全 文 ：广 西 农 学 院 学 报 ` 1 9 89 , 8 ( 4 ) : 此一 18
J o “ r 口 a l o f G u a n g x i A g r i e u l t u r a l C o l l e g e
松节油在植物制片中的应用
林鉴钊 谢宝贵 俞立发 周秉珍、 夏民生
( 农学系 )
、 摘要 以松节油做生物制片一的透明 剂 , 经用石 蜻切 片法 、 徒手切 ·片. 法 、 压 片法和
整体封藏法对被子植物 、 裸子植物 、 旋类 `植物 、 苔薄植物 、 藻类植物和菌类植物制
片试验表明 , 所制作 的玻片标本和用二 甲苯制作的一样清晰 。 本研究还设法使 松节油
与较低浓度的酒精相溶合 , 因 而能将制片中脱水 、 透明两 步合为一 步 , 简化制片程
序 , 提高工作效率 。 、
关键词 植物乡 制片 ; 透明 剂 , 松节油
松节油是自然界中资源丰富的香精油 , 由于仑透明好 ,易挥发 , 无毒 , 因此适合做生物制
片透明剂 。 过去在动物石蜡切片 巾 , 有用松节油透明 。 在植物制片 中 , 松节油一般是用于整
体封藏法中封藏前 1 、 2 级的透明 , 完全代替二甲苯作透明剂在 国内至今未见报道 。 从 1 9 8 6
年开始 , 笔者用各种常规制片方法对各大类群的部分植物进行制片试验表明 , 松节油的透明
效果和用二甲苯作透明剂一样 良好 。 又由于我们设法使松节油与较低浓度的酒精 ( 如 70 肠 酒
精 ) 相溶合 , 因而用松节油制片可以合脱水 、 透明两步为一步 , 简化了制片一程序 , 缩短制片
时间 , 提高工作效率 。
1 材料与方法
所用的透明剂是广西岑溪县松脂厂` 和往林化工厂生产的优质松节油 。 ·
用于制片的植物材料有被 子 植 物 的 洋 葱 ( 月 !il 。 。 ce p 。 ) 根 尖 , 菜 豆 ( 尸h 。二 。 l二
。 。 l夕a r `: ) 幼根 , 南瓜 ( C o e u r b f “ ; 。 o s e h a t a ) 蒸 , 向日葵 ( H e l f a o t h 。 : a : 。 。。 s ) 幼茎 、 .下
胚轴 , 罗汉果 (M 0 0 0 r d` c a 夕 r o 、 e n o s `)幼茎 、 叶片 , 木鳖子 ( M o 爪。 : d i c a e o e h i 。 。 h f o e , : i: )
幼茎 、 叶片 、 子房 , 马贻儿 ( 几了el ot ;.k 沁 in 成 ca ) 幼茎 、 叶 片 , 绞 股 蓝 ( G , 朋盯。 , 阴 a
p o n r a p h y l l“ 。 少仔!片 , 桂花 ( O : 胡 a n t h u : f r a g r a , : ) 、 番石 榴 ( P : id i: ` , n 刀。 a , a v a ) 、 格木
( E
,
·
, t h r o p h l o o u 。 。 j o r d i i )老茎 , 陆 _}也棉 ( G o : : 夕夕i u o h了r : 。 t , , , )叶片 , 玉米 ( Z o a 。 : a 夕s )叶
片 、 花药 ,水稻 (O r , z a s a t i o a )茎 , 卜卜j宁 , 甘蔗 ( s a c e 人a r u m : i , e n s i s )茎 、 叶片 , 韭菜 (刁 l l i o m
t u b e r o “ 切 ) 幼叶 。裸子植物的银杉 ( C a t h a , a o r g , r op h夕11“ )茎 、 叶 , 杉木 ( C 。 , , ;滚” g寿a , i a
l a n c e o l a t a )茎 、 叶 ,罗汉松 ( P o d o e a r P 、 5 o a e o o P h夕l l u s )茎 、 叶片 。 金星威 ( P a r a 了h o lg P t e r i :
