全 文 ：铁苋菜抗菌成分的提取及其抗菌效果研究
邵 阳 学 院 生 物 工 程 系 王放银 段林东 赵良忠
浙江建德维丰饲料有限公司 洪作鹏 刘 鹏
铁苋菜(Acalypha australis.L), 大戟科植物 ,
一年生草本 ,全草均可入药 ,具清热解毒 、止痢 、止
血等功效 ,民间常用于治疗肠炎 、痢疾 、尿血 、便血
等症。铁苋菜的抗菌作用虽有记载 ,但国内相关
报道极少。游兰英(1996)报道 ,铁苋菜水煎剂和
醇提物对大肠杆菌 、金黄色葡萄球菌 、志贺氏痢疾
杆菌 、枯草杆菌等有不同程度的抑菌作用。
本试验旨在研究铁苋菜有效抗菌成分的提取
工艺条件 ,并对在该工艺条件下提取的铁苋菜有
效抗菌成分提取物进行抑菌效果试验。
1 试验材料与设备
1.1 原料 新鲜铁苋菜采集于湖南省邵阳市郊
区。
1.2 培养基 细菌培养用牛肉膏蛋白胨培养基 ,
霉菌培养用查氏培养基 ,培养基在 1.05 kg/cm2、
121.3 ℃下灭菌 20 min。
1.3 供试菌种 枯草杆菌(Bacillus subtilis)、金黄
色葡萄球菌(Staphylococcus aureas)、大肠杆菌(Es-
cherichia coli)、青霉(Penicillium sp)、黑曲霉(As-
pergillus niger)、黄曲霉(As.Flavus),均由邵阳学
院生物工程系微生物教研室提供。
1.4 试验设备 真空浓缩装置 ,WS202-电热恒
温干燥箱 , YXQ-SG4.6-280A手提式压力蒸汽
消毒器 ,HH -4恒温水浴锅 ,ZK-82A 真空干燥
箱 ,7520型分光光度计。
2 试验方法
2.1 最高吸收峰的确定 取 1 mL 铁苋菜提取液
于100 mL 容量瓶中 ,定容至 100 mL ,在 7520分光
光度计上进行扫描 ,结果见图 1。
由图 1可知 ,铁苋菜提取液的最小透光度 T
值在λ271 nm处 。因 T 值与光密度(OD)值成负
相关关系 ,故最高吸收峰为 271 nm 。
2.2 提取工艺研究 经初步试验证明 ,采用热浸
法可以较好地提取铁苋菜有效抗菌成分 。由于影
图 1 铁苋菜提取液光谱特性图
响提取率的因素较多 ,经反复衡量 ,决定以料水
比 、浸提温度和浸提时间 3个因素采用正交试验
法确定铁苋菜有效抗菌成分的最佳提取工艺条
件 ,见表 1。
表 1 正交试验设计表
因素 料水比 温度(℃) 时间(min)
水平一 1∶20 100 50
水平二 1∶30 85 70
水平三 1∶40 70 90
注:料水比指铁苋菜(干物质)与加水量之比(g/mL)。
2.3 抑菌效果试验
2.3.1 活化菌种 按照培养基配方配制不同菌
种的培养基 ,在每支试管中分装5 ～ 8 mL 培养基 ,
在无菌室中接种 ,然后进行培养。大肠杆菌置于
37 ℃培养 24 h ,金黄色葡萄球菌和枯草杆菌置于
30 ～ 32 ℃培养 24 h ,青霉 、黑曲霉 、黄曲霉置于 30
～ 32 ℃培养 48 h 。
2.3.2 抑菌滤纸片制备 用打孔机制备直径为 7
mm的滤纸片若干张 ,将滤纸片放入待测样品提
取液中浸泡4 h ,然后用真空干燥箱干燥 ,备用。
2.3.3 无菌水制备 在试管中加入 10 mL 蒸馏
水 ,塞上棉塞 ,灭菌备用。
2.3.4 菌悬液制备 在无菌室中挑取少许活化
菌种放入 10 mL 无菌水中 ,震荡 ,制成菌悬液备
用。
2.3.5 稀释液制备 用 10倍稀释法制成稀释样
液(1 mL/10 mL),备用 。
—18— 中国饲料 2004年第 9 期
DOI :10.15906/j.cnki.cn11-2975/s.2004.09.007
2.3.6 倒平板 用移液管吸取稀释样液1 mL ,放
入培养皿中 ,待培养基冷却到 40 ℃以下时倒平
板。
2.3.7 放抑菌滤纸片 在培养基凝固后 ,用无菌
镊子夹取抑菌滤纸片 ,将其均匀地放在含菌平板
上 ,6片/皿 ,并作 2个重复 。
2.3.8 培养 培养条件与培养时间同 2.2.1。
