全 文 ：第 8卷 第 3期
2 0 1 0年 9月
生 物 信 息 学
ChinaJournalofBioinformatics
Vol.8 No.3
Sep., 2010
蛇白蔹白藜芦醇合酶基因 CNRS2的克隆与原核表达
梁乃国 1, 2 ,崔杰1＊ ,李滨胜3 ,吴永英 1
(1.哈尔滨工业大学食品科学与工程学院 ,哈尔滨 150090;2.哈尔滨工业大学生命科学与工程系 ,哈尔滨 150001;
3.黑龙江省森林植物园 ,哈尔滨 150040)
摘要:白藜芦醇合酶(resveratrolsyntheticenzyme, RS)是植物白藜芦醇合成途径中的关键酶 , 利用已知的葡萄 RS基因
(AF274281)序列设计并合成了一对引物 , 以蛇白蔹基因组 DNA为模板 , PCR扩增得到包含 RS完整基因在内的一段序列 , 测
序与序列分析表明:该克隆片段全长 1 536bp,其中包含一个内含子及两个外显子。采用悬挂延伸 PCR法克隆了目的基因 , 命
名为 CNRS2。序列分析表明该基因的开放读码框 1 170 bp,编码 389个氨基酸残基。同源性比较发现 , CNRS2与已知葡萄 RS
基因序列的同源性达 93% ～ 98%。 CNRS2与 pET-30a(+)构建原核表达载体 , 经 IPTG诱导后可表达获得相对分子量约为
46 kD的外源融合蛋白。以上结果证实 CNRS2属葡萄 RS基因家族成员 , 为今后进一步对该基因的研究利用打下基础。
关键词:蛇白蔹;白藜芦醇合酶基因;克隆与序列分析;原核表达
中图分类号:Q946　　文献标识码:A　　文章编号:1672-5565(2010)-03-279-04
收稿日期:2010 -06-23;修回日期:2010-07-20.
基金项目:黑龙江省自然科学基金资助项目(C200904)。
作者简介:梁乃国 ,硕士研究生 ,研究方向:植物基因工程。
＊通讯作者:崔杰 ,硕士研究生导师 ,研究方向:植物基因工程。 E-mail:cuijie@hit.edu.cn.
CloninganditsexpressioninprokaryoteofRSgeneCNRS2
AmpelopsisJaponica(Thunb.)Makino
LIANGNai-guo1, 2 , CUIJie1＊ , LIBin-sheng3 , WUYong-ying1
(1.FoodScienceandEngineeringColege, HarbinInstituteofTechnology, Harbin150090, China;
2 DepartmentofBioscienceandTechnology, HarbinInstituteofTechnology, Harbin150001 , China;
3 ForestBotanicalGardenHeilongjiang, Harbin150040 , China)
Abstract:Resveratrolsyntheticenzyme(RS)isakeyenzymeinresveratrolsynthesispathwayofplant.Touncoverandcharacterizethe
functionoftheRSinplantdevelopmentalprocess, weisolatedaRSgenebyPCRusingtotalDNAofAmpelopsisJaponica(Thunb.)
Makino.Thesequenceanalysisresultsindicatedthatthelengthofthedeterminednucleotidesequencewas1 536 bp, compriseintron
andtwoexon.ThecDNAofRSgeneCNRS2 wasclonedbyoverhan-gextensionPCR, TheresultsshowedthattheCNRS2hada1 170
bpopenreadingframeencoding389 aminoacidpolypeptide, andexhibitinghighsimilaritieswithothermembersofRSgenesfamily.
TherecombinantCNRS2proteinproductwiththemolecularweightabout46kDcouldalsobedetectedinE.coliproteinexpressionsys-
tem.TheseresultsindicatedthattheCNRS2wasamemberofRSfamily.