g l a , ; d : ` l` g e r a ) 抱子叶 。 葫芦 鲜 ( F o n a r i a h夕夕 r o 扔 e t r i e a ) 雌 、 雄器苞 , 地钱 ( 月了a r e h a鹿t矛a
p o l , m o r p h。 )叶状体 、 雌生殖托 。轮藻 (亡h a r a : p . ) , 裂褶菌 ( S e h矛: o p方y l l。 。 : e o 。 。 u 。 。 )等 。
本文 19 8 9 一 04 一拍收到 。
上述供试植物 , 根据材料的性质和观察 目的的不同 , 分别采用石蜡切片法 、 徒 手 切 片
法 、 压片法和整体封藏 法制片 。
2 制片程序和试验结果
2
·
1 石蜡切片法
.2 .1 1 制片程序
经固定和冲洗 , 保存于 70 肠酒精 中的植物器官 , 通过下列步骤制成玻片标本 。
( l ) 石蜡包埋前的脱水 、 透明 : 在上行梯度酒精中加入一定量的松节油 , 使材料 同时
脱水 、 透明 , 即 7 0肠酒精 e o m l+ 松节油 10 m l , 7 5呱酒精 6 o m l+ 松节油 1 5 m l , 8 5帕酒 精 7 o m l
+ 松节油 3 o m l , 9 0肠酒精 s o m l + 松节油 4 o m l , 9 5肠酒精 4 o m l+ 松节油 6 0m l , 9 5肠酒精 2 5 m l
+ 松节油 75 m l , 1。。肠酒精 10 m l + 松节油 90 m l , 每级 3 、 4 小时 。 透蜡分兰级进行 , 即松节
油和石蜡混合 ( 6 ~ 8 小时 ) , 纯蜡 ( 1 ) , 纯蜡 ( 2 ) , 每级 l 、 2 小时 。
常规石蜡包埋 , 用旋转切片机切片 , 厚度为 8 、 1 2卜m 。
( 2 ) 脱蜡 、 水化 、 染色 : 烘干后的切片 , 用松节油脱蜡 ( 8 ~ 20 分钟 ) ,然后转入 2 3/
松节油 + 1 / 3 纯酒精 , 1 / 2 松节油 + 1 / 2 纯酒精 , l / 3 松节 油 + 2 / 3 纯 酒 精 , 纯 酒
精 , 95 肠酒精 , 70 肠酒精 , 50 肠酒精 。 下行每一个梯度 30 、 40 秒钟 , 经水化后进行染色 。
染色是用苏木精单染 , 或者用番红 与苏木精 、 番红与固绿二重染色 。 二重染色中有些是
分别二重染色 , 而大部分是一步二重染色 r . 、 。
( 3 ) 染色后脱水 、 透明 : 采用与脱蜡 、 水化相反的上行梯度进行 ,即 50 呱 , 7 。铸 ,9 5肠 ,
1 0 0肠的酒精 , l / 2 纯酒精 + l / 2松节油 , 1 / 3 吨酒精 + 2 / 3 纯松节油 ,松节油 ( 1 ) ,松节
油 ( 2 ) 。 纯酒精之前 , 每级 10 秒钟 , 以后各级分别是 1 , 2 , 3 , 5 分钟 。 最后封片 。
2
.
1
.
2 试验结果
1 9 86 年 3 月至 1 98 9年 6 月 , 在植物解剖研究和植物制片技术课的教学中 , 用松节油作透
明剂迸行石蜡切片 , 所切的植物器官薄片 ( 厚度在 8 、 1 2卜m ) 完好率是高的 , 除软 化 不好
的以外 , 未 发现脆碎 、 破坏 、 撕裂或空洞等情况 , 说明松节油清除细胞 、 组织 内的酒精是彻
底的 。 在 50 、 56 ℃条件下溶解石蜡也是充分的 ,所以松节油完全可以 作为脱水剂酒精和包埋剂
石蜡之间的桥梁 . 在石蜡切片中松节油溶解石蜡迅速 , 在 16 、 30 ℃条件下只需 8 、 12 分钟 。 松
节油明显地增加了植物细胞 、 组织的折光率 ,使之透明 , 因此在显微镜下观察视野清晰 ( 见表
1 )
。 松节油挥发性好 , 玻片标本易烘干 , 同时对苏木精 、 番红等常用的生物染料染色也没
有影响 ( 图版 l 一 6 ) 。 还有以向 日葵茎 、 棉花叶片为材料 , 在其他条件相同的情 况下 , 分
