全 文 ：88 2012, Vol.33, No.19 食品科学 ※基础研究
HPLC-ABTS＋·在线法筛选细叶杜香叶部
抗氧化活性成分
裴世春1，徐玖亮2，UM Byunghun2，商亚芳2
(1. 齐齐哈尔大学食品与生物工程学院，黑龙江 齐齐哈尔 161006；
2. 韩国KIST江陵分院天然产物研究中心，韩国 江原 江陵 210-340)
摘 要：利用HPLC-ABTS＋·在线法对细叶杜香叶中的抗氧化活性成分进行筛选和分析鉴定，结果表明：在细叶杜
香甲醇提取物的乙酸乙酯萃取组分中筛选到2种抗氧化活性成分，经质谱和核磁共振波谱分析鉴定为染料木苷和槲
皮素。
关键词：细叶杜香叶；HPLC-ABTS＋·；在线检测；抗氧化活性；核磁共振；质谱
Screening of Antioxidant Components from Ledum palustre L. Leaves by Online HPLC-ABTS+ Method
PEI Shi-chun 1，XU Jiu-liang2，UM Byunghun2，SHANG Ya-fang2
(1. College of Food and Biological Engineering, Qiqihar University, Qiqihar 161006, China；
2. Natural Product Research Center, KIST Gangneung Institute, Gangneung 210-340, Korea)
Abstract：In this study, antioxidant compounds from Ledum palustre L. leaves were screened and identified by using an
online high-performance liquid chromatography (HPLC)-ABTS+· screening system. Two antioxidant compounds from the
ethyl acetate fraction in methanol extract were obtained. By mass spectroscopy (MS) and nuclear magnetic resonance (NMR)
spectroscopy, both compounds were identified as genistin and quercetin, respectively.
Key words：Ledum palustre L.；HPLC-ABTS+· screening system；online detection；antioxidant activity；NMR；MS
中图分类号：TS207.3 文献标识码： A 文章编号：1002-6630(2012)19-0088-04
收稿日期： 2012-06-26
基金项目： 黑龙江省教育厅科学技术研究面上项目(12521605)
作者简介： 裴世春(1966—)，男，教授，博士，研究方向为食品营养与安全。E-mail：peisc2002cn@yahoo.com.cn
细叶杜香(Ledum palustre L. var. Angustum E.
Busch)是分布于我国大小兴安岭、长白山地区的主要天
然植物之一，是杜鹃花科杜香属常绿小灌木，其资源十
分丰富[1]。杜香属植物含有丰富的挥发油、黄酮类、香
豆素类和三萜类等化合物[2-4]。目前我国主要是针对国内
杜香属植物的挥发油成分组成及其抗菌消炎、镇咳祛痰
等药理作用进行了多方面的研究[5-6]，但对细叶杜香抗氧
化活性成分的筛选及鉴定等研究报道较少，因此，有必
要进一步对细叶杜香中的抗氧化活性成分进行分析和鉴
定，以利于该资源的充分利用。
传统的植物天然抗氧化活性成分的筛选通常是采
用先提取、分离、鉴定各种成分后再分别对各成分进行
抗氧化活性测定[7]，这一筛选方法往往费时、费力，难
以在分离过程中选定筛选目标，因此，研究者开始采用
HPLC-RSD(high performance liquid chromatography-radical
scavenger detection)在线系统对植物天然抗氧化活性成分
进行定向、快速、高效的筛选研究[8]，其中的RSD主要
是选用DPPH(1,1-d iphenyl -1-p icry lhydrazyl ) [8-9]、
ABTS(2,2’-azinobis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic
acid)等[10-13]。随着色谱技术的发展和自由基试剂的商品
化，HPLC-RSD在线筛选体系已成为开发研究天然植物
抗氧化成分筛选的主要方法之一。本实验是在前期细叶
杜香茎部抗氧化活性成分[11]研究的基础上，基于HPLC-
