全 文 ：农杆菌介导白藜芦醇合酶基因转化蔓茎堇菜的研究
代容春 ,林荣华 ,何文锦 ,马正武 ,陈由强(福建师范大学生命科学学院 ,福建 福州 350108)
摘要:目的:通过农杆菌介导法将白藜芦醇合酶基因转化蔓茎堇菜 ,并对转化条件进行优化。 方法:以蔓茎堇菜叶柄为受体
材料 ,采用叶盘法进行遗传转化 , 实验过程中对影响转化的一些主要因素进行筛选研究。结果:最佳的侵染条件为 OD600 0.3 的
菌液侵染 10min , 头孢霉素的适宜浓度为 250mg L。转化后的蔓茎堇菜外植体经 3.0mg/L潮霉素筛选 , 最终得到 9 株抗性再生苗 ,
转化频率为 0.98%。结论:该研究为建立一个农杆菌介导白藜芦醇合酶基因转化蔓茎堇菜的遗传体系提供了基础。
关键词:蔓茎堇菜;遗传转化;农杆菌介导;白藜芦醇合酶基因
中图分类号:Q943.2　　文献标识码:A　　文章编号:1004-311X(2009)04-0016-02
Studies on Resveratrol Synthase Gene Transformation for Viola diffusa Ging.
Mediated by Agrobacterium Tumefaciens
DAI Rong-chun , LIN Rong-hua , HE Wen-jin , MA Zheng-wu , CHEN You-qiang
(College of Life Sciences , Fujian Normal University , Fuzhou 350108 , China)
Abstract:Objective:The optimization of the conditions on resveratrol synthase gene transformation for Viola diffusa Ging.mediated by Agrobac-
terium tumefaciens was discussed.Method:The leafstalk segments of Viola diffusa Ging.were used as experiment material by leaf disc method ,
studying some major factors on the transformation of resveratrol synthase gene by Agrobacterium tumefaciens.Result:The best adaptive condition
was that bacterium concentration was OD600 0.3 , infected time was 10 min and concentration of cef was 250 mg L.After gene transformation the
explants of Viola diffusa Ging.were placed on medium with 3.0 mg L hygromycin for selection.Finally 9 anti-hygromycin transgenic seedlings
were obtained and the transformation efficiency was 0.98%.Conclusion:The result would be the basis for the establishment of resveratrol syn-
thase gene transformation system of Viola diffusa Ging.mediated by Agrobacterium tumefaciens.
Key words:Viola diffusa Ging.;genetic transformation;Agrobacterium mediated;resveratrol synthase gene
收稿日期:2009-04-14;修回日期:2009-04-23
基金项目:福建省教育厅资助项目(JB07064)资助
作者简介:代容春(1973-),女 ,福建仙游人 , 副教授 ,硕士 ,从事植物
生理学和植物细胞工程研究。
　　白藜芦醇(3 , 5 , 4 , -trihydroxystilbene , Resveratrol)是植物重
要的植保素 ,并具有多方面有益于人类健康的药理活性 , 如抗
肿瘤作用[ 1] 、心脑血管疾病防治作用[ 2] 等。白藜芦醇在植物
体内由白藜芦醇合酶(Resveratrol Synthase , RS)催化合成 , 绝大
多数植物含有该酶的作用底物 ,却缺少酶基因。蔓茎堇菜(Vi-
ola diffusa Ging.)为堇菜科 ,堇菜属植物[ 3] 。化学成分主要为黄
酮 、糖类 、粘液质 , 全草可入药 , 主治肝炎 、风热咳嗽 、痢疾
等[ 4] 。蔓茎堇菜植株再生技术与悬浮细胞培养技术已较成
熟[ 5] 。本文通过农杆菌介导法将白藜芦醇合酶基因导入蔓茎
堇菜植株 ,以期提高蔓茎堇菜的抗病性 , 并为培育出生产黄酮
与白藜芦醇的植物生物反应器提供参考 , 为开发治疗心血管
疾病 、癌症 、保肝的新药打下基础。
1　材料与方法
1.1　材料
1.1.1　实验材料
蔓茎堇菜(Viola diffusa Ging.)无菌植株 , 由福建师范大学
