全 文 ：收稿日期:2012-07-02; 修订日期:2012-12-04
基金项目:国家自然科学基金( No． 81173462)
作者简介:何 琨 ( 1990-) ，男 ( 汉族) ，辽宁朝阳人，现为第二军医大学
2008 级药学本科学员．
* 通讯作者简介:张 宏( 1969-) ，男( 汉族) ，四川成都人，现任中国人民
解放军第二军医大学副教授，博士学位，主要从事皮肤瘢痕的药物防治研
究工作．
齐墩果酸对小鼠成纤维细胞 L929 的影响
何 琨1，张 妍1，2，张蓝可3，刘伯石1，秦路平1，张 宏1*
(1．中国人民解放军第二军医大学，上海 200433;
2．宁夏医科大学药学院，宁夏 银川 750004; 3．上海市鞍山实验中学，上海 200433)
摘要:目的 研究齐墩果酸对 L929 小鼠成纤维细胞的影响。方法 将齐墩果酸( oleanolic acid，OA) 不同浓度作用于 L929
小鼠成纤维细胞 12，24 和 48 h，MTT法检测各组细胞活性，流式细胞仪检测细胞周期及凋亡率。同时，研究齐墩果酸灌
胃的急性毒性。结果 齐墩果酸能够显著抑制 L929 成纤维细胞活性，并呈剂量和时间依赖性，12，24 和 48 h半数抑制率
的剂量分别为 27． 69，18． 24和 28． 34 μg /ml。流式检测结果显示，齐墩果酸明显诱导 L929 成纤维细胞凋亡，并呈一定的
剂量依赖性，中等剂量下能将细胞周期阻滞于 G1 期。小鼠最大浓度最大容积灌胃齐墩果酸后( 3 g /kg) ，观察 2 周，无 1
只死亡。结论 齐墩果酸能够诱导成纤维细胞凋亡，灌胃给药无急性毒性。
关键词:齐墩果酸; 成纤维细胞; 凋亡; 周期
DOI标识:doi: 10． 3969 / j． issn． 1008-0805． 2013． 02． 012
中图分类号:R285． 5 文献标识码:A 文章编号:1008-0805( 2013) 02-0281-03
Effects of oleanolic acid on L929 fibroblasts in mice
HE Kun1，ZHANG Yan1，2，ZHANG Lan-ke3，LIU Bai-shi1，QIN Lu-ping1，ZHANG Hong1*
( 1． School of Pharmacy，Second Military Medical University，Shanghai，200433，China; 2． School of Phar-
macy，Ningxia Medical University，Yinchuan，750004，China; 3． Shanghai An Shen Experimental Junior High
School，Shanghai 200043，China)
Abstract: Objective To investigate the effects of oleanolic acid on the mouse fibroblasts cell．Methods L929 cells were treated
with different concentrations of oleanolic acid at 12，24 and 48 hours． Cell viability was assessed by MTT assay． The cell apoptosis
and cell cycle arrest was observed by flow cytometry． At the same time，the acute toxicity of oleanolic acid was observed in mice by
intragastric administration． Results MTT method showed that different concentrations of oleanolic acid obviously decreased L929
cells viability in a dose － and time － dependent manner． The IC50 for 12，24 and 48 hours was 27． 69，18． 24 and 28． 34 μg /ml，re-
pectively． Flow cytometry method showed that different concentrations of oleanolic acid obviously induced L929 cells apoptosis in a
