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收稿日期:2010-02-23基金项目:武汉市重点科研课题(200718)作者简介:陈秋实(1981-),女,讲师 ,硕士 ,研究方向:药物化学;Tel:027-89645563, E-mail:chenqiushi@yahoo.cn。
从木瓜成叶中提取齐墩果酸及其
羟丙基 -β-环糊精包合工艺研究
陈秋实1 ,吴 杰 1 ,李 威 1 ,成 蓓2
(1.武汉生物工程学院制药工程系 ,湖北 武汉 430415;2.武汉大学药学院 ,湖北 武汉 430070)
摘要 目的:优选木瓜成叶中齐墩果酸的最佳提取条件及其羟丙基-β-环糊精包合工艺。方法:采用正交实验
法 , 以超声波处理时间 、提取时间 、提取温度 、料液比为影响因素 ,以齐墩果酸得率为指标优选提取工艺。然后采用
正交实验法 , 以羟丙基-β-环糊精和齐墩果酸投料比 、包合时间 、包合温度为影响因素 , 以包合物收得率和齐墩果酸
包合率的综合评分为指标 , 优选包合工艺。结果:最佳提取条件为超声波处理时间 40 min, 提取时间 70 min, 提取
温度 60℃,料液比 1∶10。最佳包合条件为羟丙基-β-环糊精和齐墩果酸投料比 1∶2, 包合时间 3.0h,包合温度 60℃。
结论:按照本实验方法可得到较高的提取率及得到稳定的包合物。
关键词 木瓜成叶;齐墩果酸;正交实验;提取;羟丙基-β-环糊精
中图分类号:QT460.4 文献标识码:A 文章编号:1001-4454(2010)05-0804-04
ExtractionofOleanolicAcidfromLeavesofChaenomelesspciosaandProcessing
TechniquesofItsHP-β-cyclodextrinInclusionCompound
CHENQiu-shi1 , WUJie1 , LIWei1 , CHENGBei2
(1.DepartmentofpharmaceuticalEngineering, WuhanBioengineeringInstitute, Wuhan430415, China;2.ColegeofPharmacy,
WuhanUniversity, Wuhan430070, China)
Abstract Objective:ToselectthebestextractionofoleanolicacidfromleavesofChaenomelesspciosaandprocessingtechniques
ofitsHP-β-cyclodextrin(HP-β-CD)inclusioncompound.Methods:Thestudywascarriedoutwithorthogonalexperiment.Ultrasonic
treatmenttime, extractiontime, temperatureofextractionandratioofmaterialtoliquorwereusedasindices.Theoptimuminclusion
techniquewaschosenbydeterminingtheoleanolicacid-bearingrate.TheprocessingtechniquesoftheHP-β-CDinclusioncompound
wasoptimizedbytakingtheratioofHP-β-CDtooleanolicacid, thetimeandtemperatureoftheinclusionprocessasfactorsandwiththe
yieldoftheinclusioncompoundandtheinclusionrateofthevolatileoilastheindices.Results:Theoptimalprocessforoleanolicacid
extractionwereasfollowing:ultrasonictreatmenttimeas40 min, extractiontimeas70 min, temperatureofextractionas60℃, ratio
ofmaterialtoliquoras1∶10.TheoptimalprocessingconditionsforHP-β-CDinclusioncompoundofoleanolicacidwereasfolowing:
theratioofHP-β-CDtooleanolicacidwas1∶2, theinclusiontimeofthecompoundwas3.0 hoursat60℃.Conclusion:Highextrac-
tionyieldofoleanolicacidandstableinclusioncompoundcanbeobtainedusingtheabovemethod.