生命科学学院细胞工程实验室提供。
根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)LBA4404 菌系 , 所含
植物表达质粒 pB6RS 上构建有花生白藜芦醇合酶基因及抗性
选择标记潮霉素磷酸转移酶基因 , 由农业部甘蔗生理生态与
遗传改良重点开放实验室提供。
1.1.2　试剂
潮霉素溶液为 Sigma公司产品 , 浓度为 50mg ml。头孢霉
素购自上海生物工程公司。
玉米素(ZT)、6-苄基腺嘌呤(6-BA)、吲哚丁酸(IBA)2 , 4
-二氯苯氧乙酸(2 , 4-D)为上海化学试剂公司产品。
1.1.3　培养基
预培养基:MS+1.0mg L 6-BA+1.0mg L 2 , 4-D;
共培养基:MS+2.0mg L ZT+0.5mg L IBA;
恢复培养基:MS+2.0mg L ZT+0.5mg L IBA+250mg L头
孢霉素;
筛选培养基:MS+2.0mg L ZT+0.5mg L IBA+3.0mg L潮
霉素。
1.2　方法
1.2.1　潮霉素选择压的确定
将无菌的蔓茎堇菜叶柄剪成约 0.8cm 小段 , 在预培养基
上进行暗培养。 10d 后 ,将外植体转移到潮霉素浓度分别为 0、
1.0 、2.0、3.0、4.0、5.0 、6.0 、7.0 、8.0mg L 的培养基 MS +
2.0mg L ZT+0.5mg L IBA上 , 筛选适宜的潮霉素浓度。
1.2.2　蔓茎堇菜遗传转化
采用 Horsch 的叶盘法[6] 。实验过程中对 5 个浓度的菌液
(OD600为 0.1、0.2、0.3、0.4 、0.5)进行农杆菌浓度筛选 , 并试验
不同侵染时间(5min、10min和 15min)对蔓茎堇菜外植体抗性愈
伤诱导的影响。恢复培养过程中对头孢霉素的浓度(200mg L、
250mg L和 300mg L)进行筛选 。
2　结果与分析
2.1　潮霉素筛选压的确定
将蔓茎堇菜叶柄接种在含不同浓度潮霉素的培养基上 ,
45d 后观察 ,发现低于 3.0mg L的潮霉素浓度不足以抑制蔓茎
堇菜叶柄不定芽的分化;高于 3.0mg L的潮霉素浓度不仅能抑
制芽的分化 , 也抑制愈伤组织的发生;当潮霉素浓度为 3.0mg
L时仍有少数外植体上发生少量愈伤组织 , 但生长迟滞 , 逐渐
黄化 ,未见不定芽的分化。 因此 , 选择浓度 3.0mg L作为蔓茎
堇菜叶柄的最适潮霉素筛选压。
2.2　菌液浓度和侵染时间对蔓茎堇菜转化的影响
对农杆菌菌液进行浓度筛选 , 结果表明 , 菌液浓度低 , 浸
泡所需时间长且抗性愈伤的诱导率低;菌液浓度高 , 则叶柄外
植体容易被农杆菌杀死。 因此 , 选择中等浓度即 OD600为 0.3
作为菌液的适宜浓度。
侵染时间对蔓茎堇菜外植体抗性愈伤诱导率影响较大。
由表 1 可知 ,菌液 OD600为 0.3 , 当浸泡时间为 5min 时 , 进入外
植体的菌较少 , 农杆菌毒害作用和成功转染频率也相对较少 ,
故其抗性愈伤的诱导率较低;当浸泡时间为 10min 时 , 进入外
植体的菌增多 , 成功转染频率和农杆菌毒害作用也相对增高 ,
但农杆菌的毒害作用不足以杀死外植体 , 其抗性愈伤的诱导
率较高;当浸泡时间为 15min 时 ,农杆菌毒害作用明显增高 , 可
以直接杀死外植体 , 其抗性愈伤的诱导率较低。
2.3　头孢霉素浓度对外植体生长的影响
不同浓度的头孢霉素对蔓茎堇菜叶柄外植体有较大的影
响。当头孢霉素浓度为 200mg L 时 , 外植体先有较多愈伤发
16　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　生　物　技　术　　　　　　　　　　　　　　　　　2009年 19(4)
DOI :10.16519/j.cnki.1004-311x.2009.04.010
生 ,随后外植体伤口处出现白色的小菌落 , 菌落逐渐变大进而
抑制外植体的生长和分化或直接杀死外植体 , 外植体黄化率
逐渐升高;当头孢霉素浓度为 250mg L时 , 有较多外植体上发
生愈伤组织 ,外植体伤口处也逐渐出现小菌落 ,使得部分外植
体黄化并死亡 ,但仍有一部分愈伤组织存活下来;当头孢霉素
浓度为 300mg L时 ,只有少数外植体伤口处出现小菌落 , 但未
见愈伤组织或不定芽发生 , 此时头孢霉素的毒害作用明显显
露 ,外植体很快黄化并死亡(见表 2)。因此 , 头孢霉素对于蔓
茎堇菜外植体的最适浓度为 250mg L ,筛选培养时以 15d 内更
换新鲜培养基为宜。
表 1　农杆菌(OD600 =0.3)不同侵染时间对蔓茎堇菜转化的影响
Tab.1　Effect of infection of Agrobacterium tumefaciens(OD600=0.3)with dif-
ferent time on callus induction of Viola diffusa Ging.
处理 浸泡时间(min) 外植体数(个) 抗性愈伤诱导率(%)
1 5 40 20.0
2 10 40 25.0
3 15 40 17.5
注:培养 30 d观察到的结果。
表 2　头孢霉素浓度对蔓茎堇菜外植体生长的影响
Tab.2　Effect of different concentration of Cef on growth of explants of Viola
diffusa Ging.
