全 文 ：近年来 , 湿热淤血作为慢性肾病的一个重要致病因素 , 其对
肾病的发生 、发展以及预后转归的影响越来越受到关注。湿热淤
血伤肾是肾病的基本特点 , 且往往贯穿病程的始终。湿热淤血伤
肾持续存在最终发展为肾纤维化而肾功能衰竭。复方仙草颗粒
主要药物八仙草 、三七等为广西特色中草药 , 其中君药八仙草入
少阴经 , 能清湿热 ,散淤消肿 、解毒利尿 , 三七有散淤止血 ,减少尿
蛋白排泄 , 保护肾功能 ,薏苡仁健脾利水渗湿 ,制大黄活血祛淤泄
浊 , 黄芪益气健脾利尿 ,配伍甘草可调和诸药。诸药合用 ,共奏清
热利湿泄浊 , 散淤解毒消肿之功 , 祛邪不伤正 , 扶正不留邪 , 使邪
祛正安。本研究表明随着 IgAN大鼠病程的发展 , 造模大鼠可出
现肾小球不同程度的硬化 ,通过各组间实验数据的分析 , 可发现
经过复方仙草颗粒治疗的模型大鼠 , 肾小球硬化(GSI)明显降
低 , TGF-β 1、Smad2蛋白表达收到抑制 , 而 Smad7蛋白表达上
调 , 该作用与蒙诺相近似。因此 , 可推测复方仙草颗粒可通过降
低 Smad2蛋白 、上调 Smad7蛋白的表达 ,从而抑制 TGF-β1的过
度表达 , 延缓 IgAN大鼠肾小球硬化的持续进展 ,而这可能是其抗
肾纤维化的重要作用机制之一。其在控制IgAN肾小球硬化方面
具有和蒙诺相似的疗效。
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收稿日期:2010-01-21;　修订日期:2010-06-30
基金项目:江苏省属高校自然科学重大基础研究项目(No.07KJA18017);江苏省高校自然科学研究计划项目(No.08KJB360011);江苏省自然科学基
金项目 (No.BK2009172);江苏省 “ 333工程 ”“青蓝工程 ”资助计划
作者简介:汤新慧(1966-),女(汉族),江苏盐城人 ,现任盐城师范学院生命科学与技术学院教授 ,博士学位 ,主要从事药理 、毒理 、药用植物资源研究
工作.
＊通讯作者简介:高　静(1966-),女(汉族),江苏镇江人 ,现任江苏大学药学院教授,博士研究生导师 ,主要从事肝脏药理 、神经药理等研究工作.
齐墩果酸乌苏酸积雪草酸护肝及
抗氧化作用的比较研究
汤新慧 1 , 严丽芳1, 2 , 徐力致 3 , 高　静2＊
(1.江苏省滩涂生物资源与环境保护重点建设实验室;盐城师范学院生命科学与技术学院 ,江苏 盐城　224051;
2.江苏大学药学院 ,江苏 镇江　212013;　3.南京大学医学院 , 江苏 南京　210093)
摘要:目的 研究比较 3种五环三萜化合物齐墩果酸(OA)、乌苏酸(UA)、积雪草酸(AA)的护肝及抗氧化作用。方法 建
立小鼠 D-氨基半乳糖 /脂多糖(D-GalN/LPS)肝损伤模型 , 检测 OA、UA、AA对损伤小鼠血清天冬氨酸氨基转移酶
(AST)、丙氨酸氨基转移酶(ALT)活性以及肝组织脂质过氧化的影响;运用体外自由基清除试验 , 测定 3种化合物对超氧
阴离子和羟自由基的清除作用。结果 100 mg· kg-1 OA、UA、AA均能有效抑制 D-GalN/LPS引起的小鼠血清 AST及
ALT活性的显著上升;明显减少肝组织脂质过氧化产物 MDA的生成;一定浓度 3种化合物能有效清除超氧阴离子和羟
自由基 , 且 3个化合物清除自由基能力存在显著差异。结论 3种五环三萜化合物 OA、UA、AA均具有显著护肝和抗氧化
活性 , 且 AA、UA的护肝作用优于 OA,其机理可能与其具有更强的清除自由基能力有关。
关键词:齐墩果酸;　乌苏酸;　积雪草酸;　D-氨基半乳糖 /脂多糖;　抗氧化作用
DOI标识:doi:10.3969 /j.issn.1008-0805.2010.11.047
中图分类号:R284　　文献标识码:B　　文章编号:1008-0805(2010)11-2824-03
ComparativestudyontheHepatoprotectiveandAnti-OxidationEfectsofOleanolic
Acid, UrsolicAcidandAsiaticAcid
TANGXin-hui1 , YANLi-fang1, 2 , XULi-zhi3 , GAOJing2＊