Keywords LeavesofChaenomelesspciosa;Oleanolicacid;Orthogonaltest;Extraction;HP-β-CD
药用木瓜为蔷薇科(Rosaceae)植物贴梗海棠
Chaenomelesspeciosa(Sweet)Nakai的干燥近成熟果
实 〔1〕。国内外研究证明 ,木瓜叶中含有齐墩果酸 。
齐墩果酸(C30H48O3)为齐墩果酸烷型五环三萜类化
合物 ,为白色簇状针晶 ,无色 , 无味 ,无臭 ,熔点为
310℃,不溶于水 ,可溶于甲醇 、乙醇 、乙醚 、丙酮和氯
仿等 〔2〕。齐墩果酸是治疗急性黄疸型肝炎 、慢性病
毒性肝炎 、慢性迁延型肝炎及慢性活动型肝炎的理
想药物。它具有消炎抑菌 、降转氨酶 、降糖 、降血脂 、
抗血栓形成 、抗突变 、抗艾滋病 、抑制 HIV-1的复制
等作用〔3〕。目前 ,木瓜的果实和花都得到了利用 ,
但是木瓜的叶子还没得到有效的利用。若能将木瓜
·804· JournalofChineseMedicinalMaterials 第 33卷第 5期 2010年 5月DOI :10.13863/j.issn1001-4454.2010.05.048
叶中的齐墩果酸提取出来 ,就能变废为宝 ,让木瓜叶
成为一种资源。本实验研究木瓜成叶中齐墩果酸的
最佳提取条件。采用正交实验法 ,以超声波处理时
间 、提取时间 、提取温度 、料液比为影响因素 ,以齐墩
果酸得率为指标优选提取工艺 。
齐墩果酸具有强疏水性 ,其片剂的生物利用度
低 。如果将其做成羟丙基 -β-环糊精包合物 ,其理化
特性则明显改变 ,能增加药物的水溶性 ,提高生物利
用度 ,羟丙基 -β-环糊精(HP-β-CD)是一种具有广阔
前景的优良药用载体 ,它不仅水溶性高 (75 g/100
mL),对热稳定 ,且对肾无毒 ,对肌肉和粘膜几乎无
刺激。杨彩琴等 〔4〕人研究了 HP-β-CD对齐墩果酸
的增溶效果 ,实验结果表明 HP-β-CD对齐墩果酸有
较好的增溶作用 ,有应用前景 。本实验研究了 HP-
β-CD包合齐墩果酸的工艺 ,而且用正交实验法对包
合工艺进行了优化。
1 仪器与试药
1.1 仪器 HHS-4S型恒温水浴锅(上海光地仪器
设备有限公司);SK220H超声波清洗器(上海科导
超声仪器有限公司);真空干燥箱(上海实验仪器总
厂);FW177中草药万能粉碎机(天津市泰斯特仪器
有限公司);高效液相色谱仪 LC-10AT泵和 SPD-
10A紫外检测器(日本岛津公司);电子天平(北京
赛多利斯仪器系统有限公司);架盘药物天平(上海
医用激光仪器厂 ,马头牌 JYT-5型);CR21型冷冻离
心机(日本日立公司);RE-52AAB旋转蒸发仪 (上
海嘉鹏科技有限公司);HZ-D型循环水真空泵(巩
义市予华仪器有限责任公司);恒温磁力搅拌器(85-
2型 ,金坛市大地自动化仪器厂)。
1.2 试药 木瓜叶(产地湖北 ,长阳土家族自治县
木瓜园);齐墩果酸对照品(中国药品生物制品检定
所 ,批号:110709-200505);甲醇为色谱纯;水为纯净
水;其它试剂均为分析纯。
2 方法与结果
2.1 木瓜叶中齐墩果酸提取工艺研究
2.1.1 齐墩果酸的提取:由李才国等 〔5〕关于齐墩
果酸提取方法的研究中得知 ,将回流法 、索氏提取法
和冷浸法 3种方法比较 ,回流提取法的效果最好 。
本实验采用回流提取法对木瓜叶中的齐墩果酸进行
提取。将木瓜成叶在 60℃下真空烘干 ,然后用中草
药万能粉碎机粉碎。精确称取木瓜成叶粗粉 50 g,
加入一定量 95%乙醇 ,再用超声波处理一段时间 。
处理完后 ,将木瓜成叶和乙醇一起倒入圆底烧瓶中 ,
在一定温度下 ,回流提取一段时间。
2.1.2 齐墩果酸的分离纯化:将回流提取液置于
旋转蒸发仪中进行浓缩得到浸膏 。将浸膏状物质先
后用水和氯仿洗涤 ,合并洗涤液 ,去水层 。将有机层
用水洗涤 6次 ,去掉水层 ,蒸馏氯仿后得齐墩果酸 。
2.1.3 TCL分析:取齐墩果酸对照品和由上述方
