全 文 ：第 23 期
在 EMS处理后对悬浮细胞系进行特定的胁迫处理，
有望高效而快速地筛选到理想的突变体材料。
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第 51 卷第 23期
2012年 12月
湖北农业科学
Hubei Agricultural Sciences
Vol． 51 No.23
Dec．，2012
收稿日期：2012－04－05
基金项目：中药新产品开发与产业化（二）子项目（桂科攻 0992003B－32）
作者简介：韦 莹（1980－），女，助理研究员，硕士，主要从事药用植物离体保存研究工作，（电话）0771－5602850（电子信箱）wendy371＠sohu．com；
通讯作者，白隆华（1967－），男，研究员，主要从事药用植物栽培学研究工作，（电话）0771－5601290（电子信箱）Whitefh2008＠126．com。
牛大力离体培养与植株再生条件的优化
韦 莹，马小军，董青松，韦坤华，李 翠，白隆华
（广西壮族自治区药用植物园 ／广西药用资源保护与遗传改良重点实验室，南宁 530023）
摘要：分别以野生牛大力（Milletia speciosa）成熟种子、带芽茎段为材料研究不同激素组合及外植体的离
体培养效果。 结果表明，1 g ／ L HgCl2对牛大力种子和带芽茎段分别消毒 10 min 和 15 min 效果最好；愈伤
组织和不定芽诱导的最佳激素组合为 1．5 mg ／ L 6－BA＋0．5 mg ／ L NAA＋0．3 mg ／ L IBA， 种子和带芽茎段外
植体的最高不定芽诱导率分别为 95．8％和 45．8％； 最适合不定芽分化的激素组合为 2．0 mg ／ L 6－BA ＋0．5
mg ／ L NAA，最高分化率为 58．3％；最佳的生根培养基为 1 ／ 2MS＋1．5 mg ／ L NAA＋1．0 mg ／ L IBA，生根率高达
70．8％；最佳移栽基质为等体积混合的黄土、泥炭和河沙，移栽 90 d 后成活率为 73．3％。
关键词：牛大力（Milletia speciosa）；离体培养；种子；带芽茎段；愈伤组织；移栽
中图分类号：R282．71；S339．4＋1 文献标识码：A 文章编号：0439－8114（2012）23－5499-04
Study on in vitro Culture and Plant Regeneration of Milletia speciosa
WEI Ying，MA Xiao－jun，DONG Qing－song，WEI Kun－hua，LI Cui，BAI Long－hua
（Guangxi Botanical Garden of Medicinal Plant ／ Guangxi Key Laboratory of Medicinal Resources Conservation and Genetic Improvement，
Nanning 530023， China）
Abstract： Using seeds and stems with buds of wild Milletia speciosa as material， the effects of different hormone combination
and explants on the in vitro culture were investigated． The result showed that the optimum treatment time of 1 g ／ L HgCl2 for
seed and stem was 10 and 15 min respectively． The best hormone combination for callus and adventitious buds induction was
1．5 mg ／ L 6－BA＋0．5 mg ／ L NAA＋0．3 mg ／ L IBA， the highest callus induction rate of seeds and adventitious buds of stem with
a bud was 95．8％ and 45．8％， respectively． The best medium for differentiation of adventitious bud was 2．0 mg ／ L 6－BA ＋0．5
mg ／ L NAA； the differentiation rate was 58．3％． And the best rooting medium was 1 ／ 2MS＋1．5 mg ／ L NAA＋1．0 mg ／ L IBA； the
rooting rate was 70．8％． The best matrix was mixture of equivalent volume of loess， peat and river sand， the survival rate of 90
days after transplantation reached 73．3％．
Key words： Milletia speciosa； in vitro culture； seed； stem with buds； callus； transplant
!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!