2.3.9 抑菌效果观察 观察 、测量抑菌圈大小 ,
确定抑菌效果。
2.4 最低抑菌浓度测定
2.4.1 液体培养基配制 按要求配制细菌和霉
菌的液体培养基 ,每支试管分装8 mL ,在 121.3 ℃
下湿热灭菌20 min 。
2.4.2 铁苋菜提取液处理 将在最佳提取工艺
条件下提取的铁苋菜提取液准确配制成 2 %、3
%、4 %、5 %、6 %、8 %、10 %、12 %的系列浓度 ,
然后各取 1 mL 注入已灭菌的液体培养基中。
2.4.3 接种与培养 在每支试管中注入 1 mL菌
悬液稀释样液 ,分别置于其适宜条件下培养 24或
48 h ,观察其生长情况 。每个样液浓度作 2个重
复 ,并作一个未接种菌种的空白对照组 。
2.4.4 最低抑菌浓度确定
2.4.4.1 细菌 用 7520型分光光度计测定在波
长为 550 nm 处的细菌培养液的 OD值 。培养液
OD值与培养液内细菌繁殖速度呈正相关 ,OD值
升高越快 ,表示培养液内细菌繁殖速度越快 。由
于培养液中加入了铁苋菜提取物 ,有一定抑菌作
用 ,可以延缓细菌培养液的 OD 值上升。若细菌
培养液的吸光度与空白对照组一致 ,表明该培养
液中完全没有细菌的生长繁殖 ,则该样液浓度即
为铁苋菜提取液的最低抑菌浓度。
2.4.4.2 霉菌 用目视观察法 ,根据有无霉菌生
长来确定最低抑菌浓度。
3 试验结果及分析
3.1 提取工艺条件 按照正交试验方案 ,共做完
9次试验 ,然后分别用 7520型分光光度计在 271
nm处测定稀释液的 OD值 ,3次测定的平均值见
表2 。
表2表明 ,影响提取率的主要因素为料水比 ,
其次是浸提时间和浸提温度;最佳提取工艺条件
为料水比 1∶30 、提取温度85 ℃、浸提时间90 min。
3.2 抑菌效果试验 采用上述最佳工艺条件提
表 2 正交试验结果
序号 料水比 温度(℃) 时间(min) OD
1 1∶20 100 90 0.622
2 1∶20 85 50 0.626
3 1∶20 70 70 0.542
4 1∶30 100 70 0.714
5 1∶30 85 90 0.743
6 1∶30 70 50 0.674
7 1∶40 100 50 0.727
8 1∶40 85 70 0.557
9 1∶40 70 90 0.658
I 1.790 2.063 2.023
II 2.131 1.926 1.813
III 1.942 1.874 2.027
极差 0.341 0.189 0.214
效应值 0.114 0.063 0.071
取铁苋菜的有效抗菌成分 ,将提取原液分成两份 ,
一份直接用于制作抑菌滤纸片 ,一份经浓缩后制
作抑菌滤纸片(浓缩比 1∶5),同时进行抑菌效果
试验 ,抑菌效果试验观察结果见表 3。
表 3 不同浓度铁苋菜提
取液的抑菌效果(以抑菌圈直径计) mm
试验菌种 大肠杆菌 金黄色葡萄球菌 枯草杆菌 青霉 黑曲霉 黄曲霉
提取原液 9.7 9.8 13.8 10.7 10.1 9.9
浓缩液 11.8 12.9 15.1 12.1 11.8 11.1
注:抑菌圈直径系3个重复的平均数。
由表 3中数据分析可知 ,铁苋菜提取液原液
和浓缩液对大肠杆菌 、金黄色葡萄球菌 、枯草杆
菌 、青霉 、黑曲霉和黄曲霉均有显著的抑菌作用 ,
且浓缩液的抑菌效果强于原液 。
3.3 最低抑菌浓度 采用上述最佳工艺条件提
取铁苋菜有效抗菌成分的最低抑菌浓度试验结果
见表 4。
表 4 铁苋菜提取液的最低抑菌浓度 %
试验菌种 大肠杆菌 金黄色葡萄球菌 枯草杆菌 青霉 黑曲霉 黄曲霉
最低抑菌浓度 1.2 1.0 1.0 0.5 0.4 0.6
注:1、最低抑菌浓度系 3个重复的平均数;2 、10 mL微生物培养液中仅加相应浓度铁苋菜提取
液1 mL ,即稀释10倍。
由表 4可知 ,铁苋菜提取液对大肠杆菌 、金黄
色葡萄球菌 、枯草杆菌 、青霉 、黑曲霉和黄曲霉的
最低抑菌浓度分别为 1.2 %、1.0 %、1.0 %、0.5
%、0.4 %和 0.6 %(mL/100 mL)。
