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〔2013-05-27 修回〕
(编辑 赵慧玲 /曹梦园)
三叶青水提物对慢性阻塞性肺疾病大鼠炎症的抑制作用
王小莉 吕江明 (吉首大学医学院，湖南 吉首 416000)
〔摘 要〕 目的 探讨三叶青水提物对慢性阻塞性肺疾病(COPD)实验性大鼠炎症的影响。方法 选择烟熏加气管内注射脂多糖(LPS)法复
制 COPD模型，将健康 SD雄性大鼠 60 只，随机分为 5 组:正常对照组，COPD模型组和三叶青低剂量、中剂量、高剂量组(分别为 0. 5、1. 0、2. 0 g /kg) ，
每组 12 只。造模成功后肺组织 HE染色观察气道病理改变，测定血清和肺组织中 C-反应蛋白(CRP)、白细胞介素(IL)-6 的水平，取支气管肺泡灌洗
液(BALF)测定炎症细胞数和白细胞比率。结果 三叶青各剂量组 CRP、IL-6 水平及炎症细胞总数及白细胞比例较模型组明显减少(P ＜ 0. 05) ，高、
中、低剂量组炎症细胞总数和中性粒细胞比例显著下降，并呈一定的剂量效应关系(P ＜ 0. 05)。与正常对照组比较，模型组和各治疗组中 CRP、IL-6
水平及炎症细胞总数和中性粒细胞比例显著升高(P ＜ 0. 05)。结论 三叶青水提物能够抑制 COPD大鼠的炎症反应。
〔关键词〕 三叶青水提物;白细胞介素(IL)-6;C-反应蛋白;慢性阻塞性肺疾病
〔中图分类号〕 R361 〔文献标识码〕 A 〔文章编号〕 1005-9202(2015)05-1333-03;doi:10. 3969 / j. issn. 1005-9202. 2015. 05. 085
基金项目:湖南省科技计划项目(No． 2014SK3010)
第一作者:王小莉(1978-) ，女，副教授，硕士，主要从事呼吸系统疾病
研究。
三叶青属于葡萄科属植物，具有清热解毒、祛风化痰、活血
止痛的功效，临床用来治疗小儿惊厥高热、肺炎、支气管炎、咽
喉炎、痢疾、肝炎、病毒性脑膜炎、肿瘤等症〔1〕。三叶青对于炎
症的研究较少。本研究用三叶青水提物对慢性阻塞性肺疾病
(COPD)大鼠模型进行干预，通过观察大鼠肺组织病理改变，检
测血清及肺组织中 C-反应蛋白(CRP)、白细胞介素 6(IL-6)的
水平，检测支气管肺泡灌洗液(BALF)中炎症细胞及分类，探讨
三叶青对炎症的影响及其机制。
1 材料和方法
1. 1 实验动物 健康 SD 雄性大鼠购买于湖南长沙市开福区
东创实验动物科技服务部，动物编号 HNACSDC20120292，体重
(272 ± 28)g，鼠龄 12 w。
1. 2 分组 将 60 只大鼠随机分为 5 组:正常对照组、模型组
和三叶青低、中、高剂量组，每组 12 只。
1. 3 三叶青水提物的提取 三叶青由吕江明老师在湖南吉首
市郊采集，由我院中药学李春艳教授鉴定。将三叶青全株 500
g干燥、粉碎，过筛，水煎 3 次，每次 30 min，合并水煎液，浓缩为
1 g /ml(生药) ，得到三叶青水提物。
1. 4 COPD模型制作 采用 2 次气管内注入 LPS(LPS)和反复
烟熏的方法制作 COPD大鼠模型〔2〕。第 1、14 天各向气管内缓
慢注入脂多糖 200 μg (200 μl) ，将大鼠放入的有机玻璃制成的
烟熏箱内，在其右上角开通 1 个直径 1 cm的通气孔，将点燃的
香烟(长沙卷烟厂白沙牌香烟)通过三通将烟雾吸入 100 ml 的
注射器中，关闭吸烟通路一端，再打开三通的另一端将烟雾注
入烟熏箱内进行大鼠被动吸烟，每天吸烟 2 次，每次 16 支，时
间 30 min，2 次间隔 4 h，连续 28 d。吸烟 8 d 后每天吸烟前通
过灌胃器给大鼠灌三叶青水提物(低剂量组、中剂量组、高剂量
组为 0. 5、1. 0、2. 0 g /kg，加生理盐水至 2 ml) ，共 28 d。正常对
照组灌入等容量的生理盐水，28 d后处死大鼠用于实验观察。
1. 5 肺组织病理学标本制作 各组于实验结束后次日取每只
大鼠右中叶肺组织，用 4%甲醛固定 24 h 后石蜡包埋制成切