别用松节油 、 二甲苯 、 樟油 作透明剂制片试验 , 结果三种处理切片的完好率都很高 , 表明松
节油的透明效果与二甲苯 、 樟油没有区别 ,挥发性接近二 甲苯 , 溶解石蜡的速度优于樟 油 ( 见
表 2 ) 。 上述向 日葵茎 、 棉花叶片玻片标本 ( 用番红一一苏木精二重染色 ) , 放于朝南的窗
口 前晒 56 天 ( 1 9 8 8年 4 月 26 日至 6 月 23 日 ) 作强化褪色处理 , 结果番红的颜色基本褪去 , 而
苏木精的颜色还很鲜艳 , 其 中松节油作透明剂制作的玻片标本和二甲苯作透明剂制作的玻片
标本所保留的蓝色一样好 (图版 7 、 8 ) 。在称猴桃茎 、 油杉茎 、 叶等六种材料的石蜡切片中 , 石
蜡包埋前在松节油中停留 52 天 , 对切片毫无影响 。 在 福建柏叶和杉树叶等材料切片中 , 染色
之后分别在松节油中浸 1 3 、 72 小时 , 色彩不变 。 在雪松茎 、 云杉茎等材料制片中 , 在相对湿
1
、 棉花叶片横切面 ,番红一苏木精二重染色 ( X 2 5 )
2
、 水稻茎节间横切面 , 番红一固绿二重染色 ( 又 2 25
。 ①上表皮 ; ②叶脉 中的木质部 。
)
。 ①维管束的韧皮部 ; ②皮 层细胞 中的淀粉粒 。
、 洋葱根尖纵切面 , 铁矾 、 苏木精染色 ( x 80 。 ) 。 ①中期细胞分裂相 ,
、 冲扮叶片律切面 , 番红一固绿寻重染龟 ( 粉舒 2 : ①上麦床;、 地钱叶状体横切面 , 番红染色 ( X 2 25 ) 。 田胞芽杯 多 卿胞芽 。
②后期细胞分裂相 。
②叶脉中的木质部 。
、 洋葱根尖压片 , 铁矾 、 苏木精染色 ( x 10 0。 ) 。 ①后期细胞分裂相 。
、 向 日葵幼茎横切面 , 松节油作透明剂制片 , 番红一苏木精二重染色 ,
56 天 ( x 1 10 ) 。 ①表皮 ; ②皮层 , ③维管束中的木质部 。
8
、 向日葵幼茎横切面 , 二甲苯作透明剂制片 , 番红一苏木精二重染色 ,肠天 ( X 1 1。 ) 。 ①表皮 ; ②皮层 ; ③维管束中的木质部 ,
暴光强化褪色
寨光强化褪色
34567
度为 9 0帕的条件下封片 , 材料不变成乳白色 。 在花生幼根根毛区制片时 . 表皮细胞和皮层细
胞不发生收缩现象 。 可见用松节油制片 , 还克服了二甲苯制片存在的一些 问题 。
表 1 石蜡切片中松节油脱蜡 、 透明效果
材料名称 脱蜡时间 (分 ) 一功` 州 让二长 魂` l 之K
染色情况
灸法 占呆
碑。℃条件 一下烘干玻片所需时间 (天 )
玻片标木
清 晰情况
洋葱根尖纵切面 9 ( 2 7 . 5℃ ) 苏木倩 、 单染 染色体蓝黑色 1 3 、 1 4 清晰
( 8 件 m )
向 日葵幼茎横切面 8 ( 3 。℃ )
( 1 2协m )
陆地棉叶片横切面 王2 ( 1 6℃ )
( 8 卜m )
油杉叶片横切面 1 2 ( 1 6沟 )
( 8 林m )
水稻茎横切面 8 ( 3 0℃ )
( 1 2件m )
番红一苏木精二重染色
番红一苏木精二重染色
番红一固绿二 .重染色
番红一固绿二重染色
才(化细胞红色
薄壁细胞蓝色
木化细胞红色薄壁 细胞蓝色
1 3 、 1 4 清晰
1 3 ~ 1 4
木化细胞红色薄壁细胞绿色
木化细胞红色、薄壁细胞绿色
13 、 14
1 3~ 1 4
清晰
清晰
表 2 植物制片中松节油 、 二甲苯 、 樟油渗透性 、 挥发性和溶蜡速度比较
材料名称
向 日葵幼
茎横切面
( 1 2协 m )
比较项 目 松节油
5 2
。
5
完好
4 8
二甲苯 樟油
包埋前脱水 、 透明所用时间 ( 小时 )
切片完好情况
12 ℃条件下脱蜡所需时间 ( 分 )
4 0 ℃ 条件下烘干玻片标本所用时间 (天 )
包埋前脱水透明所用时间 `小时 )
切片完好情况
1 2 ℃条件下脱蜡所需时间 ( 分 )
40 ℃条件下烘干玻片标本所用时间 ( 天 )
5 2
.