dose － dependent matter． Moderate dosage of oleanolic acid caused G1 stage arrest． When treated with the maximum concentration
and the largest volume of oleanolic acid by intragastric administration ( 3 g /kg) ，no mice was died in two weeks． Conclusion -
Oleanolic acid can induce L929 apoptosis obviously，and there is no acute toxicity in intragastric administration．
Key words: Oleanolic acid; Fibroblasts; Apoptosis; Cell cycle
增生性瘢痕是皮肤创伤愈合后瘢痕持续增生的一种病理现
象，是病理性瘢痕的一种。它的形成与成纤维细胞的异常增生、
胶原过度生成和细胞外基质过度沉淀有关，常见于深度烧伤，炎
症和外伤等的创伤后修复。目前的研究显示成纤维细胞是瘢痕
形成的效应细胞，也成为瘢痕研究的重点所在［1，2］。齐墩果酸是
天然三萜类化合物，广泛分布于食品药品中。本研究采用小鼠成
纤维细胞(L929)作为研究材料，通过 MTT 测定细胞活力并计算
其半数抑制率;通过流式细胞仪测定成纤维细胞的凋亡作用和细
胞周期。同时，采用小鼠灌胃法研究其急性毒性，以确定齐墩果
酸防治瘢痕增生的安全性和有效性，为进一步的开发利用提供科
学依据。
1 材料与仪器
1． 1 药物 齐墩果酸(含量≥98%)购自陕西永健制药有限公
司。由于齐墩果酸不易溶于水溶性介质中，且易于从溶液中析
出，所以本细胞实验中所用的齐墩果酸溶液不配制成母液，而是
以临配临用的方法。实验前先秤取适量的齐墩果酸，加入 DMSO
溶解配成 9mg /ml浓度，再加入培养基稀释至所需浓度溶液(60，
45 ，30，15，7． 5，3． 75 μg /ml)。DMSO终浓度低于 0． 7%。急性毒
性试验中，3 g齐墩果酸加入 40 ml水中，再加入 1． 5g羧甲基纤维
素钠配成混悬物。
1． 2 试剂 羧甲基纤维素钠(国药) ;磷酸缓冲液(PBS) (Hyclone
公司，美国) ;胎牛血清(FBS) (Hyclone公司，美国) ;RPMI1640 细
胞培养液(Sigma 公司，美国) ;二甲基亚砜(DMSO) ，(Sigma 公
司，美国) ;0． 25%胰酶(Trypsin) (Sigma 公司，美国) ;链霉素、青
霉素双抗液(100 ×) (碧云天生物研究所) ;甲基四唑蓝(Sigma公
司，美国，临用前用 PBS配制成 0． 5% MTT) ;Annexin V － FITC细
胞凋亡检测试剂盒(凯基生物公司)。
1． 3 动物与细胞 ICR 小鼠 40 只，雌雄各半，体质量 18 ～ 22 g，
由第二军医大学动物实验中心提供。小鼠成纤维细胞株 L929，
由第二军医大学提供。
1． 4 仪器 CO2 恒温培养箱(MCO －15AC，Sanyo，日本) ;倒置相
差显微镜(CKX41，Olympus，日本) ;台式离心机(Anke TGL －
16G，上海安亭科学仪器厂，中国) ;双人单面超净工作台(SW －
CJ － 2FD，苏州空气净化设备厂，中国) ;十万分之一分析天平(BS
224 S，Sartorius，德国) ;漩涡混合器(XW － 80A，上海琪特分析仪
器有限公司，中国) ;全自动定量绘图酶标仪(Bio － Tex Elx800，
Fisher，美国) ;流式细胞仪(FACSCalibur，Becton Dickson，美国)。
2 方法
2． 1 小鼠 L929 成纤维细胞的培养 L929 细胞在含体积分数
·182·
LISHIZHEN MEDICINE AND MATERIA MEDICA RESEARCH 2013 VOL． 24 NO． 2 时珍国医国药 2013 年第 24 卷第 2 期
10%胎牛血清，1%链霉素、青霉素双抗液的 RPMI1640细胞培养基
中 37℃、体积分数 5%CO2，饱和湿度条件下传代培养，每天换液 1
次，细胞生长成片，相互融合铺满瓶底约 80%时进行传代［3］。
2． 2 齐墩果酸对细胞活力的影响 取对数期生长的细胞，0． 25%
不含 EDTA胰酶消化，加入新鲜培养基吹打，调整细胞浓度 2 ×