片，HE染色光学显微镜下观察。
1. 6 匀浆肺组织 取 500 mg肺组织，加入生理盐水 1. 0 ml，组
织匀浆器充分研磨，5 000 r /min离心 10 min，取上清 0. 1 ml，加
生理盐水至 1. 0 ml，充分混匀，5 000 r /min离心 10 min，取上清
液待测。
1. 7 血清采集 从大鼠心脏取血约 5 ml，3 500 r /min，离心半
径 20 cm，10 min，取血清 － 20℃保存。
·3331·王小莉等 三叶青水提物对慢性阻塞性肺疾病大鼠炎症的抑制作用 第 5 期
1. 8 BALF的采集 将大鼠右主支气管结扎，用套管针穿刺至
左肺，缓慢注入无菌生理盐水 3 ml，重复 3 次，每次注入后立即
回吸，灌洗液纱布过滤，回收率大于 80%，得到 BALF 合格标
本。用于白细胞总数计数和细胞分类计数。
1. 9 CRP、IL-6 水平的测定 利用 H6000-020 全自动生化分析
仪，严格按照说明书进行检测，大鼠 CRP试剂盒、IL-6 试剂盒购
买于湖北武汉博士德生物有限公司。
1. 10 统计学方法 采用 SPSS13. 0 软件进行 t检验。
2 结 果
2. 1 各组大鼠病理改变 正常对照组大鼠支气管黏膜纤毛柱
状上皮排列整齐，气道、管壁及周围炎症细胞浸润;模型组的大
鼠支气管黏膜上皮变性、脱落，管壁伴有淋巴细胞浸润，肺泡囊
和肺泡扩张明显，肺泡壁变薄伴有不同程度的断裂，形成肺大
疱。三叶青低剂量、中剂量及高剂量组大鼠黏膜上皮改变、炎
性细胞浸润以及肺泡腔扩大、肺泡壁断裂情况较模型组有不同
程度的减轻，较正常对照组重。见图 1。
模型组 对照组 三叶青低剂量组 三叶青中剂量组 三叶青高剂量组
图 1 各组大鼠病理改变(HE，×100)
2. 2 实验大鼠血清及肺组织匀浆中 CRP、IL-6 的测定 与正
常对照组比较，模型组血清及肺组织中的 CRP、IL-6 明显增多
(P ＜ 0. 01)。与模型组比较，三叶青高、中、低剂量组血清及肺
组织中的 CRP、IL-6 均减少(P ＜ 0. 05)。三叶青低、中剂量组间
血清及肺组织中的 CRP、IL-6 水平无明显差异(P ＞ 0. 05) ，三叶
青高剂量组与低剂量组差异显著(P ＜ 0. 05)。见表 1。
2. 3 支气管肺泡灌洗液中细胞计数及分类 与正常对照组比
较，模型组中 BALF炎症细胞总数和白细胞比例增加，差异有统
计学意义(P ＜ 0. 01)。高、中、低各剂量治疗组炎症细胞总数和
白细胞比例较模型组减少，并呈一定的剂量效应关系，差异具
有统计学意义(P ＜ 0. 05) ，治疗组中性粒细胞计数高于正常对
照组(P ＜ 0. 05)。见表 1。
表 1 各组大鼠血清、肺组织匀浆中 CRP、IL-6 活性、BALF细胞总数、白细胞分类比较(x ± s，n =12)
组别
CRP(μg /ml) IL-6(pg / ml)
血清 肺组织 血清 肺组织
白细胞总数
(× 108 /L)
中性粒细胞
(%)
单核细胞
(%)
淋巴细胞
(%)
正常对照组 0. 4327 ± 0. 023 0. 6378 ± 0. 023 17. 98 ± 2. 12 40. 23 ± 0. 13 1. 78 ± 0. 81 3. 48 ± 0. 53 84. 38 ± 8. 13 12. 91 ± 6. 89
COPD模型组 1. 238 ± 0. 0171) 1. 638 0 ± 0. 0251) 60. 23 ± 3. 181) 101. 22 ± 0. 231) 5. 88 ± 0. 491) 21. 98 ± 4. 991) 70. 03 ± 6. 12 7. 86 ± 3. 28
低剂量治疗组 0. 9253 ± 0. 0122)0. 9025 ± 0. 0322) 40. 82 ± 2. 092) 70. 94 ± 0. 152) 4. 28 ± 0. 452) 15. 28 ± 3. 152) 77. 27 ± 5. 13 7. 23 ± 2. 28
