全 文 ：cyteswereincubatedwithAngⅡ toestablishthehy-
pertrophymodelofprimaryculturedcardiomyocytesin
neonatalrats.AST10 mg· L-1 or20 mg· L-1 were
addedwithAngⅡ simultaneouslytoobserveitsprotec-
tiveefectsoncardiomyocytes.Thediameterandtheto-
talproteincontentofcardiomyocyteweremeasured.
Theintracelularfreecalciumconcentration([ Ca2+] i),
activityofsarcoplasmicreticulumCa2+-ATPases(SER-
CA)andactivityofcalcineurin(CaN)weredetermined.
Results　Comparedwithcontrolgroup, diameterand
totalproteincontentofcardiomyocyteinducedbyAng
Ⅱ wereincreasedsignificantly, whichwereinhibited
byAST10 mg· L-1 and20 mg· L-1 , respectively(P
<0.05 orP<0.01).[ Ca2+ ] iwasdecreased(P<
0.01, respectively), theactivityofSERCAwasin-
creased(P<0.01, respectively)andtheactivityof
CaNwasdecreased(P<0.05orP<0.01)byAST10
mg· L-1 and20mg·L-1 , respectively.Conclusion　
Primaryculturedcardiomyocytesofneonatalratsare
protectedbyASTfromhypertrophyinducedbyAngⅡ
bydecreasing[ Ca2+ ] i, increasingtheactivityofSER-
CAandinhibitingtheactivityofCaN.
Keywords:astragalosideⅣ;angiotensinⅡ;myocardi-
alhypertrophy;[ Ca2+] i;sarcoplasmicreticulumCa2+-
ATPases;calcineurin;primaryculture
齐墩果酸对顺铂耐药胃癌 SGC-7901细胞
增殖的影响及其机制研究
李鸿梅 ,李雪岩 ,蔡德富 ,张　琪 ,刘吉成
(齐齐哈尔医学院中心实验室 ,黑龙江 齐齐哈尔　161006)
中国图书分类号:R284.1;R329.24;R342.22;R735.202.2;
R979.1
文献标识码:A 文章编号:1001-1978(2009)10-1334-04
摘要:目的　探讨齐墩果酸对顺铂耐药胃癌 SGC-7901细胞
增殖的影响及其作用机制。方法　体外诱导建立人胃癌顺
铂耐药细胞株 SGC-7901/CDDP, MTT比色法检测 SGC-7901/
CDDP细胞活力;适时荧光定量 PCR分析凋亡相关基因 Bcl-
2及 BaxmRNA的表达。结果　MTT实验证明齐墩果酸对
SGC-7901/CDDP细胞的生长有抑制作用 , 100 μmol· L-1齐
墩果酸作用 72h对 SGC-7901/CDDP细胞的抑制率达 62%,
并表现为时间和剂量依赖性;适时荧光定量 PCR实验证明 ,
SGC-7901/CDDP细胞经齐墩果酸处理后 , 促凋亡基因 Bax
表达上调 , 抗凋亡基因 Bcl-2表达下调。结论　齐墩果酸在
体外能够抑制 SGC-7901/CDDP细胞增殖 , 并使促凋亡基因
Bax表达升高 ,抗凋亡基因 Bcl-2表达降低 , 上调 Bax和下调
Bcl-2 mRNA的表达可能是其作用机制之一。
关键词:齐墩果酸;胃癌;SGC-7901;顺铂耐药;Bcl-2;Bax
收稿日期:2009-06-19,修回日期:2009-08-12
基金项目:黑龙江省教育厅资助项目(No11531439)
作者简介:李鸿梅(1975-),女 , 博士生 , 助理研究员 ,研究方向:肿
瘤分子生物学 , Tel:0452-2663886;E-mail:lhmls@sohu.