KeyWords:AmpelopsisJaponica(Thunb.)Makino;RSgene;cloneandProkaryoticexpressionsystem
　　白藜芦醇(Resveratrol,简称 Res)是一种植物
抗毒素 ,具有广谱抗菌 [ 1] 、抗氧化 、抗肿瘤 [ 2] 、抗血
小板凝聚 、保护心血管 、调节雌激素 [ 3] 、提高机体免
疫力等多种功效;在植物保护方面作为一种植保素 ,
存在于葡萄 、桑树 、花生 、买麻藤 、虎杖 、朝鲜槐等 12
科 31属的 72种植物中 ,具有抗病菌的作用 [ 4] 。但
是 , Res在植物体内的含量非常低 。有关研究表明
影响 Res含量的主要因素是白藜芦醇合成酶(Res-
veratrolsynthase简称 RS)的含量 , RS是 Res合成途
径中的关键酶 ,它催化 4-香豆酰辅酶 A和丙二酰辅
酶 A生成 Res。国内外关于 RS基因的克隆及其基
因转化研究非常活跃 ,已在烟草 、番茄 、苜蓿 、小麦 、
大麦 、水稻等植物中获得表达 。
本研究根据 NCBI上登录号为 AF274281的葡
萄 RS基因序列设计引物 ,以蛇葡萄属的蛇白蔹为
材料 ,以其总 DNA为模板 ,通过悬挂延伸 PCR法克
隆得到全长的 RS基因 ,命名为 CNRS2, 并进行测
序 、序列分析与原核表达 ,这些工作为该基因的进一
步利用奠定了基础 。
1　材料和方法
1.1　材料
植物材料蛇白蔹叶片取自黑龙江省森林植物
生　 物　 信　 息　学 第 8卷
园 ,菌株 DH5α、质粒 pET-30a(+)本实验室保存 ,
有关的限制性内切酶 、PMD18-T试剂盒 、高保真 Taq
酶 、PCR产物纯化试剂盒 、质粒提取试剂盒均购自
大连宝生物技术工程有限公司;引物合成与 DNA测
序由上海生工生物工程技术服务有限公司完成 。
1.2　方法
1.2.1　DNA提取
蛇白蔹(Ampelopsisjaponica(Thunb.)Makino)叶
片总 DNA的提取利用改进的 CTAB法 [ 5] 。
1.2.2　基因扩增与测序
根据已知的葡萄 RS基因序列(Genbank登录号
AF274281)设计 引 物 , P1:5 -ccgtcgacatggct-
tcagtcgaggaattaga-3 , P4:5 -ggagctcgctaattgtaac-
cataggaatgc-3 ;以蛇白蔹基因组 DNA为模板进行
PCR扩增 ,将扩增片段经纯化与 PMD18 -T连接 ,
转化大肠杆菌 DH5α,筛选重组子 PMDCLRS1,进行
酶切鉴定与测序。根据测序结果设计引物 P2:5-
gctctgatcatgattgtcacatatgcgatgaactctc-3, P3:5-
gtgacaaatcaatgatcaagaagcg-3,克隆两个外显子序列 ,
再以其为模板 ,利用引物 P1、P4,采用悬挂延伸 PCR
法 ,克隆 CNRS2基因 ,同样构建克隆载体 、筛选重组
子 PMDCNRS2,酶切鉴定并测序 。
1.2.3　CNRS2基因原核表达载体的构建及表达
用 SacI和 SalI酶切 PMDCNRS2和 pET-30a
(+), 经回收 , 将 CNRS2片段与线性 pET-30a
(+)连接 ,构建原核表达载体 ,转化 、抗性筛选重组
子 pET-30a-CNRS2,酶切鉴定是否正确。将鉴定
正确的 pET-30a-CNRS2转化到 BL21 (DE3)中 ,
并将菌液以 1:100比例稀释于预温的选择性 LB培
养液中培养至 OD值约为 0.6后 ,加入 IPTG(浓度
为 0.7mmol/L)诱导培养 ,设置不同时间 (1、2、4、6
和 8 h)进行诱导 。菌体经等量还原性 2×SDS样品
缓冲液裂解 ,经 12%的 SDS-PAGE电泳 、染色及脱
色后在凝胶成像仪上对电泳结果进行照相 。
2　结果和分析
2.1　CNRS2基因的克隆 、测序与序列分析
2.1.1　CLRS1基因的克隆 、测序与序列分析
以提取的蛇白蔹叶片总 DNA为模板 ,用引物
P1P4和高保真 Taq酶进行 PCR扩增 , 电泳结果表
明:PCR产物为一条约 1.5 kb的特异性条带(图
1),与预期大小一致 ,命名为 CLRS1。该产物回收与