中剂量治疗组 0. 843 8 ± 0. 0342)0. 825 6 ± 0. 0202) 34. 28 ± 3. 322) 55. 83 ± 0. 222) 3. 23 ± 0. 231)2)14. 38 ± 2. 781)2)79. 29 ± 4. 89 6. 53 ± 1. 98
高剂量治疗组 0. 5500 ± 0. 0182)3)0. 4416 ± 0. 0062)3)30. 89 ± 2. 142)3) 50. 78 ± 0. 142)3) 2. 13 ± 0. 382)3)10. 23 ± 2. 082)3)80. 23 ± 4. 32 6. 98 ± 3. 21
与正常对照组比较:1)P ＜ 0. 01，与模型组比较:2)P ＜ 0. 05，与三叶青低剂量组比较:3)P ＜ 0. 05
3 讨 论
吸烟可刺激单核巨噬细胞和中性粒细胞等炎症细胞产生
前炎症因子、趋化因子及细胞因子，如 TNF、细胞间黏附分子
(ICAM-1)、IL-6、IL-8 等，导致白细胞黏附、移行到炎症部位参
与炎症反应〔3〕。LPS为革兰阴性菌的外层结构可直接造成气道
上皮损伤，又可激活巨噬细胞、淋巴细胞，生成前致炎因子肿瘤
坏死因子(TNF)、IL-1、IL-6 等，趋化并激活中性粒细胞，释放蛋
白酶等细胞毒性物质，导致支气管慢性炎症及肺气肿形成〔2〕。
本实验通过熏烟加气管内注射 LPS 法建立 COPD 大鼠模型，光
学显微镜下观察到 COPD模型组大鼠肺泡壁、支气管壁、肺泡间
隔可见大量炎症细胞浸润，黏膜下层、肌层、血管周围大量炎症
细胞浸润，肺泡壁变薄断裂，肺泡结构不完整，肺大疱形成，符
合 COPD病理改变。采用两次气管内注入适量 LPS 和反复熏
烟的方法，可成功地复制出大鼠 COPD 模型。本研究结果说明
三叶青可以减轻 COPD 肺组织炎症病理改变，对 COPD 炎症有
一定的防治作用。
近年研究表明，COPD气道炎症是以淋巴细胞、肺泡巨噬细
胞和中性粒细胞浸润为主，这些被激活的炎症细胞可释放许多
炎性介质及细胞因子，参与气道炎症的进展，而 IL-6、IL-8 是参
与 COPD 气道炎症的重要细胞因子〔4，5〕。本实验结果说明
COPD气道及肺组织中的炎症细胞以中性粒细胞和巨噬细胞为
主，与曹丽华等〔6〕研究结果相符。本研究结果提示 IL-6 参与了
COPD的炎症反应，是介导 COPD炎症重要的细胞因子，三叶青
提取物可以降低 IL-6 的含量，对炎症有一定的抑制作用。
CRP是一种对多种刺激因素包括感染、组织损伤、坏死都
能迅速发生反应的蛋白，常可作为一种反应炎症、组织损伤程
度以及评价治疗反应的非特异性敏感指标〔7〕。本实验说明
CRP在 COPD具有较高的表达，CRP参与了 COPD的炎症反应，
是反映病情的重要生物学标志。三叶青通过减低 CRP 的表达
对大鼠 COPD的炎症有一定的抑制作用，并且呈现出一定的浓
度依赖性。
·4331· 中国老年学杂志 2015 年 3 月第 35 卷
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〔2013-12-07 修回〕
(编辑 赵慧玲 /曹梦园)
表皮生长因子受体抑制剂吉非替尼对食管癌 EC9706 细胞增殖、凋亡及
细胞周期的影响
白 玉 刘尚国1 姚文健1 赵宝生1 (新乡医学院病理教研室，河南 新乡 453003)
〔摘 要〕 目的 探讨表皮生长因子受体(EGFR)抑制剂吉非替尼对食管癌 EC9706 细胞增殖、凋亡和细胞周期的影响。方法 将 EC9706 细
胞培养并加入不同浓度的吉非替尼处理不同时间后，采用 MTT法检测细胞增殖抑制率;AnnexinV-FITC /PI双染法、流式细胞仪检测细胞凋亡率。PI
染色、流式细胞仪检测细胞周期。结果 吉非替尼对食管癌 EC9706 细胞增殖具有明显的抑制作用，且表现为剂量和时间依赖性;吉非替尼组细胞凋
亡率明显高于正常对照组，且随着吉非替尼剂量的增加，凋亡率逐渐增加(P ＜ 0. 05) ;与对照组相比，10 μg /ml吉非替尼处理 24 h后的 EC9706 细胞，