com;
刘吉成(1958-),男 ,博士 ,教授 ,博士生导师 ,研究方向:
分子药理学和肿瘤药理学 , 通讯作者 , Tel:0452-2663103,
E-mail:qyybliu@126.com
　　胃癌为发生于胃上皮组织的恶性肿瘤 ,其发病
率占消化道癌肿的 40% ～ 50%,居消化道肿瘤第一
位。在我国 ,胃癌发病死亡率为各种癌症之首。目
前手术治疗的大部分是在胃癌进展期进行 ,而且单
纯手术疗效甚差。作为综合治疗重要组成部分的化
疗 ,是当今治疗胃癌的重要手段 ,较为有效的药物有
5-氟尿嘧啶 、顺铂 、阿霉素[ 1]等。在化疗药物中 ,顺
铂仍为目前胃癌患者新辅助化疗和术后辅助化疗及
胃癌体外药敏实验最常选用的经典药物之一 。但是
胃癌细胞对顺铂耐药性的产生是顺铂疗效降低的主
要原因 ,胃癌患者癌细胞对顺铂耐药性的存在降低
了化疗的实际疗效 ,而且由于耐药的发生 ,常导致化
疗失败 ,从而限制了铂类药物在临床上的应用。
凋亡通路的缺陷被认为是恶性肿瘤细胞异常增
生和对化疗药物抵抗的主要原因 [ 2] ,因此诱导肿瘤
细胞凋亡已经成为治疗肿瘤的一个有效途径 。
齐墩果酸(oleanolicacid, OA)是一种天然来源
的药物 ,广泛存在于世界各地的食物 、医学草本植物
和其它植物中 ,以游离或结合成苷的形式存在。近
年来 ,人们对齐墩果酸抗肿瘤的作用机制研究较多 ,
研究发现 ,齐墩果酸可以通过多种机制抑制结肠癌
细胞和肺癌细胞增殖[ 3 ～ 5] 。但是齐墩果酸是否能抑
制顺铂耐药胃癌 SGC-7901细胞增殖及其可能的机
制并未见报道 。
·1334· 中国药理学通报　ChinesePharmacologicalBuletin　2009 Oct;25(10):1334 ～ 7
本研究通过药物持续接触细胞培养的方法 ,逐
步递增顺铂的浓度 ,体外诱导建立人胃癌顺铂耐药
细胞株 SGC-7901/CDDP, 探讨齐墩果酸对 SGC-
7901/CDDP细胞增殖的作用及其机制 ,为胃癌的非
手术治疗和天然抗肿瘤药物的开发提供理论和实验
依据。
1　材料与方法
1.1　材料　SGC-7901细胞株(中国科学院上海细
胞库);顺铂 (cisplatin),冻干型(山东齐鲁制药厂;
批号:6040122DC),由哈尔滨医科大学附属第一医
院中心实验室曹峰林教授慧赠;齐墩果酸购自中国
药品生物制品检验检定所。齐墩果酸用 DMSO溶
解配制成浓度为 80 mmol· L-1的原液 , -20℃储
存;使用时用含 10%小牛血清 RPMI1640培养基稀
释成不同浓度的工作液 。RPMI1640和小牛血清购
自 Gibco。 SYBRExScriptTMRT-PCRkit(PerfectRe-
alTime)为 TaKaRa公司产品。
1.2　方法
1.2.1　人胃癌 SGC-7901细胞的培养　常规复苏人
胃癌 SGC-7901细胞 , 按贴壁方法培养 , 培养基为
RPMI1640,每 100ml含青霉素 1万单位 ,链霉素 10
mg,胎牛血清 15 ml,用灭菌的 5.6% NaHCO3溶液
调 pH值至 7.2。置于 CO2孵箱 , 37℃、5% CO2条件
下培养 ,细胞生长至近融合状态时 ,用 0.25%胰酶
消化传代 ,每周 1 ～ 2次 。
1.2.2　体外诱导法建立顺铂耐药的人胃癌细胞株
SGC-7901/CDDP　对数生长期的胃癌细胞株 SGC-
7901用顺铂 100μg· L-1的 RPMI1640培养液培养
2 wk后 ,将细胞消化传代 ,用正常 RPMI1640培养
液悬浮细胞 ,细胞再次贴壁后形态恢复 ,将顺铂药物
浓度提高到每毫升 200ng,在此浓度下维持 2wk;方
法同上依次将药物浓度提高到 300、400、500、1 000
μg· L-1。在 1 000 μg· L-1药物浓度下维持培养 ,
初步得到 SGC-7901 /CDDP细胞株 。
1.2.3　齐墩果酸对 SGC-7901 /CDDP细胞增殖的影
响　实验设对照组和齐墩果酸处理组 。齐墩果酸处
理组分别以终浓度为 40、60、80、100μmol·L-1处理
细胞 ,每毫升细胞培养液中 DMSO不超过 50μl。以
5×107 cels· L-1接种于 96孔培养板中 ,每组均设 3
个平行孔 ,分别培养 12、24、48和 72 h。实验终止前
4 h每孔加入 MTT20 μl,培养结束时以 5 000 r·
min-1离心 10min,弃上清 。每孔再加入 DMSO200
μl,振荡 10 min后 ,用酶标仪在波 长 490nm处测定
吸光度值 ,计算齐墩果酸处理细胞的生存率 /% =
(各实验组 OD值 /对照组 OD值)×100% [ 6] ,绘制
细胞生长曲线。
1.2.4　实时荧光定量 PCR检测 SGC-7901/CDDP
细胞 Bax、Bcl-2mRNA的表达　100μmol·L-1齐墩
果酸处理细胞 72 h后 ,用 RNAisoReagent(TaKaRa
公司)抽提细胞总 RNA。操作按 RNAisoReagent说
