全 文 ：第 30 卷　第 1期
2008 年 1 月
北　京　林　业　大　学　学　报
JOURNAL OF BEIJING FORESTRY UNIVERSITY
Vol.30 , No.1
Jan., 2008
收稿日期:2006--09--19
http: www.bjfujournal.cn , http: journal.bjfu.edu.cn
基金项目:国家自然科学基金项目(30271083)、黑龙江省国际合作项目(WC05C01)。
第一作者:计红芳 ,博士生。主要研究方向:环境生物技术。电话:0451--86402652　Email:jhf300@126.com　地址:150001哈尔滨工业大学
生命科学与工程系 437#。
责任作者:宋瑞清 ,教授 ,博士生导师。 主要研究方向:菌物开发及利用。电话:0451--82190232　Email:songrq@public.hr.hl.cn　地址:
150001哈尔滨工业大学生命科学与工程系。
绒白乳菇发酵液抑菌活性成分的
分离纯化及其结构鉴定
计红芳1　宋瑞清1 ,2　杨　谦1
(1 哈尔滨工业大学生命科学与工程系　2东北林业大学林学院)
摘要:为寻找抑制杨树叶枯病菌生长的活性成分 , 进行了绒白乳菇发酵液抑菌活性成分的分离纯化研究。结果表
明 ,发酵液提取物经硅胶柱层析粗分离得到 5 个组分 , 其中组分 4显现出较高的抑菌活性;组分 4 经 TLC 得到样品
A和样品 B ,其中样品 B 能够完全抑制叶枯病菌生长;薄层检测和 GC 分析判定样品 B 为单一化合物 , 纯度为
98.805%;综合UV、IR、EI--MS 和 NMR的检测结果 ,推断样品 B 的分子式是 C8H9NO , 分子量 135 , 化学名为 1--(2--吡
啶)--2--丙酮 , 在绒白乳菇发酵液中首次发现该化合物。
关键词:绒白乳菇发酵液;抑菌活性成分;分离纯化;结构鉴定
中图分类号:S718.81　　文献标识码:A　　文章编号:1000--1522(2008)01--0092--04
JI Hong-fang1;SONG Rui-qing1 , 2;YANG Qian1.Isolation , purification and structure identification of an
antimicrobial bioactive compound extracted from Lactarius vellereus fermenting liquor.Journal of
Beijing Forestry University (2008)30(1)92-95 [Ch , 10 ref.]
1 Department of Life Science and Engineering , Harbin Institute of Technology , 150001 , P.R.China;
2 College of Forestry , Northeast Forestry University , Harbin , 150040 , P.R.China.
In order to look for the bioactive substance inhibiting the growth of Alternaria alternata , the isolation and
purification of antimicrobial compound extracted from Lactarius vellereus fermenting liquor were studied.The
extraction was further extracted into five subgroup compounds with silica gel column layer , in which the
subgroup IV showed great inhibition towarding the growth and spore germination of A.alternata.Moreover ,
the subgroup IV was separated into two compounds , ie sample A and B with TLC technique.It was proved
that sample B , which was able to inhibit thoroughly the growth of this pathogenic organism , consisted of a
monomer s compound with a purity of 98.805% identified by TLC and GC.The molecular structure of
monomer s compound analysed with UV , IR , EI-MS and NMR techniques was formularized as C8H9NO with a
chemical molecular weight of 135.It is the first time to report that L .vellereus produces the anti-fungi
compound named as 1-(2-pyridinyl)-2-propanone chemically throughout fermentation.
