全 文 ：第 30卷　第 4期
2001年
浙 江 大 学 学 报 ( 医 学 版 )
JOU RN AL OF ZHEJIANG UNIVERSITY ( M EDICAL SCIENCES)
Vol 30　 No 4
2001
收稿日期: 1999-10-20　修回日期: 2000-11-03
基金项目:国家自然科学基金资助项目 ( 39570219)和浙江省
分析测试基金 ( 97059) .
作者简介:程永樟 ( 1953- ) ,男 ,主管检验师 ,主要从事医学检
验工作 .
聚 -(羟丙基、丙基 ) -天冬酰胺材料体外酶解
及植入小鼠体内的观察
程永樟 1 ,汤谷平 2
( 1.浙江大学医学院附属儿童医院 ,浙江 杭州 310003; 2.浙江大学药学院 ,浙江 杭州 310031)
摘　要: 目的:观察 4种不同摩尔比的聚 -(羟丙基、丙基 ) -天冬酰胺材料在体外酶解和植入小鼠体
内后的变化。 方法:用木瓜蛋白酶和胰酶对材料作了体外酶解试验 ,用凝胶色谱法对降解物碎片作
了测定 ;用光镜、扫描电镜、透射电镜等对材料在埋植部位、肝、肾组织内的降解碎片进行观察 ;对材
料植入小鼠体内后的生化指标 (血红蛋白、白细胞、谷丙转氨酶、肌酐作了测定。结果: 聚-(羟丙基、
丙基 ) -天冬酰胺材料在体外能被逐步酶解。在植入小鼠体内的 5周内 ,在埋植部位、肝、肾组织内能
观察到材料的碎片。结论: 聚-(羟丙基、丙基 ) -天冬酰胺材料能在体内、外逐步降解 ,植入小鼠体内
后对动物的血象、肝、肾功能无明显的影响 ,具有生物相容性。
关键词: 天冬酰胺 ;生物相容性材料 ;聚 -(羟丙基、丙基 ) -天冬酰胺 ;体外酶解 ;体内降解 ;小鼠
中图分类号: R965. 3　　文献标识码: A　　文章编号: 1008-9292( 2001) 04-0145-05
Poly-(hydroxypropyl, propyl)-asparamide: Enzymatic hydrolysis in vitro
and in vivo
CHEN Yong-zhang , T ANG Gu-ping
( The Af f ill iated Children s Hospital ,College of Medical Sciences , Zhejiang University , Hangzhou
310003,China)
Abstract: Objective: To explore the biochemical process o f poly-( hydroxypropyl, propyl )
-asparamide.Methods: Enzyma tic hydrolysis in vit ro w as ca rried out by t rypsin and papain. The
polymer w as implanted in mice. The deg rada tion f ragments w ere analyzed by gel permeation ch ro-
ma tog raphy. The histopathological changes of implantation si te, liv er and kidney w ere observed
by microscopy and elect ron micro scopy. The hemog ram of mice w ere also measured. Results: The
experiment show ed that the polymer was hydrolysed by the enzymic action g radually. The
hemog ram and serum biochemica l parameters showed no changes af ter the po lymer w as implanted
in experimental anima ls. Conclusion: The polymer show s no side ef fect on the experiment animal ,
and can be deg raded g radually in v it ro and in v ivo.
