全 文 ：HPLC法测定三叶青中槲皮素、山奈酚的含量*
浦锦宝 梁卫青 郑军献 胡轶娟 魏克民
( 浙江省中医药研究院·杭州 310007)
摘 要 目的:建立三叶青中槲皮素、山奈酚含量的测定方法。方法: 利用高效液相色谱法对三叶青中槲
皮素、山奈酚进行测定，色谱柱 YMC ODS柱( 250 × 4. 6mm，5μm) ，柱温: 30℃，以甲醇 － 0. 2%磷酸( 50∶
50) 为流动相，流速 1. 0ml /min，检测波长为 360nm。结果:槲皮素的线性回归方程为: Y =1. 8932 × 104X －
1. 5964 × 105 ( r = 0. 9998) ，在进样量 30. 5 ～ 244μg 范闱内线性关系良好;山奈酚的线性回归方程为: Y =
1. 883 × 104X － 1. 7570 × 105 ( r = 0. 9995) ，在进样量 27. 7 ～ 221. 6μg 范围内线性关系良好。槲皮素、山奈
酚的加样回收率分别为 100. 58%、99. 35%，RSD分别为 2. 17%、1. 43%。结论:所建立的方法简便可行、
重复性好，可用于三叶青药材中槲皮素、山奈酚的含量测定，并评价药材的质量优劣。
主题词 三叶青 /分析 槲皮素 /分离和提纯 山奈酚 /分离和提纯
* 浙江省科技厅资助项目 No． 2006R20005
三叶青为葡萄科崖爬藤属植物三叶崖爬藤( Tetrastigma
hemsleyanum Diels et Gilg) 的块根。原植物分布于我国浙江、
江西、福建、台湾、湖北、广东、广西、四川、贵州、云南等省区，
块根或全草入药，具有清热解毒、祛风化痰、活血止痛功效，
用于治疗高热惊厥、肺炎、哮喘、风湿、月经不调、咽痛等症，
具有很好的疗效［1］。药理实验表明三叶青提取物有抗病毒
作用和明显的消炎镇痛及保肝作用。三叶青的化学成分研
究目前尚少，李瑛琦［2］等从三叶青块根中提取分离得到化
合物中有 β －谷甾醇、山奈酚、槲皮素、山奈酚 － 3 － O －新橙
皮糖苷。而对三叶青中化学成分山奈酚、槲皮素含量的测
定［3］目前尚未有报道。本实验采用高效液相色谱法对三叶
青中的山奈酚、槲皮素进行了含量测定。
1 实验材料
1. 1 仪器 Varian prostar 高效液相色谱仪( 包括 230 三元
泵、410 自动进样器、330 二极管阵列检测器) ; 工作站为 star
6. 0; KQ3200 型超声波清洗器: 昆山超声波仪器厂; SZF －
06A加热回流提取器:上海新嘉电子有限公司。
1. 2 试剂与样品 槲皮素( 批号: 100081 － 200406) 、山奈酚
( 批号: 110861 － 200303) :均购于中国药品生物制品检定所;
三叶青采于浙江磐安、常山、建德、昌化等地，经浙江中医药
大学陈锡林副教授鉴定为三叶青药材。水为重蒸水，甲醇为
色谱纯，其余试剂均为分析纯。
2 实验结果
2. 1 供试品溶液的制备 取干燥的三叶青药材，经粉碎后
过四号筛，取 2. 5g样品，精密称定，用 25ml甲醇( 内含 2%盐
酸) 加热回流提取 2 次，每次 1. 5 小时，合并过滤的甲醇定容
至 50ml容量瓶中，进样分析前样品溶液用 0. 45μm 滤膜过
滤，即得供分析用的样品溶液
2. 2 混合对照品溶液的配制 精密称取对照品槲皮素
3. 05mg，山奈酚 2. 77mg，分别置于 10ml容量瓶中，用甲醇溶
解并定容，摇匀，各吸取 5ml 置 10ml 容量瓶中，混匀得混合
对照品溶液，备用。
2. 3 色谱条件 色谱柱 YMC ODS柱( 250 × 4. 6mm，5μm) ，
柱温: 30℃，以甲醇 － 0. 2%磷酸 ( 50: 50 ) 为流动相; 流速:
1. 0ml /min;检测波长为 360nm，槲皮素、山奈酚的理论塔板
数均大于 10000，分离度均大于 1. 5。在此色谱条件下，所得
图谱见图 1 ～ 2。
图 1 对照品 HPLC图谱
图 2 供试品 HPLC图谱
3 实验结果
3. 1 线性关系考察 分别精密吸取混合对照品溶液 2、4、
8、12、16、20μl，测定槲皮素、山奈酚峰面积，以峰面积为纵坐