法分离得到的齐墩果酸 ,分别加乙醇溶解配成 1.5
mg/mL的溶液 。取一定量对照品溶液及样品溶液 ,
分别点在自制的硅胶薄层 G板上 ,然后分别以乙酸
乙酯 -石油醚(1∶3)及氯仿 -丙酮 (8∶2)为展开剂展
开。取出挥去溶剂 ,喷 5%磷钼酸乙醇溶液显色后 ,
于 105℃加热至斑点清晰(约 5 min)。结果表明 ,在
两种不同的展开系统下 ,样品与齐墩果酸对照品具
有相同的 Rf值 ,并呈现相同的蓝色斑点。
2.1.4 色谱条件:PhenomenexLunaC18色谱柱
(4.6 mm×150 mm, 5 μm);柱温 30℃;流速 1.0
mL/min;检测波长 215 nm;流动相为甲醇-水-冰醋
酸(88∶12∶0.1)。
2.1.5 对照品溶液的制备:精密称取齐墩果酸对
照品 10 mg, 用少量甲醇溶解 ,再置于 10 mL容量
瓶 ,加甲醇溶解至刻度线 ,制成 1 mg/mL的对照品
溶液 。
2.1.6 线性关系考察:将配制好的对照品溶液准
确吸取 0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL,加甲醇补充至 10
mL,混合均匀 ,得到浓度为 0.02、0.04、0.06、0.08、
0.10 mg/mL的齐墩果酸标准溶液 。每次取 20 μL
进样测定其峰面积 。以齐墩果酸浓度(x)和峰面积
(y)求回归方程。 y=3998987x+23112, r=0.9968,
结果表明齐墩果酸在 0.02 ～ 0.10 mg/mL与峰面积
呈良好的线性关系 。
2.1.7 精密度试验:精密吸取上述对照品溶液 20
μL,连续进样 5次 ,测定峰面积 RSD=1.35%,表明
方法精密度良好。
2.1.8 稳定性试验:取同一供试样品溶液 ,分别于
配制后 0、2、4、6、8、12 h,进样 20 μL,依法测定 ,结
果表明 , 同一供试样品溶液在 12 h内基本稳定 ,
RSD=1.87%。
2.1.9 回收率试验:准确量取 5份已知含量的齐
墩果酸样品溶液各 1 mL,分别加入 0.2 mg的齐墩
果酸标准品 ,按样品制备方法和色谱条件测定 ,计算
平均回收率为 97.92%, RSD=1.56%。
2.1.10 正交实验:经初步实验 ,选择超声波处理
时间(A)、提取时间(B)、提取温度(C)、料液比(D)
为影响因素(不计交互影响),以齐墩果酸得率为评
价指标 ,利用 L9(34)正交表设计正交实验寻找最佳
的提取条件。具体影响因素 、实验水平表及方差分
分析结果见表 1 ～ 3。按照 “2.1.1”项下方法 ,对表 1
·805·JournalofChineseMedicinalMaterials 第 33卷第 5期 2010年 5月
中的各组实验原料进行提取 。然后再用 “ 2.1.2”项
下方法将每组样品进行纯化。得到的齐墩果酸用甲
醇定容到 100 mL。
表 1 齐墩果酸提取工艺因素水平表
水平 超声波处理时间(A)/min 提取时间(B)/min提取温度(C)/℃ 料液比(D)
1 20 40 50 1∶10
2 40 55 60 1∶12
3 60 70 70 1∶14
2.1.11 结果分析:比较表 2中各因素的极差值
(R)的大小 ,可以看出各因素对提取效果影响的主
次顺序为:A>B>D>C,比较表 2中每个因素在 3
个水平下实验指标的平均值 Ⅰj、Ⅱj、Ⅲj的大小顺序
得到水平优势为 A2 >A3 >A1 , B3 >B2 >B1 , C2 >C3
>C1 , D1 >D3 >D2。由方差分析结果知 ,只有 A因
素对齐墩果酸得率有显著性影响。故确定最佳工艺
条件为 A2B3C2D1 ,即超声波处理时间为 40 min,提
取时间为 70 min,提取温度为 60℃,料液比为 1∶10。
表 2 齐墩果酸提取工艺正交实验结果
实验号 A B C D 齐墩果酸得率 /%
1 1 1 1 1 0.31
2 1 2 2 2 0.42
3 1 3 3 3 0.59
4 2 1 2 3 0.65