Key words: Aspa ragine; Biocompatible materials; Poly-( hydroxypropyl, propyl ) -asparamide;
Enzymatic hydroly sis; Implantation; Mice
　　聚氨基酸材料是一类具有广泛应用前景的
医用高分子材料 ,由于其毒性低 ,生物相容性
好 ,越来越受到医学、药学和材料学界的重视。
聚天冬氨酸以其合成线路简单、产物得率高已
引起研究者的关注。国内外学者在材料性能的
改进、修饰等方面对聚天冬氨酸作了大量的工
作 ,试图拓宽材料的应用范围 ,已将多种药物键
合于材料上 ,使其成为药物载体 [1～ 8 ]。在材料的
改性中改变母体侧链基是一种较为可行的方
法 ,通过侧链基的改变使母体材料的性质发生
改变。侧链基中氨基乙醇、氨基丙醇、氨基丁醇、
无水肼、乙二胺、苯胺等均可作为侧链修饰基
团 [9～ 11 ] ,其特点是利用侧链中的氨基打开酰胺
环 ,而链的另一端仍保持着化学活性基团 ,可用
于药物的共价结合。聚-(羟丙基、丙基 ) -天冬酰
胺材料是用聚天冬氨酸经侧链修饰制备而成 ,
以不同摩尔投料比的氨基丙醇和丙胺作为侧链
基团 ,制备得一组具有不同亲脂亲水性的材
料 [12～ 14 ]。有文献报道聚氨基酸材料的降解是以
酶解为主 ,因此 ,本实验选用水解蛋白酶 (木瓜
蛋白酶和胰酶 ) ,对这组材料进行了体外降解 ,
以观察材料在体外的降解情况。 为了进一步研
究材料在生物体内的降解情况 ,对植入小鼠后
的材料作了扫描电镜 ,以观察其在动物体内的
形态结构。同时测定了实验动物的血清生化指
标 ,以辅助证明该材料的生物相容性。
1　材料和方法
1. 1　材料　侧链为氨基乙醇的为聚 -α、β -(羟
乙基 ) -天冬酰胺 ,简称 PHEA,侧链为氨基丙醇
的为聚 -α、β-(羟丙基 ) -天冬酰胺 ,简称 PHPA
为 S5,侧链为氨基丙醇、丙胺的为聚 α、β-(羟丙
基 ,丙基 ) -天冬酰胺 ,简称 PHPPA。不同投料比
氨基丙醇∶丙胺为 9∶ 1为 S4; 7∶ 3为 S3; 5∶
5为 S2; 3∶ 7为 S1;对照组称为 S6。所得的材
料用液压机压制成无色透明小棒 ,液压机的压
力为 50 kg /cm2 ,小棒直径为 2. 5 mm,长约 5
mm,棒重为 40～ 45 mg,小棒压制成后用紫外
线灭菌消毒数小时 ,备用。所用实验器械均用紫
外线灭菌消毒。
1. 2　仪器　 OLYM PUS摄影显微镜 (日本 ) ;
PHILIPS, EM-410透射电镜 ; BECKM AN CX4
Decta全自动生化分析仪 (美国 ) ; M EDON IC
CA530血细胞分析仪 (德国 )。
1. 3　动物　 ICR成年小鼠 150只 ,由浙江大学
医学院动物实验中心提供 ,体重为 20～ 27 g,雌
雄各半 ,随机分成 6组 ,每组 25只小鼠 ,戊巴比
妥钠 ip麻醉后 ,剪去小鼠背毛 ,切一小口 ,将压
制好的经灭菌处理的小棒埋植于皮下 ,缝合切
口。 对照组不埋植材料 ,切口后即予缝合。
1. 4　材料的吸水率实验　将经过准确称量的
材料置于恒温恒湿培养箱 (饱和 KCI溶液 , 37
± 0. 1℃ )中 10 d, 10 d后准确称量材料的吸水
情况 ,并计算材料的吸水百分率。计算式为: (W
- W 0 ) /W 0×% ,其中 W 为 10 d时的重量 ,W 0
为初始时的重量。
1. 5　材料体外酶解　在 pH为 7. 5, 0. 02 mol /
L的磷酸缓冲溶液 ( PBS)中 , ( 37± 0. 1)℃时 ,
测得胰蛋白酶和木瓜蛋白酶的初始活力分别为
22. 8万 U /g和 4. 5万 U /g ,胰蛋白酶在 1 d、 3
d、 5 d后的残存活力百分率分别为 50. 9%、
34. 2%、 22. 0% ,木瓜蛋白酶分别为 56. 3%、
38. 5%、 25. 3% 。称一定重的材料各两份于具塞
广口瓶中 ,分别加入 50 ml酶缓冲溶液 ,置于
( 37± 0. 1)℃恒温水槽中 ,胰蛋白酶和木瓜蛋白
酶的浓度均为 0. 1 mg /m l,缓冲液均为 pH 7. 5