4 结语
4.1 提取工艺试验结果表明 ,铁苋菜有效抗菌成
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—19—2004 年第 9期 中国饲料
糖的α-1 ,3阿拉伯糖苷键 ,生成阿拉伯糖 、木糖
及低聚木糖 ,有的不水解阿拉伯糖苷键 ,而可生成
阿拉伯糖基低聚木糖 ,从而可降低因阿拉伯木聚
糖产生的粘稠度 。β-葡聚糖酶 ,尤其是内环 1 , 3
-β -葡聚糖酶参与水解 1 ,3-β -葡糖苷键 ,从 β
-葡聚糖中释放出葡萄糖 ,进而降低 β -葡聚糖
粘稠度。
4.3 GXC 对血清生化指标的影响 本试验中
GXC使仔猪血清钙浓度下降(P<0.05),血清磷也
下降(P<0.01),碱性磷酸酶活力明显升高(P <
0.05),表明 GXC 对钙 、磷代谢有显著影响 ,与国
内外报道相一致 。
GXC使血清总蛋白含量升高(P<0.01),表明
蛋白质的合成代谢加强。本试验还发现血清尿素
氮含量明显下降(P<0.01),一般认为血清非蛋白
氮含量降低意味着蛋白质分解速度的降低 ,氮的
留存时间延长。
4.4 GXC 对神经内分泌的影响 本研究发现
GXC可以提高仔猪血清中 T3 含量(P<0.05),但
对T4含量无显著影响(P>0.05)。T3水平升高是
GXC能促进生长的重要原因之一。笔者推测 ,
GXC促进T3 水平升高的原因可能是:1)GXC 中可
能含有提高 T3 水平 、促进生长的物质;2)通过促
进对营养物质的消化和吸收 ,间接影响到下丘脑
-脑垂体-甲状腺轴或交感神经 ,引起 TRH 及
TSH 水平变化 ,从而导致 T3水平的变化。
生长激素能促进氨基酸转运进入细胞 ,促进
蛋白质和核酸的合成 ,使尿氮排出量减少 ,同时可
以增加 RNA 聚合酶活性 ,加速 mRNA 合成 ,促进
肝脏及肌细胞分裂增殖及使细胞体积增大。本研
究发现 ,饲粮中添加 GXC能显著提高血清中生长
激素水平(P <0.05),笔者推测 ,GXC可能是间接
影响到下丘脑-腺垂体的调节 ,引起生长激素水
平变化 , IGF-I如何介导生长激素的促生长作用
的机理尚不清楚 。
本研究发现 ,GXC 使血清胰岛素水平显著提
高(P<0.01),血清胰岛素水平升高 ,使同化作用
加强 ,增强糖原 、脂肪 、蛋白质和核酸的合成。笔
者推测 , GXC可能通过提高对营养物质的消化和
吸收 ,使血中葡萄糖 、氨基酸 、脂肪酸等含量升高 ,
从而刺激胰岛素的分泌。
本研究还发现:1)GXC 能显著提高血清中胃
泌素水平(P<0.01)。胃泌素能强有力地刺激胃
酸分泌 ,增加胃蠕动 ,刺激胰蛋白酶分泌及胆囊收
缩等作用 。笔者推测 ,这可能是因为:酶制剂提高
了蛋白质的消化率 。在胃窦部部分消化的蛋白
质 、肽及氨基酸可促使胃泌素释放 。2)GXC使血
清中甲状旁腺素水平显著降低 , 这和血清钙 、磷
水平降低是一致的。甲状旁腺激素是调节机体内
钙 、磷代谢的主要内分泌激素 。3)GXC 显著提高
下丘脑和腺垂体中 cAMP 含量(P <0.05)。下丘
脑中 cAMP浓度的升高 ,可增强下丘脑内分泌机
能 ,使下丘脑分泌的促进腺垂体激素释放的物质
水平升高 。腺垂体中 cAMP 浓度的升高 ,可增强
腺垂体内分泌机能 ,使血清生长激素等垂体激素
水平升高 。
4.5 GXC对内源消化酶的影响 外源性酶制剂
对内源性酶的影响一直是有关专家探索的焦点 ,
有证据表明添加外源性酶可刺激某些内源性消化
酶的分泌(Dovgan 等 , 1986;Myashkanskene 等 ,
1986)。本试验也证实了这一点 ,至于作用机理尚
不十分清楚 ,一般认为饲粮中加入可分解纤维 、淀
粉和蛋白质的酶 ,肠道中供进一步分解或吸收的
养分量就会增加 ,从而刺激了机体消化系统的发
育和酶的分泌 。
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编:071000]
—23—2004 年第 9期 中国饲料