DOI:10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2012.23.056
湖 北 农 业 科 学 2012 年
牛大力（Radix Millettia Speciosa），又名山莲藕、
金钟根、倒吊金钟等，为蝶形花科植物美丽崖豆藤
（Milletia speciosa Champ．）的干燥根 ［1］，是著名的南
药之一，其味甘、性平，归肺、肾经 ［2］，在海南、两广
地区广泛用作煲汤原料、制作药膳、药酒等［3－7］，临床
研究证明其对腰肌劳损、风湿性关节炎、肺结核、慢
性支气管炎等具有一定疗效［8］。 近年来由于市场需
求剧增，牛大力野生资源经过多年采挖，蕴藏量逐
渐减少，生产及制药原料供应日趋紧张，价格不断
攀升［9］。目前牛大力的人工栽培技术尚不成熟，通过
组织培养技术进行快速繁殖也还停留在初步研究
阶段［10－12］。本实验在前人工作的基础上，以牛大力种
子、带芽茎段为外植体进行愈伤组织及不定芽的诱
导，筛选出最佳的灭菌方法和各个生长阶段的最佳
激素组合，建立牛大力的无性培养技术，为保护和
开发牛大力资源、实现其可持续发展提供参考。
1 材料与方法
1．1 材料
牛大力种子于 2011 年 5 月采自广西隆安，带
芽茎段于 2011 年 5 月采自从海南引种的移栽苗，
取材时间为上午 9∶30～10∶00。
1．2 方法
1．2．1 外植体的消毒 取牛大力成熟种子放入烧
杯中，添加 2 滴洗洁精清洗表面污垢，流水冲洗 8～
10 min 后移至超净工作台，体积分数 75％的乙醇浸
泡 40 s，无菌水冲洗 1 次，再用 1 g ／ L HgCl2消毒 6～
15 min，无菌水冲洗 5次。
选取生长健壮、无病虫害的植株，剪取幼嫩带
芽茎段作为外植体，剪除叶片后放入烧杯中，加适
量自来水及 2～3 滴洗洁精，轻轻摇动，用棉花轻轻
擦洗表面泥土，然后在自来水下冲洗 15 min，体积
分数 75％的乙醇浸泡 30 s，无菌水冲洗 1 次，再用
1 g ／ L HgCl2消毒 10～20 min，无菌水冲洗 5次。
用无菌滤纸吸干种子和茎段外植体表面水分
后用消毒好的镊子夹住，插入培养基中，每瓶接种 3
个外植体，每个处理接种 8 瓶。
1．2．2 不同激素组合对牛大力组织培养的影响 基
本培养基为 MS， 含 5 mg ／ L 琼脂、30 mg ／ L 蔗糖，pH
5．8～6．0。 将消毒好的牛大力种子、带芽茎段接种到
含 0．5 mg ／ L NAA，6 －BA 浓度分别为 1．0、1．5、2．0
mg ／ L 或 0．5 mg ／ L NAA＋1．5 mg ／ L 6－BA，IBA 浓度分
别为 0．1、0．3、0．5 mg ／ L 的培养基上进行愈伤组织和
不定芽的诱导；取种子、带芽茎段诱导后所产生的
不定芽接种到含 0．5 mg ／ L NAA，6－BA 浓度分别为
1．5、2．0、2．5 mg ／ L 的固体分化培养基上进行分化培
养。 将生长健壮、高 2～4 cm的不定芽或者芽丛接种
到分别以 MS 和 1 ／ 2MS 为基本培养基，添加不同浓
度 NAA 和 IBA 的壮苗生根培养基上进行生根培
养。 培养条件均为培养温度（25±2）℃、光照时间 12
h ／ d，光照强度 20～30 μmol ／ （m2·s）。 30 d 后统计出
芽率、污染率、分化率、生根率等指标。
2 结果与分析
2．1 不同外植体的灭菌效果
先用体积分数 75％的乙醇浸泡种子和带芽茎
段， 再用 1 g ／ L HgCl2 对 2 种牛大力外植体材料灭
菌，不同处理时间下的灭菌效果见表 1。 从表 1可以
看出，用 1 g ／ L HgCl2对牛大力种子进行灭菌后种子
均能出芽，而且出芽率较高。 消毒时间为 10 min 时
出芽率最高， 为 91．7％， 而且其污染率也最低，为
8．3％，所有种子均未产生愈伤组织和出现褐化。 而
茎段消毒后出芽率相对较低，1 g ／ L HgCl2消毒时间