Key words 　 Lactarius vellereus fermenting liquor;antimicrobial bioactive component;isolation and
purification;structure identification
　　杨树叶枯病是东北地区近年来较为流行的主要
林木病害之一 ,由链格孢菌(Alternaria alternata)引
起。由于防治过程中大量使用化学药剂 ,已经造成
了严重的环境污染与经济损失 ,所以寻求高效 、安
全 、无污染的绿色生物农药显得尤为迫切。据报道 ,
乳菇属中某些真菌含有多种活性物质 ,在抑菌 、抗
虫 、抗病毒 、抗肿瘤等方面显示出了巨大的开发潜
力[ 1-7] 。笔者的前期研究表明 ,绒白乳菇发酵液正丁
醇提取物对杨树叶枯病菌生长具有较强的抑制活
性 ,并且提取物对叶枯病菌菌体的膜系统有破坏作
DOI :10.13332/j.1000-1522.2008.01.022
用 ,使其电导率及呼吸强度最终呈现下降的变化趋
势。本文在此基础上 ,对绒白乳菇发酵液提取物中
抑制杨树叶枯病菌生长的活性成分进行了分离 、纯
化 ,并对其结构进行了鉴定 ,以期为开发研制新型生
物农药提供科学的理论依据与技术支持 。
1　材料与方法
1.1　菌　株
绒白乳菇(Lactarius vellereus)与杨树叶枯病菌
(Alternaria alternata)菌株均由东北林业大学提供。
1.2　方　法
1.2.1　绒白乳菇发酵液提取物的制备
将绒白乳菇菌株接种到 PD 培养基中 , 25℃摇
床(转速为 120 r min)培养 15 d后 ,将菌体滤出后余
为发酵液;将 V(发酵液)∶V(正丁醇)=1∶3萃取 3
h ,萃取 1次后 ,减压浓缩至干即得发酵液提取物 。
1.2.2　绒白乳菇发酵液提取物抑菌活性成分的分
离纯化
采用硅胶柱层析对抑菌活性成分进行粗分离 。
用分段洗脱法 ,洗脱液配比从 V(正己烷)∶V(乙酸
乙酯)=9∶1逐渐增加至 V(正己烷)∶V(乙酸乙酯)
=2∶8 ,控制流速 ,每次加入 25 mL 洗脱液 ,按每瓶 25
mL 进行收集 。用薄层色谱检测 ,成分相同者合并后
减压浓缩 ,并分别测定抑菌活性 ,活性较强部分作为
下一步骤的起始样品进一步细分。
采用制备薄层色谱分离抑菌活性物质单一组
分[ 8] 。将样品配制成一定浓度的甲醇溶液 ,用点样
器条状点样 ,以 V(正己烷)∶V(乙酸乙酯)=1∶1的
溶液为展开剂 ,上行法展开 ,碘显色后定位 ,计算每
条谱带的 R f 值 ,刮取每条谱带 ,合并相同 R f 值的谱
带 ,挥干碘后 ,用甲醇溶解 、过滤 、减压浓缩至干 ,并
进行活性测定。
1.2.3　绒白乳菇发酵液提取物的分离组分对叶枯
病菌的抑菌活性测定
采用生长速率法测定分离组分对叶枯病菌菌体
生长的影响[ 9] 。将分离组分各取 5 mg , 用 10%吐
温-80水溶液定容至 50 mL ,过滤除菌 ,各取 10 mL ,
分别与 2PDA 培养基等量混合制成平板。待冷却
后 ,在平板中央接直径为 0.5 cm 的叶枯病菌菌片 ,
重复 3次 ,25℃下培养 ,7 d后以十字交叉法测菌落
直径 ,以接种在 PDA培养基上的叶枯病菌菌片为对
照。菌体生长抑制率=[(对照净生长量-处理净生
长量) 对照净生长量] ×100%。
采用悬滴法测定分离组分对叶枯病菌孢子萌发
的影响[ 9] 。将分离组分的吐温-80水溶液与叶枯病
菌孢子悬液(3×106 个 mL)等量混合 ,置于保湿培
养皿中 , 25℃下培养 24 h , 观察孢子萌发情况 , 以
10%吐温-80水溶液为对照 。孢子萌发抑制率 =
[ (对照萌发率 -处理萌发率) 对照萌发率] ×
100%。
1.2.4　抑菌活性成分的纯度检验
采用薄层色谱(TLC)和气相色谱(GC)法检测样
品纯度。
1.2.5　抑菌活性成分的结构鉴定
采用紫外光谱(UV)、红外光谱(IR)、气质联用
(GC-MS)和核磁共振(NMR)对样品进行结构推
断[ 10] 。
1)GC--MS 分析。气相色谱条件为:初始温度