104 /ml，100μl /孔接种于 96 孔板中，在 5%CO2，37 ℃的细胞培养
箱内培养 12 h，至细胞铺满板底 80%时弃去培养基，加入不同浓
度含药培养基，每个浓度做 6 个复孔，分别于 12，24，48 h 三个不
同时间点对细胞进行拍照(图 1) ，再加入 0． 5%的 MTT液 20 μl /
孔，继续培养 4 h 后弃上清，加入 150 μlDMSO，振荡 10 min。在
570 nm检测波长下，自动酶联免疫分析仪测定 OD 值，实验重复
3 遍。
图 1 不同浓度齐墩果酸作用不同时间对 FB的影响(100 ×)
2． 3 细胞凋亡率 取对数生长期的细胞，用 0． 25%胰酶消化，加
入新鲜培养基吹打，并调整细胞浓度到 5 × 105 /ml，2ml /孔接种于
6孔板中。在 5%CO2，37 ℃的细胞培养箱内培养 12h，至细胞铺
满板底 80%时弃去培养基，加入 0，15，30，45，60 μg /ml不同浓度
的含药培养基 2 ml。药物作用 12h 后，弃去含药培养基，用
0． 25%不含 EDTA的胰酶消化，弃去胰酶加入培养基终止消化，
用移液器轻轻吹打细胞成悬液后，将细胞悬液移至离心管中，1
000 r /min离心 5 min 收集细胞，用 PBS 洗涤细胞两次(1 000 r /
min离心 5 min)收集 1 × 106 个细胞。加入 500 μl 的 Binding
Buffer悬浮细胞;加入 5 μl Annexin － V FITC 混匀后，加入 5 μl
Propidium Iodide，混匀;室温、避光、反应 10 min，流式细胞仪检
测。
2． 4 细胞周期 按细胞凋亡检测方法收集 1 × 106 个细胞后用
75%乙醇固定 4℃保存过夜，染色前用 PBS洗去固定液;加入 100
μl Rnase A 37℃水浴 30 min;再加入 400 μl PI染色混匀，4℃避光
30 min;上流式细胞仪检测。
2． 5 急性毒性试验 经预试，齐墩果酸灌胃小鼠不能测定 LD50，
即测定最大耐受量(MTD)。
取 ICR小鼠 40 只，雌雄各半，体质量 19 ～ 21 g。分为空白组
(n = 20)和给药组(n = 20) ，禁食不禁水 12 h后，以动物能够接受
的最大浓度 0． 075 g /ml的齐墩果酸，最大容积 0． 4 ml /10 g． B． W
的剂量灌胃，动物日摄入量相当于人临床日用量的 400 倍。连续
观察 14 d，记录动物有无毒性反应以及实验前后体重变化，以不
产生死亡的剂量为最大耐受量(MTD)。
2． 6 统计学处理 采用 SPSS19． 0 统计学软件进行分析，数据以珋x
± s表示。多组间进行方差分析，组间比较采用 t检验。
3 结果
3． 1 不同浓度不同给药时间对细胞活力的影响 本实验中考察
了 6 个不同给药浓度和 3 个不同时间点齐墩果酸对 FB活力的影
响，并计算了半数抑制率值。MTT 结果显示详见图 2，齐墩果酸
对细胞活力有显著的抑制作用并在前 24 h 呈明显的时间依赖
性，在三个时间点都呈显著的浓度依赖性。细胞形态观察表明，
当较低剂量刺激时，细胞对刺激作出反应，由梭形收缩变圆，但细
胞死亡数较少;随着刺激强度的增大，细胞变形，抑制率大幅上
升。当药物浓度大于 30 μg /ml后，细胞边界不清晰，培养板的底
部呈现弥漫状。
与对照组比较，* P ＜ 0． 05，＊＊P ＜ 0． 01
图 2 不同给药浓度和给药时间对细胞活力的影响
3． 2 细胞凋亡率 从凋亡双染的图(图 3)可看出，空白组凋亡率
很低为 5． 86%，给药刺激后凋亡率分别为 45． 81%，37． 68%和
37． 29%，呈现剂量依赖的关系。说明齐墩果酸能够诱导细胞凋
亡，且与浓度呈正相关关系。
图 3 细胞凋亡的流式检测图
·282·
时珍国医国药 2013 年第 24 卷第 2 期 LISHIZHEN MEDICINE AND MATERIA MEDICA RESEARCH 2013 VOL． 24 NO． 2
3． 3 细胞周期 在流式细胞周期测定中(图 4) ，最高峰表示的是
G1 的 DNA含量(2N) ，紧接着后面的较平缓的为 S 期和 G2 的
DNA含量(2N － 4N) ，最后 1 个峰表示 M 期的 DNA 含量(4N)。
由表 1 可知，空白组和给药组中 30 μg /ml、15μg /ml 浓度组 DNA
含量有显著差异(P ＜ 0． 01) ，60 μg /ml 浓度组由于细胞凋亡过
多，对实验结果有影响。
图 4 细胞周期流式图