5 2 2 3 1 1.06
6 2 3 1 2 0.83
7 3 1 3 2 0.32
8 3 2 1 3 0.64
9 3 3 2 1 0.97
Ⅰ j 0.44 0.43 0.59 0.78
Ⅱ j 0.85 0.71 0.68 0.52
Ⅲ j 0.64 0.80 0.66 0.63
R 0.41 0.37 0.09 0.26
表 3 齐墩果酸提取工艺方差分析结果
误差来源 离差平方和 自由度 均方差 F值 显著性
A 0.2481 2 0.1240 20.56 P<0.05
B 0.2234 2 0.1117 18.51
C 0.0121 2 0.0060 1.00
D 0.1001 2 0.0500 8.29
误差 0.0121 2 0.0060 1.00
注:因为 C因素影响较小 , 所以将 C因素作为方差分析中的误
差项来处理 , F0.05(2, 2)=19.00, F0.01(2, 2)=99.00
2.1.12 验证实验:对最佳水平进行验证 ,按所选
的最佳提取工艺条件进行实验 。结果齐墩果酸的得
率为 2.93%,高于正交实验的所有结果 ,证实最佳
工艺可行。
2.2 HP-β-CD包合物制备工艺研究
2.2.1 包合物的制备:称取 HP-β-CD(经 50℃干
燥 1.5 h)5.00 g放入锥形瓶中 ,然后加入 10.00 mL
蒸馏水并加热(30 ℃)溶解。再按表 4中的条件称
取一定量的齐墩果酸 ,并将其溶解在 300 mL乙醇
中。在一定温度下将齐墩果酸的乙醇溶液缓缓加入
HP-β-CD的水溶液中 ,搅拌包合一定的时间 , 静置
(冷藏 24 h),抽滤。在干燥箱内 40℃干燥 1 h,即
得。
2.2.2 包合物的综合评分:产品中齐墩果酸总量
的测定:准确称取约 0.1g产品 ,加水 25 mL形成均
一体系 ,准确移取 10 mL,加入氯仿反复提取至下层
无色 。蒸馏氯仿 ,将得到的齐墩果酸用少量甲醇溶
解 ,再置于 10mL容量瓶中 ,加甲醇至刻度线 。
产品表面齐墩果酸的测定:准确称取约 0.2 g
产品 ,放入离心管中 ,加入 20 mL正己烷 ,剧烈震荡
1min左右 。在 6000 r/min、4℃条件下离心 5 min。
取上清液 ,用氮气吹干 ,然后用少量甲醇溶解 ,再置
于 10 mL容量瓶中 ,加甲醇至刻度线。
包合物中齐墩果酸的量 =产品中齐墩果酸的总量 -产
品表面齐墩果酸的量
包合物收率(%)=包合物质量(g)/[齐墩果酸质量(g)
+HP-β-CD质量(g)] ×100%
齐墩果酸包合率(%)=包合物中齐墩果酸的量(g)[齐
墩果酸投入量(g)×空白回收率 ] ×100%
包合物的综合评分 =包合物收率(%)×30% +齐墩果
酸包合率(%)×70(%)
2.2.3 齐墩果酸回收率的测定:精密量取一定体
积的齐墩果酸溶液 ,加入等摩尔量的 HP-β-CD,用
20 mL氯仿分 3次萃取 ,合并氯仿溶液。蒸馏氯仿 ,
将得到的齐墩果酸用少量甲醇溶解 ,再置于 10 mL
容量瓶 ,加甲醇至刻度线。空白回收率 =实际测得
齐墩果酸的量(g)/齐墩果酸的投入量(g)×100%。
2.2.4 正交实验:经初步试验 ,选定 HP-β-CD和
齐墩果酸的投料比(A)、包合时间 (B)、包合温度
(C)为影响因素(不计交互影响),以包合物收得率
和齐墩果酸包合率的综合评分为指标 ,利用 L9(34)
正交表设计正交试验寻找最佳的提取条件。具体影
响因素 、实验水平及方差分析结果见表 4 ～ 6。
表 4 齐墩果酸 HP-β-CD包合
工艺中各因素水平表
因素水平 HP-β-CD∶齐墩果酸(A)/摩尔比 包合时间(B)/h 包合温度(C)/℃
1 1∶1 1.0 20
2 1∶2 2.0 40
3 1∶3 3.0 60
·806· JournalofChineseMedicinalMaterials 第 33卷第 5期 2010年 5月
表 5 齐墩果酸 HP-β-CD包合工艺的 L9(34)正交试验结果
实验号 实验号A B C D(空白) 收率 /% 包合率 /% 综合评分