标，槲皮素、山奈酚进样量为横坐标绘制标准曲线，得回归方
程如下。槲皮素: Y = 1. 8932 × 104X － 1. 5964 × 105 ( r =
0. 9998) ，线性范围: 30. 5 ～ 244μg /ml; 山奈酚: Y = 1. 883 ×
104X － 1. 7570 × 105 ( r = 0. 9995 ) ，线性范围: 27. 7 ～
221. 6μg /ml。
3. 2 精密度试验 分别精密吸取同一浓度的对照品混合溶
·431· 中国中医药科技 2011 年 3 月第 18 卷第 2 期 Mar. 2011 Vol. 18 No. 2
液，连续进样 5 次，槲皮素 RSD 为 0. 67%，山奈酚 RSD 为
0. 68%，表明仪器的精密度良好，
3. 3 稳定性试验 将样品试液在室温下贮存，于 0、2、4、8、
12、24 小时分别按上述色谱条件测定，测得槲皮素的峰面积
RSD为 0. 94%，山奈酚的峰面积 RSD为 0. 82%，结果表明样
品溶液在 24 小时内较稳定，
3. 4 重复性试验 称取同一批号样品 5 份，精密称定后按
供试品溶液制备方法提取后进样，测定含量，结果槲皮素
RSD为 2. 26%，山奈酚 RSD为 2. 10%。
3. 5 加样回收率试验 称取已知含量( 槲皮素: 0. 1067mg /
g，山奈酚: 0. 1632mg /g) 的同一批三叶青药材 1. 20g，精密称
定，分别加入对照品混合溶液 2. 0、2. 5、3. 0ml ( 槲皮素:
0. 680mg /ml、山奈酚: 0. 911mg /ml) ，按供试品溶液制备项下
操作，平行操作 6 份，按上述色谱条件测定含量，计算回收
率。结果见表 1。
表 1 加样回收率试验
槲皮素 山萘酚
样品中
含量
加入量 测得量 回收率
平均回
收率( % )
RSD
( % )
样品中
含量
加入量 测得量 回收率
平均回
收率( % )
RSD
( % )
28． 36 136. 00 261. 85 98. 16 196． 32 182． 20 379． 28 100． 42
129. 30 136. 00 266. 65 100. 99 197. 79 182. 20 379. 64 99. 81
127. 36 136. 00 260. 15 97. 64 194. 69 182． 20 376. 45 99. 76
129. 60 170. 00 306. 16 103. 86 198. 29 227. 75 427. 72 100． 74
127． 19 170． 00 302． 67 103． 22 100. 58 2. 17 194. 53 227. 75 424. 78 101. 10 99. 35 1. 43
128. 15 170. 00 300. 61 101. 45 196. 00 227. 75 421. 65 99. 08
127. 72 204. 00 334. 86 101. 54 195. 35 273. 30 465. 56 98. 87
128. 36 204. 00 330. 29 98. 99 196. 66 273. 30 461. 50 96. 91
128. 75 204. 00 331. 56 99． 42 196. 82 273. 30 463. 25 97. 49
以上试验表明，槲皮素的平均回收率为 100. 58%，RSD
为 2. 17%，山奈酚的平均回收率为 99. 35%，RSD为 1. 43%
3. 6 样品含量测定
取不同产地及批号的样品，精密称定，按供试品制备项
下的方法制备，按本法测定其槲皮素、山奈酚含量。结果见
表 2。
结果表明: 以槲皮素为指标，建德野生的三叶青药材中
含量相对较高，天台野生的三叶青药材中含量其次，市场采
购和建德家种的三叶青药材槲皮素含量较低。以山奈酚为
指标，天台野生的三叶青药材中含量相对较高，建德野生的
三叶青药材中含量其次，市场采购和建德家种的三叶青药材
含量较低。
表 2 样品含量测定结果( n = 3)
序号 产地 槲皮素 山奈酚 备注