3． 4 急性毒性实验 ICR 小鼠灌胃齐墩果酸后 3 h，除个别动物
自发活动减少外无明显异常。观察期内，动物发育健康，肌肉丰
满，被毛浓密而有光泽、紧贴其身，眼睛明亮而灵活、无异常的分
泌物，肛周洁净，摄食正常，四肢健壮，自发活动正常，体质量逐渐
增加。14 d内未见动物死亡及毒副反应。实验结束时肉眼尸解
未见明显病理改变。体质量变化详见表 2。
表 1 不同浓度齐墩果酸对细胞周期的影响(珋x ± s)
齐墩果酸浓度
/μg·ml －1
细胞周期分布(%)
G1 期 S期 G2 期
0 72． 08 ± 1． 27 27． 92 ± 1． 20 0
15 81． 81 ± 1． 28＊＊ 18． 19 ± 2． 25＊＊ 0
30 83． 98 ± 0． 05＊＊ 16． 02 ± 3． 02＊＊ 0
60 70． 96 ± 1． 80 29． 04 ± 2． 40 0
与对照组比较，＊＊P ＜ 0． 01
表 2 灌胃给药实验小鼠体质量结果(珋x ± s)
组别 0d 7d 14d
雌 对照 20． 73 ± 1． 10 29． 45 ± 1． 63 32． 78 ± 1． 81
实验 21． 01 ± 1． 05 30． 73 ± 1． 66 34． 03 ± 1． 81
雄 对照 20． 71 ± 0． 68 33． 60 ± 1． 18 38． 54 ± 1． 35
实验 20． 66 ± 0． 59 33． 35 ± 1． 72 38． 65 ± 1． 37
4 讨论
增生性瘢痕的形成与成纤维细胞的异常增生和凋亡障碍密
切相关，且成纤维细胞是细胞外基质的主要分泌细胞，所以诱导
成纤维细胞对瘢痕的治疗有着极其重要的意义。齐墩果酸为天
然三萜类化合物，广泛分布于食品和药用植物中，常用于抗炎镇
痛［4，5］，保肝［6 ～ 9］，抗肿瘤［10 ～ 12］。我们先前的研究发现［13］，齐墩
果酸对兔耳瘢痕增生具有显著的抑制作用。L929 小鼠成纤维细
胞为常用的体外筛选抑制瘢痕药物模型［14，15］，为进一步证实对
瘢痕细胞的作用，我们观察了齐墩果酸对小鼠成纤维细胞 L929
的影响，结果发现其具有显著诱导成纤维细胞凋亡的作用。MTT
法研究显示，浓度为 60 g /ml时，12 h抑制率可达到 76． 7%，24 h
可达到 91． 62%。在 7． 5 μg /ml时，12 h抑制率也可达 19． 51%，
说明齐墩果酸对其活性有显著的抑制作用。镜下观察，细胞呈明
显凋亡形态。流式结果显示，与空白组对照，齐墩果酸明显诱导
L929 细胞凋亡。流式图显示，细胞主要表现为晚期凋亡，表明齐
墩果酸具有强大的诱导凋亡作用。与空白组对比，所选四个浓度
凋亡作用均明显。流式细胞周期分析结果显示，空白组和给药组
中 30，15μg /ml浓度组 DNA 含量有显著差异(P ＜ 0． 01) ，G1 期
DNA含量显著升高，提示齐墩果酸将细胞阻滞在 G1 期，从而抑
制其增殖。60μg /ml组可能由于药物浓度较高，造成大量细胞凋
亡，影响了增殖周期的检测结果。急性毒性试验表明，齐墩果酸
无明显毒性，提示齐墩果酸仅对异常的瘢痕细胞产生毒性作用。
这些试验结果表明，齐墩果酸具有良好的抑制皮肤瘢痕增生的作
用，这种作用与其抑制瘢痕细胞增殖及诱导其凋亡有关，但确切
的作用机制还有待进一步的研究。
参考文献:
［1］ 李广帅，陈言汤，牛扶幼，等．病理性瘢痕的发病机制［J］．郑州大学
学报(医学版) ，2006，41(6) :1025．
［2］ 魏爱华，连 石．痛痒介质与增生性瘢痕研究进展［C］． 2008 北京
地区皮肤科学术年会论文集，2008:37．
［3］ 司徒振强，吴军正．细胞培养，第 1 版［M］．西安:世界图书出版西
安公司，1996:72．
［4］ Choi J，Jung HJ，Lee KL，et al． Antinociceptive and anti － in?ammatory
effects of the saponin and sapogenins obtained from the stem of Akebia
quinata［J］． J Med Food，2005，8(1) :78．
［5］ Lukaczer D，Darland G，Tripp M，et al． A pilot trial evaluating ME-
TA050，a proprietory combination of reduced iso － alpha acids，rosemary
extract and oleanolic acid in patients with arthritis and ?bromyalgia