100℃,保持1 min ,以 10℃ min速率升至 250℃;进样
口温度250℃;载气(氦气)流量1 mL min。质谱分析
条件:电离方式 EI , 电子能量 70 eV ,离子源温度
260℃,扫描质量范围 20 ～ 600 amu。质谱数据库:
NIST98。
2)NMR分析。1H-NMR测试条件为:观察频率
为 400.132MHz ,所用溶剂为 CDCl3 , TMS 为内标 ,谱
宽为 8 278.146 Hz ,测试温度 22.1℃,脉冲重复时间
3.958 s ,采样 161次。13C-NMR测试条件为:观察频
率为 100.623MHz ,所用溶剂为 CDCl3 , TMS 为内标 ,
谱宽为 23 980.814 Hz ,测试温度 22.6℃,脉冲重复
时间 1.366 s ,采样 16 384次 。
1.3　数据处理
采用软件 SPSS11.5进行统计分析 ,结果以平均
数±标准误( X ±S)表示 ,方差分析采用 LSD和 IST
检验法。
2　结果与分析
2.1　发酵液提取物的分离及其对叶枯病菌的抑菌
活性测定
以不同配比的正己烷--乙酸乙酯为洗脱剂 ,经
硅胶柱层析分离后得到 7个组分 ,其中组分 1和 2 、
组分 4和 5 ,其斑点颜色与 R f 值都十分接近 ,所以
将两者各自合并为一个组分 ,共得到 5个组分。各
组分经减压浓缩 、挥干溶剂后 ,分别计算出了各组分
的得率 ,并对各组分的抑菌活性进行跟踪测定。由
表 1可知 ,组分 5的得率最高 ,为 24.46%,其他组分
的得率在 4.18%～ 19.65%之间;组分 4的得率虽只
有 4.39%,但对叶枯病菌菌体生长及孢子萌发的抑
制率分别达到了 90.26%和 95.69%,远远高于其他
组分的抑制率 ,表明抑菌活性成分主要存在于组分
4中 ,可以对组分 4进行进一步的分离。
93第 1期 计红芳等:绒白乳菇发酵液抑菌活性成分的分离纯化及其结构鉴定
表 1　发酵液提取物硅胶柱粗分离所得组分的得率
及其抑菌活性 %
TABLE 1　Extracting rate and the anti-microbial activity of
each fraction of n-butanol extract separated by silica
gel column chromatography
组分 得率 菌体抑制率 孢子抑制率
1 14.57 21.88±1.08 a 28.32±0.58 a
2 4.18 28.54±0.66 bc 36.36±0.83 bc
3 19.65 30.33±1.28 ce 39.21±1.22 ce
4 4.39 90.26±1.12 d 95.69±1.10 d
5 24.46 32.78±0.89 e 41.67±0.94 e
注:有相同字母者差异不显著(P<0.05), 无相同字母者差异显著
(P<0.05)。表 2同此。
2.2　组分 4的分离及其对叶枯病菌抑菌活性测定
组分 4经过制备性 TLC ,碘显色后 ,观察到 2条
谱带 ,颜色均为深黄色 , R f 值分别为 0.18 、0.30(见
图1a),将 2条谱带中的物质提取出来 ,编号分别为
样品A和 B ,各自称重 ,计算其得率并测定各组分的
抑菌活性。由表 2可知 ,样品 B的得率为 49.67%,
大于样品A的得率(29.19%),表明组分 4的主要成
分是样品 B;样品A的抑菌活性较低 ,对叶枯病菌菌
体生长及孢子萌发的抑制率分别为 30.42%和
40.09%,而样品B对二者的抑制率均达到了100%,
表明组分 4中起抑菌作用的主要成分是样品 B。
表 2　组分 4 分离所得组分的得率及其抑菌活性 %
TABLE 2　Extracting rate and the anti-microbial activity of sample A and B
样品 得率 菌体抑制率 孢子抑制率
A 29.19 30.42±0.76 a 40.09±1.06 a
B 49.67 100±0 b 100±0 b
2.3　抑菌活性成分的纯化结果
将样品 B进行薄层检测 ,结果呈单一的深黄色