1 1 1 1 1 51.62 30.24 40.93
2 1 2 2 2 40.93 49.57 45.25
3 1 3 3 3 57.19 48.23 52.71
4 2 1 2 3 49.76 37.26 43.51
5 2 2 3 1 79.21 51.23 65.22
6 2 3 1 2 77.38 53.26 65.32
7 3 1 3 2 56.96 35.68 46.32
8 3 2 1 3 64.19 42.35 53.27
9 3 3 2 1 79.41 55.23 67.32
Ⅰ j 46.30 43.59 53.17 57.82
Ⅱ j 58.02 54.58 52.03 52.30
Ⅲ j 55.64 61.79 54.75 49.83
R 11.72 18.20 2.72 7.99
表 6 齐墩果酸 HP-β -CD包合工艺的方差分析结果
误差来源 离差平方和 自由度 方差 F值 显著性
A 230.26 2 115.13 20.53 P<0.05
B 503.86 2 251.93 44.92 P<0.05
C 11.22 2 5.61 1.00
误差 11.22 2 5.61 1.00
注:因为 C因素影响较小 , 所以将 C因素作为方差分析中的误
差项来处理 , F0.05(2, 2)=19.0;F0.01(2, 2)=99.00
比较表 5中各因素极差值(R)的大小 ,可以看
出各因素对提取效果影响的主次顺序为:B>A>C。
比较表 5中每个因素在 3个水平下实验指标的平均
值 Ⅰj、Ⅱj、Ⅲj的大小顺序得到水平优势为 A2 >A3
>A1 , B3 >B2 >B1 , C3 >C1 >C2。由方差分析结果
可知 , A、B因素对包合工艺的影响皆有显著性意
义 , C因素无显著性意义 。故确定最佳工艺条件为
A2B3C3 ,即 HP-β-CD和齐墩果酸投料比为 1∶2,包合
时间为 3.0h,包合温度为 60℃。
2.2.5 验证实验:对优选出的最佳工艺 A2B3C3进
行验证 ,结果包合率为 58.58%,收率为 81.02%。
表明最佳包合工艺可行。
2.2.6 薄层色谱验证:准确称取约 0.4 g包合物 ,
加水 100 mL形成均一体系 ,准确移取 50 mL,加入
氯仿反复提取至下层无色。蒸馏氯仿 ,即得到齐墩
果酸 ,用乙醇溶解配成 1.5 mg/mL的溶液。同时取
齐墩果酸对照品 ,也配成 1.5 mg/mL的乙醇溶液 。
取一定量对照品溶液及样品溶液 ,分别点在自制的
硅胶薄层 G板上 , 然后分别以乙酸乙酯-石油醚
(1∶3)及氯仿 -丙酮(8∶2)为展开剂展开。取出挥去
溶剂 ,喷 5%磷钼酸乙醇溶液显色后 ,于 105℃加热
至斑点清晰(约 5 min)。结果表明 ,在两种不同的
展开系统下 ,样品与齐墩果酸对照品具有相同的 Rf
值 ,并呈现相同的蓝色斑点。结果表明包合前后齐
墩果酸未被破坏 ,所以包合物质量较好 ,包合过程对
齐墩果酸成分无影响。
3 小结
3.1 由正交试验优选出齐墩果酸提取工艺条件为
A2B3C2D1 ,即超声波处理时间为 40 min,提取时间
为 70 min,提取温度为 60℃,料液比为 1∶10。由正
交试验优选出齐墩果酸 HP-β-CD包合工艺条件为
A2B3C3 ,即 HP-β-CD和齐墩果酸投料比为 1∶2,包合
时间为 3.0 h,包合温度为 60℃。
3.2 除了乙醇外 ,齐墩果酸还能溶于甲醇 、苯 、乙
醚 、丙酮和氯仿等溶剂 ,但是工业酒精价廉 、安全 、易
得 ,适合工业化生产用 ,故本实验选用 95%乙醇作
为溶剂。
3.3 在提取温度的选择上 ,应该考虑所用溶剂的
沸点 。本实验选择的是乙醇 ,所以所选温度不能超
过乙醇的沸点 ,否则在提取过程中 ,会有大量溶剂挥
发。而且如果沸腾过于剧烈 ,可能导致爆炸。提取
温度也不能选择得太低 ,否则提取效果不好 。
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