pMD18-T载体连接 ,经转化 、筛选 、提取阳性克隆
质粒 DNA,用 SalI、SacI酶切鉴定 ,结果载体构建正
确 ,命名为 pMDCLRS1。经测序 ,得到该片段的全序
列(图 2)。
M:DNAMakerDL2000;1～ 4:CLRS1基因的扩增带
图 1　蛇白蔹 CLRS1基因 PCR产物电泳图
Fig.1 ElectrophoresisofPCR-amplificationfragmentCLRS1
genefromAmpelopsis
图 2　CLRS1基因核苷酸序列及推测的氨基酸序列
Fig.2 TheDNAnucleotideanddeducedaminoacidsequence
ofCLRS1 genes
280
第 3期 梁乃国 ,等:蛇白蔹白藜芦醇合酶基因 CNRS2的克隆与原核表达
　　序列分析表明:所克隆片段全长 1536 bp,在这
段序列中包含两个外显子(48 ～ 225, 570 ～ 1 560)和
一个内含子(226 ～ 569)序列。
2.1.2　CNRS2基因的克隆 、测序与序列分析
利用引物 P1P2、P3P4分别克隆两个外显子 ,结
果与预计大小一致(图 3),再以其为模板 ,利用引物
P1P4进行扩增 ,得到大小约为 1.2kb的条带(图 3),
与预计大小一致 ,命名为 CNRS2。回收 1.2kb条带与
pMD18-T载体连接 ,转化 、筛选 ,阳性克隆质粒 DNA
用 SalI、SacI酶切鉴定 ,结果载体构建正确 ,命名为
pMDCNRS2。经测序 ,克隆片段包含 1 183个核苷酸
(其中 3′和 5′分别含限制性酶切位点及保护碱基),
具有起始密码子和终止密码子 , 为一个完整的阅读
框架 ,编码 389个氨基酸 , 。所克隆的 CNRS2基因核
酸序列比对表明 ,与已报道的花生(DQ124938.1)、葡
萄 RS基因(FJ770470.1、AF274281.1)的核苷酸序列
的同源性分别为 76%、93%和 98%。
M:DNAMakerDL2000;上图 1～ 6, 7～ 9:外显子扩增条带 ,
下图 1 ～ 4:完整基因扩增条带
图 3　CNRS2基因两个外显子及完整基因的 PCR产物电泳图
Fig.3 ElectrophoresisofPCR-amplificationfragmentCNRS2
geneandtwoexonfromAmpelopsis
2.2　CNRS2基因原核表达载体的构建及表达
从 pMDCNRS2上用 SalI、SacI切下 CNRS2基
因片段 ,定向插入经相同酶切的原核表达载体 pET
-30a(+)中 ,经转化 、筛选获得阳性克隆 pET-30a
-CNRS2(图 4),酶切鉴定正确(图 5),说明原核表
达载体构建成功 。
　　经测序证明目的基因 CNRS2的阅读框与原核
表达载体上的阅读框正确融合。将原核表达载体
pET-30a-CNRS2导入大肠杆菌 BL21(DE3)感受
态细胞 ,经抗性筛选 、IPTG诱导表达 、SDS-PAGE
电泳 ,结果在分子量约 50 kD位置上看到明显的诱
导条带(图 6),该条带大小与外源基因编码蛋白大
图 4　原核表达载体 pET-30a-CNRS2图谱
Fig.4 MapofplasmidpET-30a-CNRS1
M:DNAMakerDL2000;1:SalI/SacI双酶切
图 5　质粒 pET-30a-CNRS2酶切鉴定图谱
Fig.5 IdentificationofplasmidpET30a-CNRS2 byenzymedigestion
小的理论值相符 ,表明外源基因可表达并获得诱导
产物 。图中还显示 ,随诱导时间的延长 , CNRS2蛋
白的表达量逐渐提高 ,在诱导 4h后 ,丰度达到最高 。
M:标准蛋白分子量;1, 2:依次是 pET-30a-CNRS2诱导 4h、 2h;
3, 4:负对照 , 依次是含空载体 pET-30a(+)和
不含载体的 BL21菌株诱导 4 h
图 6　外源融合蛋白在不同诱导时间的表达情况
Fig.6 Expressionoffusionproteinunderdiferentculturetime
3　讨论
Res对机体的种种功效使得对其的研究成为目
前热点问题 ,由于不同来源的 RS基因结构存在一