5
完好
4 8
l 2
5
.
2 5
完好
2 6 5、 2 0 0 0
1 5
陆地棉叶
片横切面
( 8奋: m )
5 2
.
5
完好
3 7
1 3
5 2
.
5
完好
3 7
l 2
5 2
`
5
完好
2 6 5 、 2 0 D0
l 5
2
.
2 压片法
材料为洋葱根尖 、 韭菜幼叶和玉米花药 , 以显示细胞分裂形象和染色体的形态和数目 。
2
.
2
.
1 制片程序
上述三种材料均采用一般压片程序进行压片 , 用改 良茉酚 、 酷酸洋红印铁矾苏木精染色 。
压片之后用冰冻法 、 烘干法和以下方法制作永久片 : 压片 一 ) l / 3 松节油 十 1 / 3 醋酸 + l / 3
9 5肠酒精 一“ 2 / 3 松节油 十 1 / 3 纯酒精 。 松节油 、 松 节祠一封片 。
2
.
2
.
2 试验结果
在压片法制片申 , 凡是用松节油透明的玻片标本都十分清晰 , 染色体的形态很清楚 ( 图
版 6 ) 。 说明用松 一猫油 、 醋酸 、 酒精脱盖玻片一 , 松节油透明制作永久玻片标本 , 方法可靠 ,
程序简单 , 松 冷油起到类似叔 一r 醇的作用 。
2
.
3 整体封藏法和徒手切片法
整体封藏试验材料是轮藻小肢轮及其上的是藏林器 、 域卵器 。 , 门 5 伪 福 尔 马 衬、 .戍 F人人
月定 , 水化后改良苯酚染色 。 经上行梯度浓度 ( 即 3晰 , 3 5帕 , 40 帕 , 45 拓 , 50 帕 , 5 帕 ,
6 0肠 , 6 5肠 , 7 0肠 , 7 5肠 , 8 0肠 , 8 5肠 , 9 0肠 , 9 5肠 , 1 0 0外 ) 的酒精脱水 , 然后用 1 / 2 纯酒
精 + 1 / 2 松节油 , : 1 / 3 ;纯酒精 + 2 / 3 松节油 , 松节油 ( l ), 松节油 . ( 2 )透明 , 最 后
封片 。 结果一 藏卵器外围螺旋细胞和受精卵卜 以及小枝细胞壁和细胞内叶绿体均 能 清 晰 区
分 。 脱水过程 中材料略有变硬 , 但封藏前对藻体进行调理 , 不发生脆断 。
徒手切片 ( 滑动切片机切片 ) 以桂花 、 格木 、 番石榴老茎为材料 ,切片厚度为 2 s o m , 用
95 肠酒精域 F A A固定 。 染色后在指形瓶或表皿 中脱水 、 透明 ( 和石蜡切片法染色 后 的脱水
透明相同 ) , 然后用树胶封片 。 所制作的徒手切片永久玻片标本 , 染色良好 , 在显微镜下观
察视野清晰 。
3 讨论
3
·
1 松节油能作为植物制片滋明荆的厚理
植物制片 中透明的作用是增加标本的折光率 , 使之透明 , 便于在显微镜 下观察 。 但作为
一种透明剂 , 除了具有透明作用之外 , 还应考虑到它是否易挥发 , 对一般生物染料是否有影
响等等 。 用作石蜡切片透明剂还要求能够和酒精溶合以及溶解石蜡的作用 。 松节油是一种无
色透明的液体 , 其成分主要有 85 肠~ 90 肠的 a一旅烯 , 它不溶于水 , 而溶于乙醇 , 能 溶解石
蜡 。 因此 , 可以用松节油作为脱水剂酒精和包埋剂石蜡之间的 “ 媒剂 ” 。 换句话说 , 松节油
可以除去植物细胞 、 组织中的酒精 ,同时又能溶解石蜡 , 使石蜡渗入植物组织内部 , 成为不可
分离的状态 , 便于切片 。 实践证明 , 松节油渗透速度是比较快的 , 挥发性也很 好 , 玻 片 标
本容 一易烘千 , 制片时间短 。 松节油钓 pH值一般为 6 . 7 , 接近中性 , 不会影响染料染色 。 松节
油的析光率为 .1} “ 7 、 1 .4 6’8 , 和二甲苯的折光率差不多 , 所以能使材料 ,透明 , 视野情晰 。
3
.