斑点(见图 1b);样品 B 经GC-MS 分析 ,从 GC 的色
谱峰上看 ,有3个吸收峰 ,其中保留时间1.29 min的
峰为氘带试剂 ,是溶剂峰 ,采用扣除溶剂的归一化
法 ,样品 B 的纯度为 98.805%(见图 2)。结合以上
两种方法的判定结果 ,样品 B为单一化合物。
图 1　薄层层析检测结果
FIGURE 1　Results of TLC
2.4　抑菌活性成分的结构鉴定
样品 B 为淡黄色液体 ,易溶于甲醇 、乙醇 ,经
TLC展开后 ,紫外光下显荧光 ,碘显色后为棕黄色斑
点 ,喷改良的碘化铋钾显色呈阳性。结构及波谱综
合分析如下:
图 2　样品B的气相色谱图
FIGURE 2　GC of sample B
UV图谱显示 λMeOHmax 256 、275 nm。
IR(KBr , cm-1)图谱可知:在 1 713.84 cm-1处有
羰基( C O )信号;在 1 605.42 cm-1处有吡啶环
(C5H4N —)信号;在 2 921.28 、2 854.95 cm-1为—CH2
中的 C —H 键的伸缩振动 , 在 1 464.87 cm-1处为
—CH2中的C —H键的弯曲振动;在 1 379.33 cm-1处
为—CH3中的 C —H 键的弯曲振动;710.28 、891.42
cm
-1处吡啶一取代。
根据氮规则和 EI-MS 可知 ,分子离子峰为 135
(M +·),主要碎片为 120(M-CH3)、93(M-COCH2)、92
(M--COCH3)、78(120-CH2CO)、66(92--C2H2)、51(78-
HCN)、43(CH3CO)、42(CH2CO)、39(66-CHN)、27 、26 ,
经 NIST98 库检查发现此化合物与化合物 2-
Pyridylacetone的质谱图相吻合的丰度达 94%,可以
认为样品 B就是此化合物。
13
C-NMR 图谱显示共有 8 个不同的碳 ,在 δ
202.73(C-2)有羰基碳信号 , 在 δ154.19(C-4)、
144.86(C-8)、132.99(C--6)、123.97(C-5)、122.65
(C-7)处分别为吡啶环上的碳信号 ,在 δ53.12(C-
1)有与羰基相连的亚甲基信号 ,在 δ31.02(C-3)有
与羰基相连的甲基信号 ,在 δ77.37 、77.05 、76.73为
溶剂 CDCl3 的碳信号。
图 3　样品 B的结构式
FIGURE 3　Structural formula of sample B
从1H-NMR图谱中的积分面积可知 ,各种氢原
子数之比为1∶1∶1∶1∶2∶3 ,从氢谱中各峰所对应的氢
原子数目及峰形可知分子无对称性。在 δ1.833
(3H , s ,H--3)处有一个甲基信号;在 δ4.210(2H , s ,
94 北　京　林　业　大　学　学　报 第 30卷　
H--1)处有一个与羰基相连的亚甲基信号;在δ7.208
(1H ,d , J =6.4Hz ,H-5)、7.362(1H ,dd , J =7.2 、7.6
Hz ,H--7)、7.778(1H , dd , J =7.2 、7.6 Hz ,H-6)、8.541
(1H , d , J =4.8 Hz ,H-8)处的 4组峰分别为吡啶环
上的氢的信号 ,在 δ7.287处为溶剂 CDCl3 的信号。
综上所述 , 可推断化合物 B 的分子式为
C8H9NO ,分子量为 135 ,结构式如图 3所示 ,化学名
为1-(2-吡啶)-2-丙酮 ,在绒白乳菇发酵液中首次
发现该化合物。
3　结　　论
本文从绒白乳菇发酵液中分离纯化出能有效抑
制杨树叶枯病菌生长的化合物 1-(2-吡啶)-2-丙
酮 ,迄今利用绒白乳菇中的活性成分进行林业病害
防治的研究尚未见报道 。然而 ,该化合物能否作为
高效低毒的生物农药真正用于林木病害防治 ,尚需
做更多研究。
参 考 文 献
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(责任编辑　董晓燕)
95第 1期 计红芳等:绒白乳菇发酵液抑菌活性成分的分离纯化及其结构鉴定