为 15 min 时其出芽率最高，为 41．7％。 此时愈伤组
织诱导率也最高 ， 为 54．2％； 而污染率较低 ，为
4．2％，且褐化率为 0。
2．2 不同激素组合对牛大力愈伤组织和不定芽诱
导的影响
外植体在添加 0．5 mg ／ L NAA 和不同浓度 6－BA
的培养基中进行培养，诱导率和出芽率结果见表 2。
在激素组合 1．5 mg ／ L 6－BA＋0．5 mg ／ L NAA 的培养
基中，种子培养 5 d 后开始出芽，芽嫩绿、粗大（图
1），而茎段出芽时间较晚，培养 15 d 后才开始冒出
嫩绿的小芽，且芽相对细弱（图 2），大部分茎段在诱
导培养 10～20 d 后逐渐形成愈伤组织（图 3）。从表 2
可看出，牛大力的种子和带芽茎段在含不同浓度激
素组合的培养基中的愈伤组织及不定芽诱导率不
同，与仅添加 6－BA 和 NAA 的处理相比，附加 IBA
后愈伤组织和不定芽诱导率均得到明显提高，1．5
mg ／ L 6－BA＋0．5 mg ／ L NAA ＋0．3 mg ／ L IBA 处理中两
种外植体的不定芽诱导率均为最高， 分别为 95．8％
和 45．8％， 带芽茎段的愈伤组织诱导率也高于其他
表 1 1 g/L HgCl2消毒时间对牛大力外植体灭菌效果的影响
外植体
种子
带芽茎段
消毒时间
min
6
10
15
10
15
20
出芽率
%
75.0
91.7
79.2
29.2
41.7
33.3
愈伤组织诱导率
%
0
0
0
37.5
54.2
37.5
污染率
%
25.0
8.3
20.8
25.0
4.2
8.3
褐化率
%
0
0
0
8.3
0
20.8
5500
第 23 期
处理。
2．3 不同激素组合对牛大力不定芽分化的影响
在添加不同浓度激素的分化培养基中培养，不
定芽的分化情况见表 3和图 4、图 5。 由表 3可以看
出， 不添加激素的培养基中不定芽分化率均较低，
且没有芽丛生出。 添加不同浓度的激素后，不定芽
的分化率提高，添加 2．0 mg ／ L 6－BA ＋0．5 mg ／ L NAA
的培养基中分化率最高，达 58．3％，但芽丛分化率还
是较低，仅为 20．8％。
2．4 不同培养基及激素浓度对试管苗生根的影响
将生长健壮、高 2～4 cm的不定芽或者芽丛接种
到壮苗生根培养基上培养 15 d 后根开始发生，叶片
也逐渐增多，培养 30 d 后观察统计生根率和试管苗
长势，结果见表 4。 从表 4 可以看出，1 ／ 2MS 培养基
比 MS 培养基更利于牛大力的生根，生根率升高，试
管苗的长势增强。 相比而言，添加适当浓度的 NAA
和 IBA 组合比单独使用 NAA 生根效果好， 生根率
较高。 最佳壮苗生根培养基为 1 ／ 2 MS＋1．5 mg ／ L
NAA＋1．0 mg ／ L IBA，生根率可达 70．8％，植株较为健
壮、根粗、根系发达。
2．5 牛大力试管苗的炼苗移栽
试管苗生根培养 25～30 d 后选择生长健壮、无
污染的试管苗进行炼苗。 打开培养瓶的盖子，并注
入少量水淹没培养基，于室内自然光下炼苗 7 d，用
表 2 不同激素组合对牛大力不定芽和愈伤组织诱导的影响
外植体
种子
带芽茎段
6-BA
1.0
1.5
2.0
1.5
1.5
1.5
1.0
1.5
2.0
1.5
1.5
1.5
NAA
0.5
0.5
0.5
0.5
0.5
0.5
0.5
0.5
0.5
0.5
0.5
0.5
IBA
0
0
0
0.1
0.3
0.5
0
0
0
0.1
0.3
0.5
外植体
个数
24
24
24
24
24
24
24
24
24
24
24
24
出芽率
%
62.5
75.0
66.7
79.2
95.8
75.0
16.7
29.2
25.0
33.3
45.8
41.7
愈伤组织诱导率
%
0
0
0
0
0
0
41.7
54.2
37.5
50.0
62.5
54.2
激素浓度//mg/L
图 4 种子出芽及分化
图 5 不定芽分化
表 3 不同激素组合对牛大力不定芽分化的影响