2 松节油 制片程序筒单 , 适用范山户泛
松节油与水不相溶 , 因而与 9。呱以下的酒精也不相溶 。 笔者经反复试验 , 在松节油中加
入“ 种化学物质 , 能够使其与较低浓度的酒精 ( 如 70 帕的酒精 ) 根溶合 , 从而使松节油 既具
有透明作用文具有脱水作用 , 这样可以合制片中脱水 、 , 透明两步为一步 , 简化制片程序 , 提
高制片效率 `
本试验以松节油作透 明剂 ,用 目前各种常规制片方法对各类群 40 多个种的植物 ,制作 3 0 0 0
多片玻片标本 , 其透明效果与二申苯 、 樟冲作透明剂制作的玻片标本一样好 。 广西农校 、 广
西药检所等单位也用松节油制片 , 效果良好 。 用无毒的松节油制片 ,可以从根本上改善制片者
的劳动条件 , 既保护人的健康 , 又不污染环境 , 为制片安全操作提供了良好条件 , 特别是我
区有丰富的松节油资源 , 加以开发利用 , 可增加经济效益 。
松节油的主要成分 a一派烯 , 氧化后变成旅酸 , 在制片中对碱性染料有一定的影 响 。 为
保证制片质量 , 对未使用的松节油要注意密封保存 , 已使用一段时间的 , 要加入适量的碱性
物质 , 中和旅酸 。 此外 , 松节油一般含有 0 . 2肠、 0 . 5肠的非挥发性物质 , 虽不影响透明度 ,
但有时有碍于玻片标本外表的洁净 , 尚有待研究解决 。
本研究得到桂林市 第八 中学刘 汉章高级教师的指导 , 在此表示感谢 。
今 考 文 、 做
楼允东等 . 关于改革石蜡切片工艺的试验 . 动物杂志 , 1 086 ; ( l ) : 3 、 “
周百嘉 . 樟油在植物标本制作上的若干优点 . 广西植物 , 1 9 80 , ( 1 ) : l ~ 4
林鉴钊 , 谢宝贵 . 植物制片一步二重染色混合液的研究 . 广西农学院学报 , 1 9 86 ,
( 2 )
: 1 3、 2 0
朱浩然 . 植物制片技术学上册 . 北京 : 人民出版社 , 1 9 6 D
李正理 . 植物制片学 . 北京 : 科学出版社 , 1 9 7 8
郑若玄 . 实用细胞学技术 . 北京 : 科学出版社 , 19 80
,几23
45
6
A P P L Y IN G T U R P E N T IN E IN
B O T A N IC A L S E C T IO N IN G
L i n J i a n z h a o X i e B a o g u i Y u L i f a Z h o u B i n g么il e n X i a M i n s五e n g
( D e p
a r t m e n t o f A g r o n o m y )
A B S T R A C T
T盯 p e n t i n e e a n d i s s o l v e p a r a f f i n , a n d i t e a n e l e a r 4q u i e k l y , a n d 15 v o l a t i le
a s w e l l a s n o n t o x i e , 写0 i t 15 s u i t a b l e t o b e 办 t r a n s P a r e n t a g e n t i n b o t a n i e
s e e t i o n i n g
,
T h e s e e t i o n i n g m a t e r i a l s w i t h a o g i
o s p e r m
, g y m n o s P e r m
, P t e r id o 一
p h y t e
, p t e r i d o Ph y t e
,
b r y o p h t e
, a l g a e a n d 过 u s五比 。瓜 b y m e a 双 5 o f P a r a f f i。 ,
il a n d
, p r e s s a n d w h o l e s e a l i n g 也 e t h o d s i n d i e a t de t h公 t th e s l i d e p r e P a r a t i o n s
u s i n g t u r p旧 n t i n e w e r e a s t r a 立 s P a r e n t a s t五o s e w i t h 工 y ! e n 德 . B e e a u s e t u r P e n t i n e
e a n m i笠 e d u P w i th l o w o o n e e n 七r a t i o n o f a l e o h o l , b o t五 d e五y d r a t i o n a n d
e l e a r i n g e a n b e c o tn b i n e d
, r e s u l t i n g i n a s i m P l i f i e d p r o e e d u r e a n d a i m P r o v e d
w o r k i n g e f f i e i e n e y
.
K e y w o r d s
:
b o t a n i e a l ` e e t i o n : t r a n s P a r e n t a g e n t , t u r P e n t i以 e
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