响
OH是所有活性氧中反应活性最强的自由基 , 几乎可
攻击核酸 、蛋白 、脂质及糖类等任何生物大分子 ,当其积累过
量或生物体内抗氧防御体系削弱时 , 易损伤细胞及组织 , 引
起机体衰老或癌变 [ 15] 。在 α-脱氧核糖法中 , H2O2和 Fe2+作
用生成 OH , 而 OH 能氧化 α-脱氧核糖。人体内存在
H2O 2 ,由 H2O2可产生出 OH ,但至今尚未发现有清除 OH
的酶 , 所以清除体内的 OH就显得特别重要 [ 16] 。
2. 4. 2　类 SOD活性测定　体外分别加入分离纯化的两种糖
蛋白 0, 0. 01, 0. 1, 1. 0, 10. 0 m g /mL浓度梯度 , 每个梯度 3个
重复 , 计算平均值。从图 4可以看出 CGPⅠ 和 CGPⅡ都能抑
制连苯三酚自氧化速率 , 因而对超氧阴离子自由基(O -2 )
具有一定的清除能力。随着浓度的升高 , 清除率是逐渐升高
的。二者相比较 , CGPⅡ的清除能力高于 CGPⅠ 。
图 4　不同浓度糖蛋白类 SOD活性的影响
连苯三酚会发生自动氧化反应 ,其自氧化速率被抑制的
大小显示 O -
2
被清除的强弱。 2种糖蛋白能抑制连苯三酚
自氧化速率 , 可能是它们对连苯三酚有较强的亲合力 , 阻碍
连苯三酚的自氧化速率。至于 2种糖蛋白清除超氧阴离子
自由基(O -2 )能力的高低 , 可能与组成糖蛋白的成分和它
们的空间结构不一样 , 从而导致与和连苯三酚亲合力的大小
不一样。具体的机理仍有待于进一步的研究。
3　结论
通过热水抽提 、脱蛋白 、醇析及葡聚糖凝胶层析可从小
球藻中可以提取 2种电泳纯糖蛋白 , 分子量分别为 63. 7,
21. 0 kDa。小球藻中 2种糖蛋白均有抗氧化的作用 , 且 CGP
Ⅱ抗氧化能力高于 CGPⅠ 。
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第 22卷第 5期 魏文志等:小球藻糖蛋白的分离纯化与抗氧化活性评价