［J］． Phytother Res，2005，19(10) :864．
［6］ Yim TK，Wu WK，Pak WF，et al． Hepatoprotective action of an oleanolic
acid － enriched extract of Ligustrum lucidum fruits is mediated through
an enhancement on hepatic glutathione regeneration capacity in mice
［J］． Phytother Res． 2001，15(7) :589．
［7］ Kim K － A，Lee J － S，Park H － J，et al． Inhibition of cytochrome P450
activities by oleanolic acid and ursolic acid in human liver microsomes
［J］． Life Sciences，2004，74(22) :2769．
［8］ Liu J，Wu Q，Lu Y － F，Pi J． New insights into generalized hepatoprotec-
tive effects of oleanolic acid:Key roles of metallothionein and Nrf2 in-
duction［J］． Biochemical Pharmacology，2008，76(7) :922．
［9］ Reisman SA，Aleksunes LM，Klaassen CD． Oleanolic acid activates Nrf2
and protects from acetaminophen hepatotoxicity via Nrf2 － dependent
and Nrf2 － independent processes ［J］． Biochemical Pharmacology，
2009，77(7) :1273．
［10］ Li J，Guo WJ，Yang QY． Effects of ursolic acid and oleanolic acid on
human colon carcinoma cell line HCT15［J］． World J Gastroenterol，
2002，8(3) :493．
［11］ Ovesna，Z，Vachalkova，A，Horvathova，K，et al． Pentacyclic triterpenoic
acids:new chemoprotective compounds ［J］． Minireview Neoplasma，
2004，51(5) :327．
［12］ Zou W，Liu X，Yue P，et al． c － Jun NH2 － terminal kinase － mediated
up － regulation of death receptor 5 contributes to induction of apoptosis
by the novel synthetic triterpenoid methyl － 2 － cyano － 3，12 － di-
oxooleana － 1 9 － dien － 28 － oate in human lung cancer cells［J］．
Cancer Research，2004，64(20) :7570．
［13］ Yan － Jie Wei，Xiao － Qing Yan，Li Ma，et al． Oleanolic acid inhibits
hypertrophic scarring in the rabbit ear mode［J］． Clinical and experi-
mental dermatolotgy，2010，online．
［14］ 王苗苗，于业军，刘晓萍，等．苦参碱对小鼠成纤维细胞 L929 的作
用及其机制［J］．青岛大学医学院学报，2011，47(5) :416．
［15］ 刘 敏，胡平安，丁克祥，等．不同血清浓度对小鼠成纤维细胞 L929
生长增殖和胶原蛋白分泌的影响［J］． 细胞与分子免疫学杂志，
2011，27(7) :736．
·382·
LISHIZHEN MEDICINE AND MATERIA MEDICA RESEARCH 2013 VOL． 24 NO． 2 时珍国医国药 2013 年第 24 卷第 2 期