ABTS＋·快速筛选体系对采自大兴安岭地区的细叶杜香
叶部的抗氧化活性成分进行筛选和鉴定，旨在为细叶杜
香这一药用资源的开发利用提供新的方法和实验数据。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
细叶杜香于2011年5月采自大兴安岭地区乌尔奇汉林业局。
三氟乙酸(trifluoroacetic acid，TFA)、2,2’-联氮
双 (3-乙基苯并噻唑啉 -6-磺酸 )二铵盐 (ABTS)、过硫
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酸钾 美国 Sigma 公司；其他有机溶剂(色谱纯) 美国
Fisher Scientific公司。
1.2 仪器与设备
安捷伦1200在线高效液相色谱系统、1200质谱仪
美国Agilent公司；制备型液相色谱仪(Waters-Prep LC
4000 system)、分离柱 Hydrophere-C18(250mm×20mm，
5μm) 美国Waters公司；500MHz核磁共振仪(500MHz
Varian NMR system) 美国Varian公司。
1.3 方法
1.3.1 细叶杜香叶中抗氧化活性成分的筛选
取新鲜细叶杜香的叶清洗，室温阴干24h。用甲醇
浸泡提取3次，料液比1:5，每次48h，合并提取液，经
Whatmen 1#滤纸过滤，旋转蒸发浓缩制成浸膏；浸膏用
水溶解后，先后用环己烷、二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁
醇进行萃取后旋转蒸发浓缩待用。
取各萃取部分利用HPLC-ABTS＋·系统筛选抗氧化活
性成分，具体HPLC-ABTS＋·检测条件参考文献[11]进行。
1.3.2 细叶杜香抗氧化活性成分的分离纯化
经HPLC-ABTS＋·确认的细叶杜香抗氧化活性成
分采用制备型液相色谱仪进行分离纯化，分离柱使用
Hydrophere C18(250mm×20mm，5μm)，分离条件参考文
献[11]进行，HPLC设定条件如表 1所示。
表 1 分离HPLC的设定条件
Table 1 Condition settings for HPLC separation
时间/min 流速/
(mL/min)
乙腈体积分数/% 水体积分数/%
开始 10 15 85
40 10 40 60
50 10 95 5
60 10 100 0
1.3.3 细叶杜香抗氧化活性成分的结构鉴定
对于分离纯化的各组分中，数量和纯度达到要求的
细叶杜香抗氧化活性组分采用电喷雾质谱(ESI-MS)和核
磁共振谱(NMR)进行结构表征；ESI-MS 的离子化参数：
m/z 扫描区间为100～1000，电喷雾电压4V，电喷雾电流
0.15μA，毛细管电压15V，毛细管温度350℃，鞘气流速
20个单位，辅气流速10 个单位。NMR分析在500MHz核
磁共振仪上进行，将样品溶于CD3OD溶液中，1H和13C谱
的δ 以四甲基硅烷(TMS)为内标。
2 结果与分析
2.1 细叶杜香抗氧化活性组分的筛选
利用HPLC-ABTS＋·的抗氧化活性物质筛选系统，
对细叶杜香叶部甲醇提取物的各级萃取纯化部分进行抗
氧化活性分析，该系统是将安捷伦1200HPLC系统和装有
连接泵的ABTS＋·试剂供应以及测定系统进行了并联，其
工作原理如图 1所示，是由HPLC系统对样品的各组分进
行检测，检测分离组分的色谱波长定为330nm，检测值
为正峰值；HPLC分离的组分进入反应池中与ABTS＋·反
应，其中抗氧化活性组分将ABTS＋·还原后在检测波长为
734nm处出负峰值；为了使得正峰值与负峰值的组分保
持一致，分析前预先采用 ChemStation分析软件(安捷伦)
对两个检测器的检测时间进行了调整使其相对应，分析
结果如图 1中色谱图所示，在乙酸乙酯萃取部分中发现了
大量抗氧化活性组分，提取物的多个分离组分正峰值相
对应的ABTS＋·检测部分均观察到负峰值。
在此基础上，采用Waters-Prep LC 4000 system，分
离纯化柱Hydrophere C18(250mm×20mm，5μm)对具有抗
氧化活性的各组分进行了分离纯化，在多种分离纯化组
分中只有图1中色谱图标记的2个组分达到了核磁波谱分
析所需数量和纯度要求。
ֱ⬭ᯊ䯈min
HPLC
HPLC᷅ᄤ
⋉
⊼ᇘ
ḋક
ABTS+噝⒊⎆ ABTS+噝
⋉
ডᑨ
DADẔ⌟
UVẔ⌟
0 10 20 30 40
－1000
－500
0
500
1000
1500
1
2
m
A
U
图 1 细叶杜香乙酸乙酯萃取物的HPLC-ABTS＋·分析
Fig.1 Online HPLC-ABTS+ assay of ethyl acetate fraction in methanol
extract from Ledum palustre L.