(1.JiangsuProvincialKeyLaboratoryofCoastalWetlandBioresourcesandEnvironmentalProtection;Schoolof
LifeScienceandTechnology, YanchengNormalColege, Yancheng, 224002, China;2.SchoolofPharmacolo-
gy, JiangsuUniversity, Zhenjiang, 212013 , China;3.SchoolofMedicine, NanjingUniversity, NanjingJiang-
su210093, China)
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时珍国医国药 2010年第 21卷第 11期 LISHIZHENMEDICINEANDMATERIAMEDICARESEARCH 2010VOL.21NO.11
Abstract:ObjectiveTocomparethehepatoprotectiveandanti-oxidativeeffectsofthreepentacyclictriterpenoids, oleanolic
acid(OA), ursolicacid(UA)andasiaticacid(AA).MethodsD-GalN/LPS-inducedliverinjurymodelwasusedtoevaluate
theefectsofOA, UAandAAontheactivitiesofserumaspartateaminotransferase(AST)andalanineaminotransferase(ALT)
andthelevelofliverlipidperoxidationinmice.Scavengingactivityonsuperoxideanionandhydroxylradicalsofthreecompounds
wereinvestigatedtodeterminetheiranti-oxidativeefects.ResultsPretreatmentwith100 mg· kg-1 OA, UAandAA, dovusly
reversedtheincreaseofserumASTandALTactivitiesandthelevelofliverlipidperoxidationinducedbyD-GalN/LPSinmice.
OA, UAandAA, atconcentrationsrangingfrom 50 to450mol· L-1 , showeddose-dependentsuperoxideanionandhydroxyl
radicalscavengingactivity.Inaddition, itwasalsofoundthatthereweredifferencesamongthreecompoundsinscavengingactivi-
tyonfreeradicals, anti-oxidativeandhepatoprotectiveeffects.Conclusion Threepentacyclictriterpenoids, OA, UAandAA,
havesignificanthepatoprotectiveactivityagainstD-GalN/LPS-inducedliverinjuryinmice.Moreover, thehepatoprotectionand
anti-oxidationofUAandAAarestrongerthanthatofOAandthemechanismsmightberelatedtotheirmorepowerfulscavenging
activitiesonfreeradicals.
Keywords:Oleanolicacid(OA);　Ursolicacid(UA);　Asiaticacid(AA);　D-Galactosamine;　Lipopolysaccharide;　
Anti-oxidation
　　五环三萜类化合物分布广泛 ,资源丰富 , 毒性较低 ,具有广泛
的药理作用和重要的生物活性 ,尤其在抗炎 、护肝 、抗肿瘤以及机
体免疫调节等方面已经显现出令人关注的药理特性。其中以齐
墩果酸(OA)研究最为清楚 ,作为抗肝炎药物亦早已应用于临床。