1 建德 0． 1619 0． 2260 野生
2 磐安 0. 0809 0. 1193 市购
3 天台 0. 1570 0. 2322 野生
4 兰溪 0． 1024 0. 1507 野生
5 建德 0. 0877 0. 1373 家种
6 常山 0. 1131 0. 2026 野生
7 磐安 0. 1029 0. 1557 市购
4 讨论
本实验采用二极管阵列检测器对槲皮素、山奈酚进行全
波长扫描，对不同波长的吸收值进行了比较，结果在约
360nm处，其吸收值达到最大，故以 360nm作为检测波长。
本实验采用甲醇 － 0. 2%磷酸体系来分离，考察甲醇 －
0. 2%磷酸 52: 48、50: 50、48: 52，最后确立了以甲醇 － 0. 2%
磷酸( 50: 50) 为流动相分离度最好，确定流速为 1. 0ml /min。
在样品制备过程中，以超声与加热回流提取作对比，结
果以后者提取效果较好，另考察了提取时问，结果以每次
1. 5 小时为最佳，最后考察了提取溶剂，以不同浓度的酸性
甲醇加热回流提取，结果以加甲醇( 含 2%盐酸) 提取溶剂为
最佳。从不同产地样品测定结果分析，野生的三叶青药材槲
皮素和山奈酚含量明显较家种的要高，同时市场采购的三叶
青药材中槲皮素和山奈酚含量也较低。所以，在野生药材家
中驯化的过程中必须严格把握药材的质量。本文建立了高
效液相同时检测三叶青中槲皮素和山奈酚的方法，简便快
速，容易掌握，对三叶青药材的质量控制起到了一定的作用。
参考文献
［1］ China pharmaceutical university． Collettion words of Chinese mate-
rial medcia． Beijing: China Medico － Pharmacological Science and
Tecchnology Publishing House，1996: 49．
［2］ 李瑛琦，陆文超，于治国． 三叶青的化学成分研究． 中草药，
2003，11( 34) : 982．
［3］ 黄云祥，王锦军，张秀梅．高效液相色谱法同时测定金樱子中
槲皮素、山奈酚、芹菜素的含量． 现代中医药研究与实践，
2009，23( 1) : 32． ( 收稿: 2009 － 12 － 14

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分离胸腺和脾脏，称重，计算脏体系数。结果见表 3。
表 3 各组小鼠胸腺、脾脏脏体系数比较( x ± s，n = 10)
组别 剂量( g /kg) 胸腺系数( % ) 脾脏系数( % )
正常组 — 0. 3565 ± 0. 1101 0. 4914 ± 0. 3088
模型组 — 0. 3084 ± 0. 0699## 0. 3565 ± 0. 0705#
降糖灵组 0. 090 0. 3067 ± 0. 0733* 0. 3753 ± 0. 0787
糖脉康组 2. 0 0. 3155 ± 0. 0958* 0. 4906 ± 0. 1246＊＊
低剂量组 4. 1 0. 3228 ± 0. 1147* 0. 4420 ± 0. 1568*
中剂量组 8. 3 0. 3123 ± 0. 0822* 0. 7290 ± 0. 4055＊＊
高剂量组 16. 6 0. 3402 ± 0. 1388＊＊ 0. 4283 ± 0. 1120*
4 结论 本研究表明，丹蛭降糖胶囊能够降低实验性糖尿
病小鼠空腹血糖水平，表明丹蛭降糖胶囊可能减弱四氧嘧啶
对胰岛 β细胞的损伤或改善受损伤的 β 细胞的功能。同时
丹蛭降糖胶囊能改善实验性糖尿病小鼠的体重降低，增强小
鼠耐力，对糖尿病小鼠免疫器官胸腺和脾脏脏体系数也有升
高作用。具有益气养阴、活血化瘀作用的中药丹蛭降糖胶囊
可有效地治疗糖尿病。
参考文献
［1］ 王北婴，李仪奎．中药新药研制开发技术与方法．上海: 上海科
学技术出版社，2001: 595．
( 收稿: 2010 － 03 － 07)
·531·中国中医药科技 2011 年 3 月第 18 卷第 2 期 Mar. 2011 Vol. 18 No. 2