明书进行 。紫外分光光度分析及琼脂糖凝胶电泳检
测总 RNA的含量 、纯度及完整性。
引物由 TaKaRa公司设计合成 ,引物序列如下:
Bcl-2:上游引物序列 , 5′-TGAACCGGCATCTGC
ACAC-3′;下游引物序列 , 5′-CGTCTTCAGAGA
CAGCCAGGAG-3′,产物长度:116bp;Bax:上游引
物序列 , 5′-AGACACCTGAGCTGACCTTGGAG-
3′;下游引物序列 , 5′-GTTGAAGTTGCCATCAGC
AAACA-3′,产物长度:197 bp。 β-actin上游引物序
列:5′-AAGAGAGGCATCCTGACCCT-3′;下游引
物序列:5′-TACATGGCTGGGGTGTTGAA-3′,产
物长度:218bp。
逆转录反应:在 2700型 PCRSystem扩增仪上
按 SYBRExScriptTMRT-PCRKit反转录试剂说明书
进行 cDNA的合成 ,反应参数为:反转录反应 37℃
15 min,反转录酶的失活反应 85℃ 5 s。
PCR反应:PCR反应采用 SYBRPremixExTaq
(PerfectRealTime)kit试剂 ,在 ABI7300荧光定量
PCR仪(美国 ABI公司)上进行 PCR反应 。设置检
测文件 ,反应条件如下:第 1步是预变性 , 95℃预变
性 10s,共 1个循环。第 2步是 PCR反应 , 95℃变性
5s, 60℃退火 31 s,共 40个循环。整个过程中收集
荧光 ,反应结束后 ,使用 SequenceDetectionsoftware
version1.2.3软件 (AppliedBiosystems公司)分析
PCR过程各检测样本的 Ct(Thresholdcycle)值 , Ct
值随模板浓度增大而减少。由熔解曲线判断 PCR
反应的特异性 。用基于 2-■■Ct方法进行相对定量
分析 [ 7] 。
1.3　统计学分析　应用 SPSS12.0分析数据 ,两组
间比较采用 t检验;MTT实验为析因设计 ,采用析因
方差分析 。
2　结果
2.1　齐墩果酸对 SGC-7901/CDDP细胞增殖的影
响　MTT实验表明同一时点不同浓度的 OA对
SGC-7901 /CDDP细胞的抑制作用 ,随浓度的升高而
增强;同一浓度 OA在不同时点对细胞的生长抑制
作用随时间的延长而增强 ,见 Fig1。
2.2　齐墩果酸对 SGC-7901/CDDP细胞 Bcl-2和
BaxmRNA表达的影响
2.2.1　齐墩果酸对 SGC-7901/CDDP细胞 Bcl-2
mRNA表达的影响　100 μmol· L-1 OA处理 SGC-
7901 /CDDP细胞 72h后 Bcl-2mRNA的表达 ,见 Fig
2。与对照组相比 ,齐墩果酸处理组 Bcl-2 mRNA表
达下降了 78%(t=3.746, P<0.05)。
·1335·中国药理学通报　ChinesePharmacologicalBuletin　2009 Oct;25(10)
Fig1　EfectofOAonSGC-7901 /CDDPcelproliferation
atdiferentconcentrationsandtime
Fig2　Effectof100μmol· L-1 OAonexpressionofBcl-2mRNA
　　＊P<0.05vscontrolgroup
2.2.2　齐墩果酸对 SGC-7901/CDDP细胞 BaxmR-
NA表达的影响 　100 μmol· L-1 OA处理 SGC-
7901/CDDP细胞 72 h后 BaxmRNA的表达 ,见 Fig
3。与对照组相比 ,齐墩果酸处理组 BaxmRNA表达
升高了 160%(t=4.063, P<0.05)。
3　讨论
　　近年来辅助化疗和新辅助化疗在临床被越来越
多的应用 ,可是并未明显延长进展期胃癌患者的生
存时间 [ 8, 9] ,因为胃癌患者化疗的成功率由于化疗
耐药的影响而明显受限。顺铂仍为目前胃癌患者新
辅助化疗和术后辅助化疗及胃癌体外药敏实验最常
选用的经典药物之一 。但是胃癌患者癌细胞耐药性
的存在降低了顺铂的实际疗效 ,甚至导致胃癌化疗
的失败 ,因此限制了顺铂的临床应用 。
　　为阐明胃癌细胞对顺铂化疗耐药的机制 ,逆转
临床耐药 ,在体外建立理想的胃癌顺铂化疗耐药细
胞株成为研究肿瘤耐药的细胞生物学变化的前提和
基础。目前国内外建立肿瘤耐药细胞株的方法通常
Fig3　Efectof100μmol· L-1 OAonexpressionofBaxmRNA
　　＊P<0.05vscontrolgroup
有 3种 ,即药物浓度梯度递增持续作用法[ 10] 、小剂
量药物间歇诱导法 [ 11] 和大剂量药物间歇诱导
法[ 12] 。本研究采用药物浓度梯度递增持续作用法
在体外建立了耐药细胞株 SGC-7901 /CDDP。
　　MTT实验结果表明 ,高浓度(60、80和 100 μmol
·L-1)齐墩果酸在各处理时间都能够明显抑制
SGC-7901 /CDDP细胞增殖(P<0.05)。而低浓度