乌苏酸(UA)为 OA的同分异构体 , 现代药理学研究发现 , UA不
仅具有 OA相同的生物学作用 , 而且在防治肝炎 、抗肿瘤等方面
比 OA的作用更强大 [ 1, 2] 。积雪草酸(AA)为 OA、UA的结构类似
物 , 除具有刺激胶原合成 、抗炎 、增强认知 、抗肿瘤 [ 3]等药理作用
外 , 我们近期的研究首次发现其具显著抗肝损伤作用 [ 4] 。
本研究拟运用 D-氨基半乳糖 /脂多糖(D-GalN/LPS)小鼠
急性肝损伤和体外自由基清除试验 ,比较 OA、UA及 AA的护肝
及抗氧化作用 , 为更好地开发利用五环三萜化合物提供依据。
1　材料与仪器
1.1　动物 ICR小鼠 ,雄性 , 体质量 18 ～ 22 g, 购自南京医科大学
实验动物中心 , 许可证号:SCXK(苏)2002-0031。
1.2　试剂 齐墩果酸 ,中国药品生物制品研究所产品;乌苏酸 、积
雪草酸 , Sigma-Aldrich公司产品;联苯双酯(DDB), 北京协和制
药厂产品。
D-氨基半乳糖 、脂多糖 、黄嘌呤 、四唑氮蓝 、细胞色素 C、黄
嘌呤氧化酶 、超氧化物歧化酶(SOD), Sigma公司产品。天冬氨
酸氨基转移酶(AST)、丙氨酸氨基转移酶(ALT)、丙二醛(MDA)
检测试剂盒 , 南京建成生物工程研究所产品。其余试剂均为国产
分析纯。
1.3　仪器 Hitachi7600 -020全自动生化分析仪 , 日立公司产
品;7520分光光度计 , 上海分析仪器厂产品;BiofugePrimoR冷
冻离心机 , Kendro公司产品;电热恒温水浴锅 , 北京市医疗设备
厂产品。
2　方法
2.1　D-GalN/LPS急性肝损伤模型的建立 小鼠分 6组:正常
组 、D-GalN/LPS损伤组 、OA、UA、AA组和阳性对照组。正常组
和损伤组小鼠以 0.2 ml· (10 g)-1体质量生理盐水连续灌胃 5
d, OA、UA、AA组以及阳性对照组分别以 100 mg· kg-1 3种化合
物及 200 mg· kg-1DDB同样方式灌胃;第 6天正常组小鼠按 0.2
ml· (10g)-1腹腔注射生理盐水 ,其余组小鼠腹腔注射 600mg·
kg-1 D-GalN;1 h后 ,除正常组小鼠腹腔注射 0.2 ml· (10 g)-1
生理盐水外 , 其它各组腹腔注射 LPS(10 g· kg-1), 同时小鼠给
予禁食不禁水。 LPS注射 12 h后 , 取血 , 分离血清 , 待测血清
ALT、AST活力。处死小鼠后 , 取部分肝组织 , 制备肝组织匀浆 ,
待测脂质过氧化水平 。
2.2　酶活力的测定 分离得到的各组小鼠血清 , 全自动生化分析
仪测定血清 ALT及 AST活性。
2.3　脂质过氧化水平测定 制备的肝组织匀浆 , 妥巴比法测定脂
质过氧化水平。
2.4　超氧阴离子清除实验 利用黄嘌呤 /黄嘌呤氧化酶氧自由基
发生系统测定化合物对超氧阴离子的清除率 [ 5] 。实验分为 11
组:对照组 , OA三个剂量组(50, 150, 450 mol· L-1), UA的三个
剂量组(50, 150, 450 mol· L-1), AA三个剂量组(50, 150, 450
mol· L-1), 阳性对照组。在 3 ml的 10 mmol· L-1 KH2PO4 -
KOH缓冲液 (pH 7.4)中加入相应浓度 3种化合物 、100 mol·
L-1黄嘌呤及 0.02 U· ml-1黄嘌呤氧化酶 , 加入 100 mol· L-1四
唑氮蓝 ,于 25℃条件下孵育 5 min, 于 550 nm处测定吸光值 , 以
100 mol· L-1 SOD作为阳性对照。超氧阴离子清除率计算公式:
(■AControl-■ADrug)/■AControl×100 %, ■A=A0 min-A5min。
2.5　羟自由基清除试验 利用 CuSO4 /细胞色素 C自由基发生系
统检测化合物对羟自由基的清除率 [ 6] 。实验分组同 “ 2.4”项。
在 3 ml的 0.15 mmol· L-1磷酸缓冲液(含 100 mol· L-1维生素
C、100 mol· L-1 CuSO4及 100 mol· L-1细胞色素 C, pH 7.4)中
加入相应浓度 3种化合物 , 反应体系于 25 ℃中孵育 90 min, 于
550nm处测定吸光值 ,以 60 mol· L-1维生素 E作为阳性对照。