定的差异 ,当然其合成 Res的能力也不同 ,因此 ,关
于 RS基因的研究也十分活跃 。 1990年 Lanz等克
隆到 4个花生 RS基因 [ 6] ,近年来 ,有更多的 RS基
因在虎杖 、葡萄 、花生等种子植物中被分离并克
隆[ 7, 8] ,并且已在烟草 、番茄 、苜蓿 、小麦 、大麦 、水稻
等植物中获得表达 ,但是表达活性不高 ,获得高表达
(下转至第 285页)
281
第 3期 詹少华 ,等:Excel平台的 EST-SSR分析方法
的总重复次数 ,可以在 D2单元格中输入 “ =SUMIF
(A:A, C3, B:B)”,拖动复制 D2单元格的公式 ,可
以计算出其他重复基元在在 SSR中的总重复次数。
7　计算基元在 SSR中最大或最小重复次数
表 3所示 ,在 E2单元格中输入 “ =MAX(IF(＄A
＄2:＄A＄11 =C2, ＄B＄2:＄B＄11))”,可以统计出
“at”基元在 SSR中最大重复次数 ,该函数公式是
MAX和 IF的组合使用 , ＄A＄2:＄A＄11重复记录
的核心基元所在的单元格 , ＄B＄2:＄B＄11表示统
计数值所在的单元格 , ＄A＄2:＄A＄11 =C2是统计
的条件。同样在 F2中输入公式 “ =MIN(IF(＄A＄2:
＄A＄11 =C2, ＄B＄2:＄B＄11))”,可以统计出 “at”
基元在 SSR中最小重复次数。拖动复制公式 ,计算其
他基元的参数。注意该公式执行需要同时按下 ctrl+
shift+enter键。
8　截取核苷酸序列中的特定片段
MID函数从文本字符串中的指定位置起返回特
定个数的字符 ,其语法为:MID(text, start num, num
chars), Text是包含要提取字符的文本字符串 ,可以
直接输入含有目标文字的单元格名称 , Start num是
文本中要提取的第一个字符的位置。文本中第一个
字符的 start num为 1,以此类推 。Num chars指定
希望 MID从文本中返回字符的个数 。
为了分析重复基元两端序列的保守性 ,采用序
列比对软件时如果序列的长度不一致会影响分析结
果 ,假如 “at”在序列中重复 5次 ,截取序列至两端各
20个碱基 ,共 50个碱基 ,又假如该核苷酸序列保存
在 A1单元格 , 在任一单元格中输入公式 “ =MID
(A1, (FIND(ATATATATAT, A1)-20), 50)” ,按
下回车键确定就可以达到目的 。该公式中先利用
FIND函数找出ATATATATAT所在的位置 ,然后
采用 MID函数截取需要的序列 。
9　结论
MicrosoftExcel是常用的办公软件 ,其函数和宏
功能十分强大 ,使用好这些函数和宏功能 ,使生物信
息学分析工作更加方便 、灵活 、减少手工统计和不需
要额外付费等优点 。现在分析 DNA和蛋白质序列
的软件虽然较多 ,但是尚不能完全满足我们的需要 ,
例如现有的软件都不能完成 SSR重复基元合并归
类 ,以前这些工作都是依靠科学工作者的手工完成 ,
工作量巨大且容易犯错 ,而 Excel则可以轻松完成;
利用现有的 DNA和蛋白质序列分析软件 ,只能按照
预先设计好的功能进行分析 ,研究者新的分析方法
则不能通过这些软件完成 , Excel则可以帮助我们在
研究方法方面实现创新。
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(上接第 281页)
活性的 RS基因以及建立 RS基因的高效表达系统
是目前急需解决的问题 ,目前还没有人建立过 RS
基因的植物叶绿体表达系统 ,本研究试图建立一个
这样的植物叶绿体表达系统 ,用来大量生产高丰度
的 Res。目前 ,本实验正在进行这方面研究 ,已建立
表达载体 ,准备转化植物。
不同来源的 RS基因在结构上存在一定的差异 ,组
织表达模式也有所差别 ,导致各基因在植物中可能具
有不同的生理功能[ 9] 。有报道指出 ,花生 RS基因在
根 、茎 、叶等部位均有表达;而诱导表达模式分析显示 ,
花生 RS基因表达可受紫外线 、伤害等因素诱导[ 10] 。
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