处于 G0 /G1 期细胞比例明显增加，处于 S期细胞比例明显减少(P ＜ 0. 05)。结论 吉非替尼对食管癌 EC9706 细胞具有明显的增殖抑制作用，其机
制与诱导凋亡及阻滞细胞周期有关。
〔关键词〕 吉非替尼;食管癌;增殖;凋亡
〔中图分类号〕 R735. 1 〔文献标识码〕 A 〔文章编号〕 1005-9202(2015)05-1335-02;doi:10. 3969 / j. issn. 1005-9202. 2015. 05. 086
基金项目:河南省卫生厅资助课题(200803081)
1 新乡医学院第一附属医院胸外科
通讯作者:赵宝生(1966-) ，男，主任医师，教授，硕士，主要从事食管癌
研究。
第一作者:白 玉(1981-) ，女，讲师，硕士，主要从事肿瘤分子病理研究。
分子靶向药物因其靶点明确、特异性强等优点，正引起人
们的广泛关注，是目前肿瘤治疗的研究热点。目前分子靶向药
物的研究主要集中在表皮生长因子受体(EGFR)上。EGFR为
一种相对分子质量为 170 000 kD的酪氨酸蛋白激酶受体，在多
种恶性肿瘤均存在过表达，其中食管癌 EGFR 的表达率高达
40% ～70%〔1〕。目前开发的作用于 EGFR 的药物有 2 种，一种
是靶向 EGFR胞外域的单克隆抗体，如 EGFR 阻断剂西妥昔单
抗;一种是靶向受体催化域的 EGFR 酪氨酸激酶，如酪氨酸激
酶抑制剂吉非替尼。已有研究显示，吉非替尼对多种恶性肿瘤
如肺腺癌细胞〔2〕、乳腺癌细胞〔3〕及肝癌细胞〔4〕等都有显著抑
制作用，但关于治疗食管癌的研究报道还较少。因此，本实验
拟在细胞水平上研究吉非替尼对食管癌 EC9706 细胞增殖、凋
亡和细胞周期的影响。
1 材料与方法
1. 1 试剂与仪器 吉非替尼(商品名:易瑞沙)为阿斯利康公
司产品。食管癌 EC9706 细胞购自中国科学院上海细胞研究所
细胞库。四甲基偶氮唑盐(MTT)、二甲基亚砜(DMSO)、碘化
丙啶(PI)染液购自美国 Sigma 公司;RPMI-1640 培养液购自美
国 Gibco公司;AnnexinV-FITC /PI 细胞凋亡检测试剂盒购自南
京凯基生物科技发展有限公司;DNM-9602A 酶标分析仪(北京
普朗新技术有限公司) ;流式细胞仪及分析软件(美国 BD 公
司) ;其他常用试剂及仪器由新乡医学院病理学实验室提供。
1. 2 实验方法
1. 2. 1 细胞培养 食管癌 EC9706 细胞用含 10%胎牛血清及
100 U /ml青霉素、100 μg /ml链霉素双抗的 RPMI-1640 培养液，
在 37℃、5%CO2、湿度 85%的细胞培养箱中培养，每 2 ～ 3 天更
换培养液并传代 1 次。取对数生长期细胞用于实验。
1. 2. 2 检测细胞增殖抑制率 用 MTT 法检测吉非替尼对
EC9706 细胞增殖的抑制作用。吉非替尼用 DMSO 配置为
20 mg /ml的母液，置于 － 20℃的冰箱中保存。用时常温解冻
后，用 RPMI-1640 稀释至所需浓度(DMSO 的最终浓度不超过
0. 1%)。取对数生长期的 EC9706 细胞，调整细胞浓度为 5 ×
105 /ml，每孔 200 μl加入 96 孔板，置于培养箱中培养。24 h后
加入浓度分别为 10、20、40、80 μg /ml的吉非替尼。同时设置调
零组和对照组:分别加入等量完全培养液和含 EC9706 细胞的
培养液。每组设 5 个复孔，分别孵育 12、24 和 48 h 后，加入
5 mg /ml的 MTT溶液 20 μl继续培养 4 h。终止培养，小心吸去
孔内培养液，加入 150 μl DMSO，低速振荡 10 min，在酶联免疫
检测仪 OD490 nm 处测量各孔的吸光值。以上实验重复 3 次。
计算细胞抑制率，抑制率 = (1 － 加药组 OD490 值 /对照组
OD490 值)× 100%。
1. 2. 3 细胞凋亡检测 培养收集浓度为 10、20、40、80 μg /ml
的吉非替尼处理 48 h 后的 EC9706 细胞。对照组设为不加药
·5331·白 玉等 表皮生长因子受体抑制剂吉非替尼对食管癌 EC9706 细胞增殖、凋亡及细胞周期的影响 第 5 期