羟自由基清除率计算公式:(■AControl-■ADrug) /■AControl100
%, ■A=A0min-A90min。
2.6　统计方法 进行单因素方差分析(onewayanalysisofvari-
ance, onewayANOVA), 各处理组的组间差异采用 SNK-q
(StudentNewmanKeuls-q)检验进行比较。
3　结果
3.1　对 D-GalN/LPS诱导的小鼠急性肝损伤酶活力及肝组织
脂质过氧化水平的影响 由表 1可看出 , D-GalN/LPS损伤小鼠
血清 ALT及 AST活性急剧升高 , 而预先予 100 mg· kg-1的 3种
化合物灌胃的小鼠血清 ALT及 AST活性均显著低于损伤组 ,
OA、UA、AA对血清 ALT活性升高的抑制率分别为 71.6 %,
88.4%和 100 %;对血清 AST活性升高的抑制率分别 68.3%,
84.7%和 95.6%。比较 3种化合物的护肝作用 ,发现其降酶效果
存在显著差异:AA对损伤小鼠血清 ALT酶活的抑制作用强于
UA, 而 UA强于 OA(P<0.01);AA和 UA对损伤小鼠血清 AST
酶活的抑制作用强于 OA(P<0.01)。
小鼠 D-GalN/LPS损伤后 , 肝组织脂质过氧化水平升高为
正常小鼠的 2.9倍 , 表明产生了肝组织的氧化损伤。而与损伤小
鼠相比 , 预先以 3种不同化合物灌胃给药的小鼠肝组织 MDA水
平有不同程度下降 , OA、UA、AA对损伤引起的肝组织脂质过氧
化水平升高的抑制率分别为 63.5 %, 83.8 %和 91.5 %, 其中
AA、UA抑制作用强于 OA(P<0.01)。
3.2　对超氧阴离子的清除作用 对超氧阴离子的清除试验结果
(表 2)显示 , 3种化合物对超氧阴离子有明显的清除作用 , 并且
随着浓度的增加 ,其清除作用随之加强。比较相同浓度不同化合
物对超氧阴离子的清除作用发现 , AA、UA的清除能力超过了相
同浓度的 OA, 450 mol· L-1AA对超氧阴离子的清除率(55.5%)
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LISHIZHENMEDICINEANDMATERIAMEDICARESEARCH 2010VOL.21NO.11 时珍国医国药 2010年第 21卷第 11期
及 UA(49.4%)与同浓度 OA(40.4%)相比均有显著差异(P<
0.01)。
表 1　OA、UA、AA对小鼠酶活力及肝组织脂质过氧化的影响( x±s)
组别 剂量/mg·kg-1
sALT活性
/U· L-1
sAST活性
/U· L-1
脂质过氧化水平
/nmolMDA·mg-1· h-1
正常对照 - 36.0±12.1 100.8±13.9 3.81±0.43
D-GalN/LPS - 1 202.9±273.8＊ 1 543.2±319.2＊ 10.96±0.96＊OA 100 367.4±120.5# 557.8±80.6# 6.42±0.84#
UA 100 171.7±56.1#@ 236.7±23.8#@ 4.97±0.66#@AA 100 24.3±4.7#@＄ 164.2±36.5#@ 4.42±0.57#@DDB 200 100.7±46.4# 416.7±52.3# 6.8±0.76#
　　与正常对照组比较 , ＊P<0.01;与D-GalN/LPS组比较 , #P<0.01;与OA组比
较 , @P<0.01;与UA组比较, ＄P<0.01;n=8
表 2　OA、UA、AA对超氧阴离子的清除作用( x±s)
组别 吸光度的减少值(■A550)
自由基的清除率
(%)
正常对照 243.1±16.7 -
OA　 50μmol· L-1 201.3±23.6＊ 17.2
150μmol· L-1 178.5±18.7＊ 26.6
450μmol· L-1 145.0±18.2＊ 40.4
UA　 50μmol· L-1 178.7±17.6＊ 26.5
150μmol· L-1 147.6±10.2＊ 39.3
450μmol· L-1 123.0±12.8＊# 49.4
AA　 50μmol· L-1 172.8±20.6＊ 28.9
150μmol· L-1 124.7±18.2＊ 48.7
450μmol· L-1 108.3±11.3＊# 55.5