头孢霉素
浓度(mg L)
黄化率(%)
第 3d 第 6d 第 9d 第 12d第 15d 第18d 第 21d 第 24d第 27d 第30d
200 1.7 3.2 8.6 18.1 39.4 72.2 93.6 99.4 100 100
250 1.2 2.6 4.3 5.7 12.7 24.5 41.9 67.6 72.2 77.2
300 6.3 10.6 21.9 44.2 68.8 87.4 98.7 100 100 100
2.4　农杆菌介导蔓茎堇菜的遗传转化
将预培养 10d的蔓茎堇菜外植体 , 经农杆菌侵染 10min 后
接种于共培养基上 , 暗培养 2d 后转移到添加 250mg L 头孢霉
素的恢复培养基上培养 3 ～ 4d ,再将外植体转移到含 3.0mg/ L
潮霉素的筛选培养基上 , 诱导不定芽 , 每 14d 转入相同培养基
继续筛选。 20d 左右 , 外植体即有大量抗性愈伤组织的发生。
而未经农杆菌转染或转染不成功的外植体逐渐黄化死亡。 大
部分抗性愈伤继代过程中逐渐变得疏松 , 失去继代和分化能
力 , 小部分愈伤组织分化出不定芽(见图 1)。
图 1　经农杆菌转化蔓茎堇菜得到的抗性愈伤及抗性芽
1.抗性愈伤组织(转化后 30d);2.抗性芽产生(转化后 45d);3.较大的抗性芽(转化后 60d)。
Fig.1　Anti-hygromycin callus and shoots of Viola diffusa Ging.mediated by Agrobacterium tumefaciens
1.Anti-hygromycin cal lus(after 30 days);2.Anti-hygromycin shoots(after 45 days);3.big anti-hygromycin shoots(after 60 days).
　　用 916个蔓茎堇菜外植体进行农杆菌遗传转化 ,两个月内
获得228个抗性愈伤 , 9个抗性芽 , 愈伤的发生率为 24.9%, 抗
性芽分化率为 0.98%。抗性芽经诱导生根 , 均长成株型正常 、
健康的植株 ,转基因植株的进一步筛选研究正在进行中。
3　讨论
根癌农杆菌介导的植物基因转化受到多种因素的综合影
响[ 7 , 8] 。在农杆菌转化外植体的过程中要努力做到三点:提高
农杆菌入侵植物外植体的速度 、入侵后农杆菌的及时清除 、减
少损害植物外植体。本文对农杆菌菌液浓度与侵染时间以及
除菌剂头孢霉素浓度进行了筛选 , 结果表明 , 对数生长期农杆
菌菌液稀释成 OD600为 0.3 浸泡 10min 是转化的合适条件 , 头
孢霉素的合适浓度为 250mg L , 在 3.0mg/ L潮霉素选择压下 ,
蔓茎堇菜抗性愈伤的发生率为 24.9%, 不定芽的分化率为
0.98%。为进一步提高转化效率 , 还需对影响转化的其它因素
如浸染温度[ 9]等进行分析研究 ,找出最优转化方法。
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Bacillus pumilus XJU-13的分离鉴定及其碱性脂肪酶酶学特性分析
王宁 ,孙磊 ,邓爱华 ,马相汝 ,古丽斯玛依·艾拜都拉 ,艾尔肯·热合曼＊(新疆大学生命科学与技术学院 , 新疆 乌鲁木齐 830046)
摘要:目的:对从新疆精河地区一处工业污水中分离得到的一株产碱性脂肪酶细菌进行研究。方法:通过生理生化检测 , 16S
rDNA序列同源性分析和G+Cmol%含量的测定对命名为 XJU-13的这株菌进行鉴定。结果:该菌株可在 pH 3.0～ 12.5的广泛酸
碱泛围的营养肉汤培养基中生长。最适生长温度为 37℃。基于 16S rDNA序列同源性构建系统进化树分析表明与 Bacillus pumilus
clone B257 聚在同一亚分枝 ,序列相似性达 100%。数据证明 XJU-13 属于 Bacillus pumilus。由于在氧化酶反应及淀粉水解实验
与伯杰氏鉴定手册有差异 , 具不可比拟的pH 耐受性 ,且脂肪酸含量与参考菌株差异较大 ,认为这是 Bacillus pumilus中的一个新品
系。该菌株产生的脂肪酶最适 pH为 10 ,最适温度为 35℃,且在广泛 pH(pH4～ 10)范围具稳定性。酶活可被 Mg2+ 、K+、Ba2+ 、Pb+
盐强烈抑制 , 被 Ca2+、Cu2+、Al+及 Fe2+盐激活。 Zn2+对酶活无影响。 结论:实验表明 , XJU-13 应属于 B.pumilus。 B .pumilus
XJU-13中分离到的碱性脂肪酶有很好的特性及潜能 ,以期为工业应用提供数据。
关键词:Bacillus pumilus;G+C含量;16S rDNA;进化分析;碱性脂肪酶
中图分类号:Q93-331　　文献标识码:A　　文章编号:1004-311X(2009)04-0017-06
172009 年 19(4)　　　　　　　　　　　　　　　　　生　物　技　术