的 0. 02 mol /L PBS,取不同反应时间的反应液
1 ml ,经沸水浴处理数分钟后 ,停止反应 ,再经
0. 45μm的滤膜过滤 ,用凝胶色谱 ( GPC)测定
降解碎片的分子量。
1. 6　凝胶色谱条件　色谱仪为岛津 LC-6A,
色谱柱为 All tima GPC 100-7 u柱 , 250×Υ4. 6
mm ,流动相为重蒸水 ,流速为 0. 6 ml /min,柱
温为 35℃ ,检测器为岛津差示折光检测器。
1. 7　血液生化检验　分别于埋植材料后 6,
13, 20, 27, 34 d采小鼠眼眶血 ,进行血清谷丙
转氨酶 ( ALT) ,肌酐 ( Cr ) ,白细胞 ( WBC)和血
红蛋白 ( Hb)的测定。 ALT测定用 HENRY法 ,
Cr用 RATEE-JAFFE法 , Hb、 WBC用 CA530
血细胞分析仪 ,所用试剂均为进口试剂。
1. 8　组织与检验　以上采血后的小鼠处死 ,取
埋植部位、肝、肾组织作组织切片 ; 10%的福尔
马林固定 ,无水乙醇梯度脱水 ,石腊包埋 ,切片 ,
厚度为 6～ 8μm;苏木精、伊红染色 ,脱水 ,中性
树胶封片 ,显微镜下观察。
1. 9　电镜分析　材料合成后 ,进行扫描电镜观
察 ,观察材料的形态。 材料压棒后埋入小鼠体
内 ,定时处死小鼠 ,取埋植部位、肝、肾组织用戊
二醛固定。树脂固定制样后 ,由透射电镜分析。
·146· 浙江大学学报 (医学版 ) 第 30卷
2　结　果
2. 1　材料分子量的测定　实验用凝胶色谱法
( GPC) ,以葡聚糖标准品为相对分子量测定了
材料的分子量。葡聚糖标准品分子量与保留时
间关系的标准方程: lgM= 5. 974- 0. 1381 tR
(n= 5, R= 0. 99) ,在同样条件下的 S1～ S5样
品的相对分子量分别为 7. 43× 104、 8. 01× 104、
8. 12× 104、 8. 28× 104、 8. 38× 104。
2. 2　材料的吸水性实验　图 1是 S1～ S5的 5
种材料的吸水性情况。
2. 3　材料的体外酶解　将木瓜蛋白酶和胰酶
作为酶解介质 ,在两种酶特有活性 20%以上
时 ,用凝胶色谱法测定材料 1、 3、 5 d时在酶介
质中降解情况。见图 2、图 3。
2. 4　材料植入小鼠后生化指标 (以 S2材料为
例 )　见表 1。
图 1　 S1～ S5的吸水率变化
图 2　 S2, S4, S5在木瓜蛋白酶中的降解率
图 3　 S2, S4, S5在胰蛋白酶中的降解率
表 1　聚 -(羟丙基 ,丙基 ) -天冬酰胺植入小鼠后的生化指标
项　目 组 别 t /d
6 13 20 27 34
血红蛋白 ( Hb) 实验组 13. 1± 0. 3 13. 2± 0. 4 13. 3± 1. 1 13. 1± 0. 3 13. 1± 0. 3
　 g /L 对照组 13. 1± 0. 3 13. 9± 0. 4 12. 5± 0. 4 13. 1± 0. 1 13. 6± 0. 4
白细胞 ( WBC) 实验组 11. 1± 0. 5 11. 4± 0. 8 10. 4± 1. 2 17. 4± 0. 3 15. 9± 1. 4
1× 109 /L 对照组 10. 3± 0. 1 11. 2± 0. 5 15. 8± 1. 0 15. 4± 1. 2 12. 0± 1. 8
谷丙转氨酶 实验组 25. 8± 7. 1 25. 3± 1. 7 36. 4± 0. 3 41. 1± 5. 8 53. 9± 5. 9
SGPT U /L 对照组 29. 6± 0. 9 43. 3± 7. 0 36. 4± 6. 4 35. 9± 3. 1 32. 9± 7. 7
肌酐 Gr 实验组 - 14. 6± 1. 0 30. 7± 1. 0 30. 8± 6. 2 22. 6± 3. 9
μmol /L 对照组 - 27. 0± 2. 8 29. 1± 0. 8 36. 4± 0. 9 28. 2± 0. 3
2. 5　材料的光镜和电镜观察结果　见图 4～
图 6。 3　讨　论
由图 1可知 , S5即 PHPA材料 ,其侧链均
·147·第 4期 程永樟 ,等 .聚 -(羟丙基、丙基 ) -天冬酰胺材料体外酶解及植入小鼠体内的观察