SOD　 100μmol· L-1 131.3±12.0＊ 46.0
　　与正常对照组比较 , ＊P<0.01;与 450 μmol· L-1OA组比较 , #P<
0.01;n=7
3.3　对羟自由基的清除作用 由表 3可知 , 150及 450 μmol·
L-1 3种化合物对羟自由基具有显著清除作用。比较其对羟自由
基的清除能力发现 , 3种化合物对羟自由基清除能力有显著差
异 , OA, UA、AA(450 μmol· L-1)对羟自由基的清除率分别为
41.8 %、50.9 %和 63.9 %, 清除能力由强到弱的顺序为 AA>
UA>OA(P<0.01)。
表 3　OA、UA、AA对羟自由基的清除作用( x±s)
组别 吸光度的减少值(■A550)
自由基的清除率
(%)
正常对照 446.0±24.5 -
OA　 50μmol· L-1 411.3±22.0 7.8
150μmol· L-1 315.0±27.4＊ 29.4
450μmol· L-1 259.7±26.6＊ 41.8
UA　 50μmol· L-1 410.7±31.2 7.9
150μmol· L-1 271.8±20.9＊ 39.1
450μmol· L-1 219.0±17.8＊# 50.9
AA　 50μmol· L-1 403.7±29.9 9.5
150μmol· L-1 220.9±16.8＊ 50.5
450μmol· L-1 161.0±28.4＊#@ 63.9
VitE　 60μmol· L-1 215.0±17.8＊ 51.8
　　与正常对照组比较 , ＊P<0.01;与 450 μmol· L-1OA组比较 , #P<
0.01;与 450μmol· L-1UA组比较 , @P<0.01;n=7
4　讨论
D-GalN/LPS肝损伤是筛选护肝药 、研究药物作用原理最常
用的肝损伤模型 [ 7] 。本研究运用 D-GalN/LPS小鼠急性肝损伤
试验研究比较 3种五环三萜化合物 OA、UA、AA的护肝作用 ,实
验结果表明 , 3种化合物对 D-GalN/LPS诱导的小鼠急性肝损伤
酶活力升高均有显著抑制作用 ,且 3种化合物降酶效果存在显著
差异:降低血清 ALT活性能力强弱的顺序为 AA>UA>OA;降低
血清 AST活性能力强弱的顺序为 AA, UA>OA;同时检测了肝组
织脂质过氧化产物 MDA的量 , 发现 3种化合物均能显著减少
MDA的生成 , 表明其均具有抗氧化作用 , 且其抗氧化能力大小顺
序为 AA, UA>OA,该结果提示 , 3种化合物护肝效果存在显著差
别 , 且该差异可能与它们的抗氧化能力强弱不同有关。运用自由
基清除试验 ,进一步比较 3种化合物的体外抗氧化能力 , 发现 , 一
定浓度 3种化合物对自由基具有显著清除作用 ,且不同化合物的
自由基清除率存在显著差异 ,其清除自由基能力强弱的顺序与在
体抗氧化的顺序一致(AA, UA>OA)。该结果进一步证实 ,该类
化合物护肝作用强弱与其抗氧化作用之间可能存在相关关系。
OA护肝 、解毒作用已得到肯定 , 其机制认为是多重的 , 由于
化学结构存在活泼的双键 、羟基 、羧基官能团 ,如与毒物结合易发
生化学反应 , 达到解毒目的;能对抗自由基 , 抑制脂质过氧化物 ,
有膜稳定作用 [ 8];增加肝细胞谷胱甘肽酶活力 , 直接抑制转氨酶
活性 , 抑制 P4502E1的表达和活性 ,并且使肝细胞 DNA及蛋白质
合成速率明显增高 ,有促进肝组织修复的作用。 UA和 OA分子
组成完全相同 ,二者为同分异构体 , 在保肝 、护肝机制可能与 OA
有相似之处 , 并且其特色可能重在对抗自由基 、抑制脂质过氧化
物 [ 1, 9] 。而 AA和 OA分子结构非常类似 ,比 OA多 2个羟基 , 推
测 , 羟基数目的增加是 AA抗氧化能力增强的重要原因之一 。分
析三者结构的差异 ,可以认为分子构象的不同以及羟基数目的差
别可能是该类化合物抗氧化和保护肝细胞能力强弱不同的重要
原因。
鉴于五环三萜类化合物的优势以及 OA护肝 、解毒等方面比
较成熟的临床用途 ,而 AA及 UA在抗氧化和保护肝细胞方面均
显著优于 OA, AA及 UA护肝 、解毒等功效值得关注 , 有望开发成
为功能强大的护肝新药。
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