6-BA 浓度
mg/L
0
1.5
2.0
2.5
NAA 浓度
mg/L
0
0.5
0.5
0.5
接种数
24
24
24
24
分化数
2
11
14
10
分化率
%
8.3
45.8
58.3
41.7
芽丛诱导率
%
0
12.5
20.8
8.3
图 1 种子诱导出不定芽
图 2 茎段诱导出不定芽
图 3 茎段诱导产生愈伤组织
韦 莹等：牛大力离体培养与植株再生条件的优化 5501
湖 北 农 业 科 学 2012 年
镊子小心取出试管苗，洗净试管苗根部培养基（图
6），移栽到不同的基质中。 基质以疏松透气、排水良
好、不易发霉为宜。 移栽 30、60、90 d 后分别统计各
基质中的成活率见表 5。 因试管苗一直处于保温保
湿、遮阴的环境下，各处理表现出的成活率均较高，
30 d最高成活率能达到 93．3％；而 60 d 和 90 d 时成
活率有较大差别：以单一的泥炭、河沙、黄土为基质
的处理中移栽成活率逐渐下降，3 种处理间的移栽
成活率差异不大，黄土、泥炭和河沙按等体积混合
作为基质，90 d 时成活率为 73．3％，移栽效果相对较
好，为最佳的移栽基质组合。 同时，移栽后每周需喷
施 1～2次 10倍稀释的 MS 大量元素营养液，并及时
遮阳， 根据需要适当喷施 1 g ／ L 的叶面肥等其他肥
料，视基质的干湿度喷水。
3 小结与讨论
本研究分别采用牛大力种子和带芽茎段进行
不定芽及愈伤组织诱导，发现种子和带芽茎段都能
诱导出芽。 相对而言，种子诱导效果较好，不仅诱导
率高， 而且诱导出的不定芽和试管苗比较粗壮，但
种子材料储藏时间不能超过半年，陈年种子诱导容
易污染，很难成功诱导出芽。
带芽茎段也较易诱导出愈伤组织和不定芽，但
一般产生愈伤组织的茎段很难能诱导出不定芽，在
培养 1 个月后观察， 愈伤组织出芽率不超过 10％。
观察还发现，茎段离体过程中污染率较高，在试管
苗继代培养时茎段接触培养基部位容易产生细菌，
这可能和牛大力本身的分泌物及表面被有绒毛等
有关。 此外，茎段诱导产生的愈伤组织和不定芽较
易褐化，而实验中一旦出现褐化或污染就很难再改
善苗的质量。 本研究采取了无菌苗重复消毒、添加
适当浓度头孢唑林钠、暗培养等不同方法 ［11］，在一
定程度上降低了褐化和污染率，但并没取得本质性
的改善，还有待进一步研究。
目前关于牛大力离体培养及移栽研究的报道
不多 ［9－12］，本研究在之前报道的基础上进行了种子
与带芽茎段组织培养及植株再生实验，并筛选出适
宜的激素浓度组合和移栽基质，初步建立了牛大力
的无性系，可为进一步探讨其离体快繁、提高繁殖
系数提供参考。
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图 6 种子诱导成苗
表 4 不同培养基及激素浓度对试管苗生根的影响
培养基
MS
1/2MS
1/2MS
1/2MS
1/2MS
1/2MS
1/2MS
NAA
0.5
0.5
1.5
2.0
1.5
1.5
1.5
IBA
0
0
0
0
0.5
1.0
1.5
接种
苗数
24
24
24
24
24
24
24
生根
株数
7
12
15
13
14
17
15
生根率
%
29.2
50.0
62.5
54.2
58.3
70.8
62.5
试管苗长势
根细、株细弱
根稍粗、株壮
株壮，根粗、叶嫩绿
株壮、根短
根一般、株壮
株壮、根粗、叶浓绿
根粗、短
激素浓度//mg/L
表 5 不同基质对试管苗移栽成活率的影响
基质
泥炭
河沙
黄土
等体积泥炭与黄土
等体积黄土、泥炭与河沙
30 d
86.7
73.3
80.0
86.7
93.3
60 d
60.0
60.0
66.7
66.7
80.0
成活率//%
移栽苗数
15
15
15
15
15
90 d
53.3
46.7
53.3
60.0
73.3
（责任编辑 向 闱）
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