(40 μmol·L-1)的齐墩果酸在处理 72 h才能抑制
SGC-7901 /CDDP细胞的增殖(P<0.05);这一浓度
的齐墩果酸在处理 12、24和 48 h对 SGC-7901/CD-
DP细胞的增殖没有明显的抑制作用(P>0.05)。
　　Bcl-2是目前发现的与凋亡关系密切的原癌基
因之一。 Bcl-2基因家族成员分为两类:Bcl-2类 ,是
凋亡抑制因子 ,包括 Bcl-2、Bcl-xl和 Bcl-w等;Bax
类 ,为凋亡促进因子 ,包括 Bax、Bak、Box等 。 Bcl-2
作用于线粒体与核孔复合体上的信号分子 ,控制细
胞信号传导来延长细胞生存 [ 13] ;Bcl-2蛋白还可以
和 Bax蛋白相结合 ,从而抑制细胞凋亡 。 Bcl-2与
Bax基因表达的强弱决定了细胞接受凋亡信号后细
胞存活与否 , 如果 Bax表达占优势 , 细胞死亡 , 而
Bcl-2表达占优势时 ,细胞存活 [ 14] 。 Bcl-2与 Bax表
达的强弱是决定凋亡与否的主要因素 ,一方面 , Bcl-
2不仅可能通过抑制细胞色素 C等从线粒体的释放
调控着线粒体渗透性转换孔的开启 , 从而抑制
Caspase-3的活化 ,还可能参与抑制 Caspase-3的合
成 ,因此 , Bcl-2主要通过线粒体途径对细胞凋亡进
行调节[ 15] 。本实验结果表明 , 100 μmol· L-1齐墩
果酸处理 SGC-7901/CDDP细胞 72 h后 ,细胞凋亡
相关基因 Bcl-2以及 Bax的表达均发生明显变化 ,
表现为抗凋亡的 Bcl-2基因表达下调 ,而促凋亡的
Bax基因表达上调 ,齐墩果酸对 SGC-7901/CDDP细
胞增殖的抑制作用可能是通过上调 Bax基因的表达
以及下调 Bcl-2基因的表达而实现的;齐墩果酸可
·1336· 中国药理学通报　ChinesePharmacologicalBuletin　2009 Oct;25(10)
能通过线粒体途径而诱导细胞发生凋亡。本研究结
果为临床胃癌的化疗和天然抗肿瘤药物的开发提供
了坚实的理论和实验依据 。
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EfectsofoleanolicacidonproliferationofSGC-7901 /CDDP
invitroanditspotentialmechanisms
LIHong-mei, LIXue-yan, CAIDe-fu, ZHANGQi, LIUJi-cheng
(CentralLaboratoryofQiqiharMedicalCollege, QiqiharHeilongjiang　161006, China)
Abstract:Aim　Toinvestigatetheefectsofoleanolic
acidonproliferationofSGC-7901/CDDPcelsinvitro
anditspotentialmechanisms.Methods　Modelof
SGC-7901 celsresistanttocisplatin(SGC-7901 /CD-
DP)wasestablishedinvitro.MTTassaywasusedtoe-
valuatetheviabilityofSGC-7901 /CDDPcelsinvitro.
Real-timePCRwasusedtoanalysetheexpressionof
Bcl-2andBaxgene.Results　MTTassayshowedthat
oleanolicaciddramaticalyinhibitedtheproliferationof
SGC-7901/CDDPcelsinvitro, morethan62% SGC-
7901/CDDPcelswereinhibitedwhenthecelswere
treatedwith100 μmol· L-1 oleanolicacidfor72 h;
Real-timePCRshowedthatBax(pro-apoptoticgene)
wasupregulatedandBcl-2 (anti-apoptotic)wasdown-
regulatedafterbeingtreatedwitholeanolicacid.Con-
clusions　Theseresultssuggestthatoleanolicacidin-
hibitsproliferationofSGC-7901 /CDDPcelsinvitro,
anditspotentialmechanismsmaybethroughtheup-
regulationofBaxandthedownregulationofBcl-2.
Keywords:oleanolicacid;gastriccancer;SGC-7901;
cisplatin-resistance;Bcl-2;Bax
·1337·中国药理学通报　ChinesePharmacologicalBuletin　2009 Oct;25(10)