为 -OH基团 ,故有较强的吸水性 ,吸水率约为
17. 4% ,在 S1～ S4材料中 ,侧链中氨基丙醇和
丙胺的摩尔比从 90%降至 30% ,他们的吸水率
则由 14. 8%降至 5. 1% ,说明侧链基团的改变 ,
在一定程度上可以改变母体的性质 ,为材料键
合药物后在体内释放起了一定的作用。
图 4　 S5材料皮下埋植 10 d时的光镜照片 (× 200)
图 5　 S5材料在肝脏的电镜照片 (× 7 100)
图 6　 S5材料在肾脏的电镜照片 (× 14 000)
图 2图 3是 S2, S4, S5三种材料在木瓜蛋
白酶和胰酶中的体外降解情况。从图中可知 ,材
料在酶介质中均有不同程度的降解。在木瓜蛋
白介质中 , S2降解较快 , S4次之 , S5最慢 ,说明
木瓜蛋白酶对脂溶性材料降解较快 ;在胰酶介
质中 ,降解情况略有不同 , S4较 S2降解为快 ;
在两种酶介质中 , S5降解均较慢。从材料的结
构来看 ,母体材料中酰胺键的特殊构型 ,酶解需
具有特异性酶才可能对其作用。
体内降解则是一个复杂的过程 ,为观察材
料植入小鼠体内后的降解情况 ,将材料灭菌后
植入小鼠背部皮下。表 1以 S2材料为例 ,反映
了材料埋植入小鼠体内后 ,生化指标的变化情
况。 血红蛋白、白细胞、谷丙转氨酶和肌酐四组
数据与空白对照组 ,经两两间的方差分析 , P>
0. 05,无显著性差异 ,与文献 [15 ]报道的小鼠正
常生化指标数相比 ,这两组数据均属于正常范
围。说明材料埋植于小鼠体内的一个月期间 ,在
材料溶解、代谢过程中 ,对小鼠的肝、肾及各血
象指标无明显的干扰。从已完成的材料 LD50数
据 [ 16]来看 ,材料属无毒性材料。 在实验的 34d
中未发生小鼠死亡现象。
图 4为 S5材料埋植 10 d时皮下光镜的照
片 ,镜下观察可知 ,第 10 d可见埋植物被增生
的结缔组织包裹、分隔。 结缔组织中血管丰富 ,
埋植物是浅黄色或棕褐色团块。图 5为 S5材料
在肝脏的 10 d时的电镜照片 ,圆状黑色波纹状
的为材料。从照片中可以清晰看到 S5分解成大
小不一的颗粒 ,巨噬细胞粘附于材料颗粒表面。
图 6为 S5材料在肾内第 15 d的电镜照片 ,从
照片可以看见在肾脏有 S5材料的颗粒 ,但其粒
径已明显减小。就材料的体内实验结果来看 ,其
变化是一个较为复杂的过程 ,从溶解情况来看 ,
S1、 S2、 S3、 S4、 S5的情况不尽相同 , S3, S4基本
保持了棒状形态 , S1、 S2略有溶解 , S5在植入
体内数小时后便被体液溶解 ,而分布于植埋部
位皮下。 材料经过棒状固态、凝胶状粘稠物、颗
粒状物质的过程 ,然后逐步消失。
从 5 d到 5周的电镜照片中能看到材料在
肝、肾等组织中的情况。 其表现为材料在肝、肾
组织中出现的时间稍稍滞后 ,且出现的颗粒比
皮下为小。从照片上看 ,材料颗粒多数出现于组
织细胞附近或粗面内质网边 ,故作者认为材料
分子碎片被植入部位的巨噬细胞、异物巨细胞
·148· 浙江大学学报 (医学版 ) 第 30卷
及中性粒细胞等吞噬 ,引起材料颗粒的降解 ,异
物巨细胞、中性粒细胞释放的水解酶、蛋白酶等
可使材料颗粒胞外降解 ,降解后的大小碎片经
弥散被组织吸收或进入毛细血管 ,部分则经毛
细淋巴管吸收。这是一个较为缓慢的过程。材
料在肝脏代谢 ,最后可能通过肾脏排泄 ,肾小管
上皮可吸收某些代谢物。同步的血象及肝、肾功
能指标表明 ,材料滞留期间对组织无明显的影
响。对于 S1～ S5何种材料在体内降解速度较
快 ,初步的实验结果说明 ,水溶性好的材料在体
内降解较快。至于作为药物载体 ,比较药物的释
放性质 ,需要用键合药物后在体内释放的速率
快慢才能加以验证。实验采用直接将材料植入
动物体内以观察材料生物相容性的方法 ,能较
客观地反映材料的生物相容性。
参　考　文　献
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[责任编辑　冯稼荪　张荣连 ]
·149·第 4期 程永樟 ,等 .聚 -(羟丙基、丙基 ) -天冬酰胺材料体外酶解及植入小鼠体内的观察