2.2 化合物的结构鉴定
表 2 化合物的核磁共振波谱结果
Table 2 NMR spectral data of both compounds
编号
化合物1 δ 化合物2 δ
1H 13C 1H 13C
2 8.15 (s)
6 6.51 (d, J＝2.1Hz) 99.98 6.39 (d, J ＝ 2.0Hz) 99.16
8 6.68 (d, J＝2.1Hz) 102.66 6.18 (d, J＝2.1 Hz) 94.34
2’ 6.94 (d, J＝8.9Hz) 115.76 7.64 (d, J＝2.5Hz) 116.16
3’ 6.85 (d, J＝6.7Hz) 7.55 (dd, J＝10.0、2.5Hz)
5’ 6.85 (d, J＝6.7Hz) 94.42 6.89 (d, J＝8.5Hz) 115.78
6’ 6.94 (d, J＝8.9Hz) 128.56 7.55 (dd, J＝10.0、2.5Hz) 121.68
1’’ 5.06 (1H, d, J＝7.4Hz)
3.32～3.90 (5H, m)
经分离纯化的2个组分利用500MHz核磁共振仪进行
了化学位移(δ)、峰的类型(d)、耦合常数(J)的测定，分析
结果如表2所示，化合物1的数据与文献报道[14]的染料木
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苷数据基本一致，故鉴定分离化合物为染料木苷，化合
物2的数据与文献[15]报道的槲皮素数据基本一致，故鉴
定分离化合物为槲皮素。
为了进一步验证2个组分的结构，利用电喷雾质谱进
行了检测，其结果如图 2所示，ESI-MS图谱中化合物1的
分子离子峰[M＋H]＋的m/z 值为433.03，光谱数据与文献
报道的染料木苷一致[7]，化合物2的分子离子峰[M＋H]＋
的m/z 值为303.20，光谱数据与文献报道[7]的槲皮素基本
一致。
ᶧ᭭᳼㣋
m/zm/z
⁲Ⲃ㋴
O
OH
OH
OH
OH
OH O
2
345
6
7
8
9
10
1
2
3
4
5
6
葡萄糖 O
OOH
OH
2
345
6
7
8
9
1
2 3
4
5
6
60
40
20
0 50 100 150 200 250 300 350 400 450 100 150 200 250 300 350
80
60
40
20
80
Ⳍ
ᇍ
Є
ᑺ
/%
Ⳍ
ᇍ
Є
ᑺ
/%
222.92
271.15
291.29
370.90
354.96
444.92
234.77 297.09
318.51
429.03
412.57 050
图 2 化合物的质谱分析图
Fig.2 Mass spectra of both compounds
3 讨 论
细叶杜香主要分布于北半球温带或寒温带地区，在
我国集中分布于大兴安岭地区落叶松林和落叶松白桦针
阔混交林，小兴安岭和长白山也有分布，其中，大兴安
岭杜香干叶年生长量达536925t，资源十分丰富[4]，但是
国内外在细叶杜香中对抗氧化活性物质筛选研究较为缺
乏，而多以挥发性成分等化学成分分析为主，大量分析
研究[3,6,16-17]表明，细叶杜香中含有秦皮素、5-羟基-4’,7-二
甲氧基黄酮、正二十八烷醇、东莨菪内酯、熊果酸、七
叶内酯、对羟基苯甲酸、对苯二酚、槲皮素、金丝桃苷
等多种成分。
传统的植物天然抗氧化活性成分的筛选通常是：采
用提取、分离、鉴定各种成分后，再分别对各成分进行
抗氧化活性测定，其中利用ABTS＋·筛选抗氧化活性物
质是一个常用的方法[18-20]，当有自由基清除剂存在时，
ABTS＋·在734nm波长处具有特征吸收峰，由于样品中的
抗氧化活性组分可以清除ABTS＋·，因而可用分光光度
法进行定性定量检测抗氧化活性成分[9]，该方法有简便、
灵敏、直接的特点。但在对成分复杂的天然植物提取物
的抗氧化性筛选时，该法最大的缺陷就是无法准确知道
复杂混合物中何种化合物具有抗氧化活性，而需要对所
有化合物进行分离纯化后经体外ABTS＋·检测才能知道
其是否具有抗氧化活性，该筛选方法不仅费时费力，而
且难以筛选到具有高活性的痕量抗氧化活性物质。
而HPLC-ABTS＋·方法体系很好的解决了这一难
题，该方法是利用具有高效分离功能的高效液相色谱
法分离化合物的同时在线与ABTS＋·试剂反应，使得
高效液相色谱仪分离检测的组分同时可确定其是否具
有抗氧化活性，确保在分离中可有目的的选择组分进
行分离纯化和结构鉴定，可提高抗氧化活性成分的筛
选效率。鉴于在线筛选抗氧化活性物质的高效性和准
确性，近来国内也有部分研究者开始利用其原理进行
天然抗氧化活性成分的筛选研究，包括耿雪飞等 [11]利
用HPLC-ABTS＋·筛选体系在细叶杜香茎部筛选到秦皮
素等抗氧化活性物质，王小淞等[9]利用HPLC-DPPH在线
筛选法从黄芩中筛选到黄芩素等5种抗氧化活性成分。
本实验基于HPLC-ABTS＋·体系在杜香叶部筛选到
染料木苷和槲皮素2种抗氧化活性成分，并利用核磁共振
对其进行了结构鉴定，虽然在HPLC-ABTS＋·检测过程
中发现了大量显示具有抗氧化性能的负峰值组分，但是
由于部分组分在杜香中的含量过少，实验中没有收集到
足够用于核磁共振结构鉴定的分离数量，因此仅分离鉴
定了2个抗氧化活性组分。
由于抗氧化活性的物质具有种类繁多、不同植物
及部位中的含量差异较大、理化性质各异等特性，因此
有些抗氧化活性成分在使用HPLC-ABTS＋·体系筛选时
会因使用萃取剂的不同而可能被漏掉，这是有待改善的
部分，即便如此，该方法也已经显现出巨大的筛选抗氧
化活性物质的优势，预计随着该研究方法体系的不断完
善，结合并联核磁共振谱和质谱等构成新体系将会有更
多新的抗氧化活性物质被尽早发现。
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